趙 悅，孫慶揚，楊 寬，朱怡凡，毛如志，邵建輝，何霞紅*

（云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)生物多樣性應用技術國家工程研究中心，云南 昆明 650201）

在葡萄酒釀造過程中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在將葡萄汁中的糖轉化為乙醇、二氧化碳以及其他風味物質的過程中具有重要作用。然而，參與這一過程的除釀酒酵母之外還有非釀酒酵母（non-Saccharomyces），即存在于葡萄園土壤、葡萄表皮和釀酒過程中，參與葡萄酒釀造，對葡萄酒風味具有重要影響，除釀酒酵母以外其他的酵母[1]。

早期的研究認為，非釀酒酵母可能會代謝產(chǎn)生不良風味物質（硫化氫、醋酸和揮發(fā)性酚等）和造成酒體渾濁，為防止其對葡萄酒的釀造帶來不利影響，通常在釀酒過程中會對其加以抑制[2]。但隨著對非釀酒酵母研究的深入，發(fā)現(xiàn)這種認識并不全面，因為與釀酒酵母相比，一些非釀酒酵母具有明顯的優(yōu)勢，如富產(chǎn)酯[3]、富產(chǎn)甘油[4]、較低的乙醇轉化率[4]和產(chǎn)生多種酶類（果膠酶[5]、糖苷酶[6]、脂肪酶[7]和蛋白酶[8]）等。因此，國內(nèi)外已有研究者和釀酒師嘗試發(fā)揮非釀酒酵母的優(yōu)勢，使其在受控的條件下參與或輔助葡萄酒釀造，從而對葡萄酒的風味帶來積極影響[9]。

葡萄酒釀造中商業(yè)酵母的廣泛使用所造成的產(chǎn)品同質化問題逐漸被研究者和生產(chǎn)者們所意識到并試圖進行改變[10]。目前，世界上許多著名葡萄酒產(chǎn)區(qū)的本土酵母已經(jīng)被廣泛研究[11-14]，我國也在本土優(yōu)良酵母的選育和應用上有所作為[15-19]。隨著對云南香格里拉產(chǎn)區(qū)葡萄與葡萄酒研究的開展與深入，該產(chǎn)區(qū)葡萄酒相關酵母的研究與開發(fā)也逐漸受到國內(nèi)研究者們的關注，這些研究主要包括葡萄酒發(fā)酵過程中酵母菌的動態(tài)變化[20]和篩選具有一定耐受性的釀酒酵母[21-23]等方面，而關于該產(chǎn)區(qū)具有地域特色的非釀酒酵母的研究則涉及很少。

本研究以云南香格里拉產(chǎn)區(qū)瀾滄江流域生長于4個不同海拔葡萄園的釀酒葡萄赤霞珠（Cabernet Sauvignon）為試材，對其自然發(fā)酵過程中特色非釀酒酵母進行分離和鑒定，同時采用頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法對自然發(fā)酵葡萄酒中的香氣成分進行分析，以期對本土葡萄酒特色非釀酒酵母資源的開發(fā)及特色葡萄酒的生產(chǎn)與研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

試驗所用釀酒葡萄赤霞珠于2017年10月采自于云南省迪慶州德欽縣瀾滄江流域布村、溜筒江、斯農(nóng)和阿東葡萄園，各采樣點信息如表1所示。

表1 采樣地信息Table 1 Information of the sampling sites

1.1.2 化學試劑

酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）快速抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）、NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）：北京博邁德生物公司；2×PCR Taq Mastermix：加拿大ABM公司；氫氧化鈉（分析純）：上海試四赫維化工有限公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；4-甲基-2-戊醇（色譜純）：美國Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%，瓊脂2%，氯霉素0.01%，121℃滅菌15 min。

WL營養(yǎng)瓊脂：青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Veriti梯度PCR儀：美國ABI公司；SPME手動進樣手柄、DVB/CAR/PDMS復合萃取頭（50/30 μm）：美國Supelco公司；GC/7890B-MS/5977A氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 自然發(fā)酵葡萄酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：10 kg赤霞珠葡萄果實樣品于無菌袋內(nèi)手工除梗、破碎（不添加SO2和果膠酶），然后于10 L無菌廣口瓶中28℃自然發(fā)酵，待發(fā)酵結束（還原糖含量≤4 g/L）進行皮渣分離，需分析檢測的原酒置于密封容器中于-20℃貯存一定時間即得葡萄酒，將酒樣進行指標檢測。

