董 畫，何 雨，薛桂新*

（延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

葡萄酒中含有多種花青素、多酚、黃酮、白藜蘆醇等活性物質(zhì)，適量飲用可提高人體肌肉張弛度、改善睡眠、美容養(yǎng)顏和抗衰老等[1]。葡萄酒還具有香氣濃郁、口味醇厚、風(fēng)味良好的特點(diǎn)。葡萄酒的風(fēng)味隨著貯存年份的不同而有所改變，對(duì)葡萄酒的品質(zhì)影響較大，所以葡萄酒的酒齡是影響葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)。

葡萄酒及白酒酒齡檢測(cè)的方法有感官評(píng)價(jià)法、化學(xué)分析法、仿生傳感智能感官法[2]。感官評(píng)價(jià)法[3]和化學(xué)分析法[4]存在人為干擾較大和分析過(guò)程復(fù)雜、設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)。電子鼻技術(shù)是一種仿生傳感智能感官法[5]，它利用現(xiàn)代信息技術(shù)和傳感技術(shù)模仿人或動(dòng)物的視覺、味覺、聽覺和嗅覺等感覺行為，自動(dòng)獲取被檢測(cè)對(duì)象品質(zhì)特性的信息，并模擬人對(duì)信息的理解和判別對(duì)獲取的信息進(jìn)行處理的技術(shù)。該技術(shù)具有無(wú)損、快速和操作方便等優(yōu)點(diǎn)。

在國(guó)外，電子鼻的應(yīng)用十分廣泛[6]，如食品工業(yè)[7]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[8]、醫(yī)療衛(wèi)生[9]和藥品工業(yè)[10]等。PERIS M 等[11-12]利用電子鼻識(shí)別了食物的真?zhèn)魏蛽郊?，并?duì)西班牙葡萄酒品種進(jìn)行了識(shí)別。在國(guó)內(nèi)，有關(guān)電子鼻技術(shù)的應(yīng)用剛剛起步[13]，在葡萄酒品質(zhì)檢測(cè)中，張昱等[14]利用電子鼻技術(shù)研究了慕薩萊思葡萄酒中呈香物質(zhì)的變化；許春華等[15]利用電子鼻對(duì)不同品種的櫻桃酒和葡萄酒的香氣進(jìn)行了研究。研究表明，電子鼻的傳感器響應(yīng)與樣品的種類、質(zhì)量、溫度、狀態(tài)以及環(huán)境因素有很大的關(guān)系[16]，樣品體積和樣品瓶頂空生成時(shí)間對(duì)電子鼻傳感器也有很大的影響。

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是葡萄屬植物中最抗寒的一個(gè)種，原產(chǎn)于吉林、黑龍江和遼寧，目前在大小興安嶺廣泛分布[17]。山葡萄用于工業(yè)化釀酒已有七十多年歷史，已成為我國(guó)葡萄酒行業(yè)獨(dú)具地方特色的品牌，是吉林省的支柱產(chǎn)業(yè)，在國(guó)內(nèi)外有較高的知名度[18]。但由于部分中小葡萄酒廠追求經(jīng)濟(jì)利益，虛報(bào)葡萄酒生產(chǎn)年份，陳釀時(shí)間短，用勾兌等方法彌補(bǔ)天然葡萄酒色香味的不足，影響了山葡萄酒的質(zhì)量和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本研究以山葡萄酒為實(shí)驗(yàn)材料，利用電子鼻技術(shù)，通過(guò)主成分分析法（principal component analysis，PCA）、線性判別分析法（linear discriminant analysis，LDA）和方差分析（analysisof variance，ANOVA）等科學(xué)方法對(duì)葡萄酒樣品的體積分?jǐn)?shù)、樣品體積和樣品瓶頂空生成時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化參數(shù)的條件下，通過(guò)逐步線性判別分析法（stepwise linear discriminant analysis，Step-LDA）對(duì)2014-2017年不同酒齡的山葡萄酒進(jìn)行識(shí)別，達(dá)到對(duì)山葡萄酒酒齡準(zhǔn)確識(shí)別的目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2014-2017年生產(chǎn)的山葡萄酒：吉林省延邊州長(zhǎng)白娃食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3型電子鼻儀器：德國(guó)AIRSENSE公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；TDZ5-WS型高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；pH-3C型酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