1.3.2 葡萄酒特色酵母的分離和鑒定

菌株分離：葡萄酒自然發(fā)酵過程中共進行8次分離，每48 h取發(fā)酵酒液用無菌水梯度稀釋，取10-4、10-5和10-6倍稀釋液各200 μL，分別涂布于YEPD固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)，選取每個培養(yǎng)基上10～15個代表性菌落進行純化并于4℃保存。

菌株鑒定：結合菌株鏡檢和WL培養(yǎng)基鑒定結果，選取代表性菌株進行26SrDNA D1/D2區(qū)序列分子鑒定。酵母菌基因組DNA的提取參考試劑盒說明書進行。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）反應體系：酵母菌基因組DNA模板2 μL，引物NL1和NL4各2 μL，Master Mix 20 μL，dd H2O 14 μL。PCR反應條件：95 ℃，5 min；94 ℃，1 min；55℃，1 min；72℃，1 min，循環(huán)36次；72℃，5 min。PCR產(chǎn)物于4℃保存，并將其送至北京博邁德生物公司進行測序，測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignmentsearch tool，BLAST）同源序列比對，并根據(jù)同源序列的相似度確定所分離酵母菌的種屬。

1.3.2 釀酒葡萄果實及自然發(fā)酵葡萄酒基本指標測定

釀酒葡萄果實和自然發(fā)酵葡萄酒中各項基本指標測定參考國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.3 自然發(fā)酵葡萄酒揮發(fā)性香氣成分測定

樣品預處理：準確吸取6.000 mL葡萄酒樣品于15 mL固相微萃取瓶中，加入1.50 g NaCl、4-甲基-2-戊醇20 μL（內(nèi)標物，2.00 g/L），將樣品瓶置于固相微萃取平臺上45℃預熱10 min，然后用固相微萃取頭在45℃條件下萃取吸附50 min，隨后將萃取頭插入氣相色譜進樣口250℃熱解吸10 min，同時進行質譜分析。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純度氦氣（He），流速1.0 mL/min，不分流進樣。升溫程序：初始溫度40℃保持2 min，以3℃/min升至85℃，保持2 min，以3℃/min升至120℃，保持3 min，以3℃/min升至200℃，最后以5℃/min升至230℃，保持10min。

質譜條件：采用電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70eV，檢測器溫度250℃，離子源溫度為230℃，Scan模式，掃描范圍為30～400 m/z，無溶劑延遲。

1.3.4 自然發(fā)酵葡萄酒揮發(fā)性香氣化合物分析

采用計算機譜庫（NIST14）進行初步檢索和分析，同時結合保留指數(shù)（retention index，RI）和相關文獻確定各揮發(fā)性物質的化學成分，采用內(nèi)標峰面積比值法進行定量，計算公式如下：

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每組樣品各指標進行3組平行測定，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）；組間比較采用Tukey法（α=0.05）和主成分分析（principl component analysis，PCA）法。

2 結果與分析

2.1 香格里拉產(chǎn)區(qū)瀾滄江流域葡萄酒特色酵母種屬

香格里拉產(chǎn)區(qū)瀾滄江流域4個不同海拔的赤霞珠自然發(fā)酵葡萄酒中分離得到葡萄酒相關酵母412株，經(jīng)形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定，結果分別見圖1及表2。

由表2可知，確定其中非釀酒酵母共有9個屬10個種，其中布村3種、溜筒江4種、斯農(nóng)4種、阿東5種。從分離結果中可以看出，葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）分布最為廣泛，其在4產(chǎn)地的自然發(fā)酵葡萄酒中均有分離到。其次是黏紅酵母（Rhodotorula glutinis），其存在于3個不同海拔的自然發(fā)酵的葡萄酒中。雖然在斯農(nóng)自然發(fā)酵的葡萄酒中并未分離到黏紅酵母，但與其他3產(chǎn)地相比，該地卻分離到獨有的黑酵母（Aureobasidium pullulans，又名出芽短梗霉）和漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）。此外，阿東自然發(fā)酵葡萄酒中存在該地獨有的酵母，分別是克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）和季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）。并且與之前的研究相比[20-23]，這是首次在香格里拉產(chǎn)區(qū)分離得到Meyerozyma屬酵母。另外，在斯農(nóng)和阿東自然發(fā)酵葡萄酒中還分離到梅奇屬酵母，其中斯農(nóng)為美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima），而阿東則為核果梅奇酵母（Metschnikowia fructicola）。淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）作為特有酵母僅在溜筒江自然發(fā)酵葡萄酒中分離到。除上述各酵母外，在溜筒江和布村兩地還分離到一種耐寒耐滲透性的假絲酵母Candida zemplinina。

圖1 特色非釀酒酵母在YEPD和WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of characteristic non-Saccharomyces on YEPD and WL nutrient medium

表2 香格里拉產(chǎn)區(qū)瀾滄江流域特色非釀酒酵母種屬Table 2 Characteristic non-Saccharomyces species and of Lancang river basin in Shangri-La wine producing regions

2.2 葡萄果實及自然發(fā)酵葡萄酒基本指標

香格里拉產(chǎn)區(qū)瀾滄江流域4個不同海拔的釀酒葡萄赤霞珠果實和自然發(fā)酵葡萄酒各項基本指標分析結果見表3。由表3可知，由于受小氣候環(huán)境的影響，各地釀酒葡萄赤霞珠果實中還原糖和總酸含量之間呈現(xiàn)一定的差異。與原料還原糖含量相關，溜筒江自然發(fā)酵葡萄酒的酒精度最高（15.46%vol），其次為布村（14.4%vol），盡管斯農(nóng)和阿東葡萄果實還原糖含量相近，但斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒的酒精度卻高出阿東近1%，這可能與某些酵母菌株較低的產(chǎn)酒精率有關。另外，不同酵母菌株有機酸代謝的差異還會影響葡萄酒中總酸和揮發(fā)酸的含量。經(jīng)過自然發(fā)酵，各地葡萄酒中的總酸含量較葡萄果實均明顯提升，但提升量和提升幅度各有不同，其中提升量最高的為斯農(nóng)（3.88g/L），而提升幅度最大的則為布村（104.6%）。各地自然發(fā)酵葡萄酒中揮發(fā)酸含量均相對較高，這可能與某些酵母菌株和一些細菌的代謝有關。

表3 葡萄果實及自然發(fā)酵葡萄酒基本指標Table 3 Basic indicators of grape fruit and spontaneously fermented wine

2.3 自然發(fā)酵葡萄酒揮發(fā)性香氣物質

采用頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用法，對香格里拉產(chǎn)區(qū)瀾滄江流域4個不同海拔的赤霞珠自然發(fā)酵葡萄酒中的揮發(fā)性香氣物質進行吸附、萃取、分離和分析，結果如表4所示。由表4可知，4個產(chǎn)地自然發(fā)酵葡萄酒中共檢測到揮發(fā)性香氣物質37種，包括9種高級醇類、17種酯類、4種脂肪酸類、1種酮類、4種芳香族類、1種萜烯類和1種其他類。

表4 自然發(fā)酵葡萄酒中揮發(fā)性香氣物質GC-MS分析結果Table 4 Results of aroma components in spontaneously fermented wine analyzed by GC-MS mg/L

續(xù)表

2.3.1 高級醇類

高級醇是酵母酒精發(fā)酵的次生代謝物，其生成量受多種因素影響。這類物質在較低的濃度下可以增加葡萄酒香氣的復雜性；但在較高濃度下則會對葡萄酒的香氣帶來負面影響[24]。

4個不同海拔的赤霞珠自然發(fā)酵葡萄酒中共檢測到高級醇9種，其中斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中高級醇的總量顯著高于其他3產(chǎn)地（P＜0.05）。在檢測到的9種高級醇中，異戊醇作為葡萄酒中重要的高級醇類香氣物質，其在4產(chǎn)地自然發(fā)酵葡萄酒中含量均較高（77.2%～86.2%），特別是在斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中的含量為83.49 mg/L。2-甲基丙醇的含量僅次于異戊醇，該物質在斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中的含量也明顯高于其他3產(chǎn)地（P＜0.05）。此外，斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中2-甲基丙醇、1-壬醇和3-乙氧基丙醇的含量也較高。1-辛醇和1-庚醇在阿東自然發(fā)酵葡萄酒中的含量均高于其他3產(chǎn)地。2,3-丁二醇是葡萄酒中為數(shù)不多能夠呈香的多元醇，其在溜筒江和斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中的有著相近的含量，且顯著高于阿東和布村（P＜0.05）。此外，2-壬醇則只在阿東、斯農(nóng)和布村自然發(fā)酵葡萄酒中檢測到。