將山葡萄酒樣品從瓶中取出，待溫度至室溫，在3000r/min的條件下離心10min，取上層液作為測(cè)試樣品。取一定體積的樣品放入40 mL頂空瓶中，平衡一段時(shí)間后，采用靜態(tài)頂空進(jìn)樣方式，進(jìn)樣前在進(jìn)樣口放置0.45 μm濾膜，將電子鼻針頭從采樣瓶頂部刺入進(jìn)行樣品分析。電子鼻清洗時(shí)間為240 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間為5 s，檢測(cè)時(shí)間為100 s，電子鼻軟件每1 s自動(dòng)記錄一次數(shù)據(jù)。表1為電子鼻10個(gè)傳感器（S1～S10）對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)[19]。

表1 電子鼻傳感器及對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)Table 1 E-nose sensor and corresponding sensitive materials

1.3.1 樣品體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

取2016年和2017年的山葡萄酒樣品分別按照樣品體積分?jǐn)?shù)3.3%、4.0%、5.0%、6.7%、10.0%、20.0%和100%分成7組，各取10 mL進(jìn)樣分析。每組重復(fù)5次，共70個(gè)樣品，樣品放置10 min后進(jìn)行電子鼻分析。

1.3.2 樣品體積的優(yōu)化

取2016年和2017年的山葡萄原酒樣品，選用1.3.1中優(yōu)化的體積分?jǐn)?shù)，分別按照樣品體積1 mL、2 mL、5 mL、10 mL和15 mL分成5組，每組重復(fù)5次，共50個(gè)樣品，樣品放置10 min后進(jìn)行電子鼻分析。

1.3.3 樣品瓶頂空生成時(shí)間的優(yōu)化

取2016年和2017年的山葡萄酒樣品，選用1.3.1中優(yōu)化的體積分?jǐn)?shù)和1.3.2中優(yōu)化的體積，分別按照頂空生成時(shí)間0 min、10 min、20 min、30 min和40 min分成5組，每組重復(fù)5次，共50個(gè)樣品，靜置相應(yīng)時(shí)間后進(jìn)行電子鼻分析。

1.3.4 不同年份山葡萄酒感官評(píng)價(jià)

由13名具有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的人員對(duì)2014～2017年4種不同年份的山葡萄酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2[20]。

表2 山葡萄酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of wild grape wine

1.3.5 不同年份山葡萄酒樣品的電子鼻識(shí)別

采用1.3.1、1.3.2和1.3.3中的優(yōu)化參數(shù)，對(duì)2014、2015、2016和2017年四年的山葡萄酒樣品進(jìn)行識(shí)別，每組20個(gè)重復(fù)，共80個(gè)樣品。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

選擇傳感器信號(hào)較穩(wěn)定時(shí)間內(nèi)的響應(yīng)值進(jìn)行分析。主成分分析、線性判別分析是通過(guò)電子鼻自帶的WinMuster分析軟件進(jìn)行分析，利用SPSS 22進(jìn)行方差分析和逐步判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 樣品體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

圖1 體積分?jǐn)?shù)為20.0%（A）、10.0%（B）和6.7%（C）的樣品對(duì)電子鼻傳感器的效應(yīng)曲線Fig.1 Effect curves of samples with volume fraction 20.0%(A),10.0%(B)and 6.7%(C)on E-nose sensor