2.3.2 酯類

葡萄酒中的酯類香氣物質主要是乙酸酯和脂肪酸乙酯，它們是葡萄酒中果香最主要的來源[25]。4個不同海拔的赤霞珠自然發(fā)酵葡萄酒中共檢測到17種酯類物質，其中乙酸酯6種、乙基酯9種、其他酯2種。從表4中可知，斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中乙酸酯、乙基酯和其他酯類物質的含量均顯著高于其他3地（P＜0.05）。

自然發(fā)酵葡萄酒中最主要的乙酸酯為乙酸乙酯，該物質具有輕微的果香，其在斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中的含量達66.69 mg/L，顯著高于阿東、溜筒江和布村。另外，乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯也葡萄酒中主要的呈香物質，在斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中這兩種物質的含量也明顯高于其他各產(chǎn)地（P＜0.05）。乙酸異丁酯和乙酸己酯在阿東自然發(fā)酵葡萄酒中的含量略高于溜筒江、斯農(nóng)和阿東，且在這3地均有著相似的含量。另外，各地自然發(fā)酵葡萄酒中還有少量乙酸甲酯被檢測到。

在乙基酯總量中所占比例較大的有辛酸乙酯和癸酸乙酯，它們在斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中的含量極高，分別為16.17 mg/L和6.08 mg/L，甚至為溜筒江的5.4和4.4倍。同時，在斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中乳酸乙酯也具有較高的含量。雖然斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中具有蠟香和奶油香的棕櫚酸乙酯含量也相對較高（0.36mg/L），但卻不及布村的0.42mg/L。此外，布村自然發(fā)酵葡萄酒中庚酸乙酯和十四酸乙酯的含量也為4產(chǎn)地最高，而丁酸乙酯和9-癸烯酸乙酯則僅在阿東自然發(fā)酵葡萄酒中含量稍高。

除上述各種乙酸酯和乙基酯外，各地自然發(fā)酵葡萄酒中還檢測到2種其他酯類。γ-丁內(nèi)酯具有獨特的芳香，其在斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中的含量略高于其他3地，可能是某些非釀酒酵母與釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵促進了該物質的生成[26]。另外，丁二酸二乙酯在阿東和斯農(nóng)的自然發(fā)酵葡萄酒中含量相近，但該物質并未在布村自然發(fā)酵葡萄酒中被檢測到。

2.3.3 脂肪酸類

揮發(fā)性脂肪酸類主要為葡萄酒提供乳酪和脂肪類香氣，其主要來源于酒精發(fā)酵，并受發(fā)酵條件、發(fā)酵營養(yǎng)和所用酵母的影響[27-28]。4個不同海拔的赤霞珠自然發(fā)酵葡萄酒中共檢測到揮發(fā)性脂肪酸4種。在斯農(nóng)自然發(fā)酵的葡萄酒中，多數(shù)揮發(fā)性脂肪酸的含量相對較高，其中僅乙酸含量略低于溜筒江0.7 mg/L，但在阿東和布村自然發(fā)酵的葡萄酒中，各種揮發(fā)性脂肪酸含量則相對較低。

2.3.4 酮類

除種類和含量均比較豐富的高級醇類、酯類和脂肪酸類物質外，4個不同海拔的赤霞珠自然發(fā)酵葡萄酒中還檢測到1種酮類物，即具有薄荷香的二異丁基酮。該物質僅在布村自然發(fā)酵葡萄酒中的含量較低為1.74 mg/L，而在其他3產(chǎn)地的含量稍高但之間并無明顯差異（P＞0.05）。