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)（100%），對(duì)傳感器會(huì)造成一定程度的損壞，當(dāng)樣品體積分?jǐn)?shù)過(guò)小時(shí)（3.3%、4.0%和5.0%），電子鼻傳感器響應(yīng)值太低，極易受到外界干擾，樣品體積分?jǐn)?shù)為6.7%、10.0%和20.0%時(shí)傳感器響應(yīng)值大小適宜。三個(gè)體積分?jǐn)?shù)的樣品電子鼻傳感器響應(yīng)曲線見圖1。由圖1可知，S1～S10這10個(gè)傳感器的響應(yīng)曲線圖大體趨勢(shì)一致，其中，S2、S6、S7、S8和S9傳感器的響應(yīng)曲線都是迅速升高后急劇下降最后逐漸趨于平穩(wěn)，而其余傳感器響應(yīng)曲線略微升高后趨于平穩(wěn)；樣品的體積分?jǐn)?shù)越高其響應(yīng)值越大，說(shuō)明該傳感器對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)濃度越高，根據(jù)表1可知，山葡萄酒樣品中氮氧化合物、甲烷、乙醇、芳香成分和有機(jī)硫化物等化合物含量較高。3種體積分?jǐn)?shù)均可用于電子鼻識(shí)別，但僅根據(jù)響應(yīng)值大小無(wú)法準(zhǔn)確判斷用于識(shí)別2016年和2017年樣品的最優(yōu)體積分?jǐn)?shù)，因此使用了其他分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

PCA和LDA的總貢獻(xiàn)率為第一主成分方差貢獻(xiàn)率和第二主成分方差貢獻(xiàn)率之和，總貢獻(xiàn)率越大，越能更好的反映原始數(shù)據(jù)的信息[21]，總貢獻(xiàn)率超過(guò)70%的分析結(jié)果是可行的[22]。

2016年和2017年3種體積分?jǐn)?shù)樣品的電子鼻PCA及LDA結(jié)果見圖2。由圖2A可知，當(dāng)樣品體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，兩年份樣品重合嚴(yán)重，且樣品離散程度較大，不適合用于區(qū)分；當(dāng)樣品體積分?jǐn)?shù)為6.7%時(shí)，兩年份樣品點(diǎn)也有重疊；當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，兩樣品點(diǎn)分散開來(lái)，區(qū)分效果較好。由圖2B可知，2016年和2017年樣品分離效果較好，且2016年10.0%、20.0%和2017年10.0%的離散程度較小，說(shuō)明LDA的效果好于PCA。

圖2 三種體積分?jǐn)?shù)下樣品的電子鼻PCA（A）和LDA（B）結(jié)果Fig.2 PCA(A)and LDA(B)results of E-nose of samples with three kinds of volume fractions

不同實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)單一傳感器的方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，不同樣品體積分?jǐn)?shù)和頂空生成時(shí)間對(duì)電子鼻單一傳感器的響應(yīng)信號(hào)無(wú)顯著影響（P＞0.05），而不同樣品體積有極顯著影響（P＜0.01），說(shuō)明樣品體積對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大。

表3 不同實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)單一傳感器的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of different experiment parameters for single sensor

電子鼻復(fù)合傳感器對(duì)2016年和2017年不同實(shí)驗(yàn)參數(shù)的ANOVA分析結(jié)果見表4。由表4可知，選用復(fù)合傳感器數(shù)據(jù)分析時(shí)，各實(shí)驗(yàn)參數(shù)間均具有極顯著差異（P＜0.01）。

表4 電子鼻復(fù)合傳感器對(duì)2016年和2017年不同實(shí)驗(yàn)參數(shù)的方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of E-nose composite sensor for different experiment parameters of wild grape wines with the year of 2016 and 2017

綜合表3和表4，可以看出僅靠單一傳感器識(shí)別時(shí)存在局限性，而多種傳感器綜合使用效果優(yōu)越。由表4可知，樣品體積分?jǐn)?shù)10.0%的F值最大，說(shuō)明兩種樣品間的差異程度最大，有較好的區(qū)分效果。綜合以上分析，區(qū)分2016年和2017年山葡萄酒優(yōu)化樣品體積分?jǐn)?shù)為10.0%。