2.3.5 芳香族類

以釀酒原料中的苯丙氨酸為底物，經(jīng)轉氨和脫羧作用可形成多種芳香族類化合物[29]，而苯乙醇作為最重要的芳香醇對多種酒類的香氣具有重要影響[30-32]。由表4可知，雖然斯農(nóng)自然發(fā)酵葡萄酒中具有烘烤香和果香的苯甲醇含量較低，但其苯乙醇含量為29.39 mg/L，極大高出其他各產(chǎn)地近1倍以上，這可能與某些具有高產(chǎn)苯乙醇能力的酵母（如美極梅奇酵母[33]）參與發(fā)酵有關。3,4-二甲基苯甲醛雖然在一些產(chǎn)地間存在差異，但總體看其含量較為接近。另外，布村自然發(fā)酵葡萄酒中還檢測到有少量的苯甲醛。

2.3.6 萜烯類

萜烯類香氣物質通常具有優(yōu)雅的花香和果香并大多以糖苷結合態(tài)形式存在于釀酒原料中[34]，但也有研究表明微生物合成也是其可能的來源[35]。可能是由于試驗所用赤霞珠為非芳香型釀酒葡萄[36]，4個不同海拔的赤霞珠自然發(fā)酵葡萄酒中所檢測到的萜烯類物質僅有香茅醇，并且該物質在相對海拔較高的斯農(nóng)和阿東自然發(fā)酵葡萄酒中具有較高的含量（0.26 mg/L和0.22 mg/L）。

2.3.7 其他類

除上述各類香氣物質之外，香格里拉產(chǎn)區(qū)瀾滄江流域4個不同海拔的赤霞珠自然發(fā)酵葡萄酒中還檢測到1種其他類香氣物質，即甲氧基苯基肟。有研究表明，在大葉黃楊[37]和藍莓[38]等植物及扇貝豆醬[39]和白酒[40]等發(fā)酵制品中該物質均有存在，推斷其可能來源于釀酒原料和發(fā)酵過程中微生物的作用。由表2可知，甲氧基苯基肟在各地自然發(fā)酵葡萄酒中的含量差異較大，并在布村和阿東自然發(fā)酵葡萄酒中的含量較高（0.96 mg/L和0.86 mg/L）。

2.4 自然發(fā)酵葡萄酒主成分分析

為探究香格里拉產(chǎn)區(qū)瀾滄江流域4個不同海拔赤霞珠自然發(fā)酵葡萄酒香氣之間的差異，以分析檢測出的全部37種香氣物質的定量數(shù)據(jù)進行PCA分析。如圖2所示，前2個主成分PC1和PC2能夠提取76.04%的總方差，其貢獻率分別為50.00%和26.04%。各產(chǎn)地自然發(fā)酵葡萄酒香氣之間具有明顯的差異，其中斯農(nóng)主要分布在PC1上，而阿東則主要分布在PC2上。可能是由于溜筒江和布村兩地棲息的酵母種屬具有很多共性，這兩地在PCA圖中的分布處于鄰近位置，而阿東和斯農(nóng)則可能因有當?shù)鬲毺氐慕湍妇陞⑴c發(fā)酵，這兩地自然發(fā)酵葡萄酒的香氣更有自身的特點，但關于酵母多樣性及葡萄酒香氣之間的相關性還需進一步試驗的驗證。

圖2 不同產(chǎn)地自然發(fā)酵葡萄酒主成分分析Fig.2 Principle component analysis of spontaneously fermented wine of different regions

3 結論

本試驗對香格里拉產(chǎn)區(qū)瀾滄江流域4個不同海拔的赤霞珠自然發(fā)酵葡萄酒中特色非釀酒酵母進行分離和鑒定，得到非釀酒酵母共9個屬10個種。其中，葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）在各地均有分離到。與其他3地相比，在斯農(nóng)中并未分離到黏紅酵母（Rhodotorula glutinis），但該產(chǎn)地卻存在獨有出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）和漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）；而核果梅奇酵母（Metschnikowia fructicola）、季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）和克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）則為阿東所獨有。雖然淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）僅在溜筒江分離到，但該地所分布的其他酵母種屬則與布村較為類似。由于這些酵母菌株的存在并參與葡萄酒發(fā)酵，使得各地自然發(fā)酵葡萄酒的香氣各具特色，其中以醇類、酯類和芳香族類香氣種類與含量的差異最為突出。因此，存在于當?shù)氐母鞣N非釀酒酵母對各地自然發(fā)酵葡萄酒中風味物質的形成具有重要作用。