2.1.2 樣品體積的優(yōu)化

2016年和2017年5種樣品體積下樣品的電子鼻PCA及LDA結(jié)果見圖3。由圖3A可知，當(dāng)樣品體積為1 mL時(shí)，兩年份樣品點(diǎn)有重合部分，區(qū)分效果不好；在其他體積條件下，兩年份樣品都區(qū)分開來(lái)，但2016年10 mL體積的樣品點(diǎn)分散。由3B可知，2016年和2017年樣品點(diǎn)分布集中，且2016年樣品各個(gè)體積條件下除了5 mL和10 mL樣品重合，其余樣品都區(qū)分開；而2017年各體積條件下，重合較嚴(yán)重。表4中樣品體積5 mL的F值最大，兩樣品差異程度最大。綜合以上分析，區(qū)分2016年和2017年山葡萄酒優(yōu)化的樣品體積為5 mL。

2.1.3 頂空生成時(shí)間的優(yōu)化

其三，政府部門要加大扶持力度，發(fā)揮帶頭作用，深入田間地頭指導(dǎo)農(nóng)民，通過(guò)身體力行，讓農(nóng)民對(duì)生態(tài)環(huán)境保護(hù)有直觀的認(rèn)識(shí)，并積極效仿。此外，政府還要重視農(nóng)業(yè)示范基地建設(shè)，對(duì)示范田的土壤、農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量以及試驗(yàn)田的周圍環(huán)境都要進(jìn)行調(diào)查、分析，充分發(fā)揮農(nóng)業(yè)生產(chǎn)示范田的標(biāo)榜作用。

2016年和2017年5種頂空生成時(shí)間下樣品的電子鼻PCA及LDA結(jié)果見圖4。由圖4A可知，2016年和2017年樣品在5種頂空生成時(shí)間下，在PCA圖中都能夠區(qū)分開來(lái)，但2016年40 min樣品點(diǎn)分布離散。同時(shí)還可以看出，2017年樣品在各個(gè)時(shí)間條件下也有較多重合部分，說(shuō)明各個(gè)生成時(shí)間條件下，2017年樣品差異較小。由圖4B可知，各個(gè)樣品點(diǎn)分布集中，且兩年份樣品分離。由表4可知，頂空生成時(shí)間30 min時(shí)F值最大，兩樣品間差異最大。綜上分析，區(qū)分2016年和2017年山葡萄酒優(yōu)化樣品瓶頂空生成時(shí)間為30 min。

從PCA、LDA和方差分析結(jié)果可以看出，PCA在降維的同時(shí)，最大程度的保留了原始信息，其貢獻(xiàn)率之和很高，但分類效果一般。LDA結(jié)果顯示其分類效果最好，樣品點(diǎn)分布集中。而方差分析法可以通過(guò)F值表示樣品間差異程度。因此，采用PCA、LDA和ANOVA多種分析方法相結(jié)合來(lái)確定優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)參數(shù)較為科學(xué)。

圖4 五種頂空生成時(shí)間下樣品的電子鼻PCA（A）和LDA（B）結(jié)果Fig.4 PCA(A)and LDA(B)results of E-nose of samples with five kinds of headspace-generation time

2.2 4種不同酒齡山葡萄酒樣品的電子鼻識(shí)別

2.2.1 不同酒齡山葡萄酒樣品感官評(píng)價(jià)

表5 山葡萄酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results of wild grape wines

由表5可知，山葡萄酒貯存年份越久，酒樣澄清度和香氣得分逐漸增高，酒體越澄清，香氣越濃郁。使用感官評(píng)價(jià)法對(duì)山葡萄酒的色澤、澄清度和香氣具有一定的區(qū)分效果，對(duì)滋味無(wú)法進(jìn)行區(qū)分。在色澤與香氣方面，2017年樣品與2014年和2015年樣品均有顯著性差異（P＜0.05）；在澄清度方面，僅2016年和2014年樣品存在顯著性差異（P＜0.05）；在滋味方面，4年樣品無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。通過(guò)感官評(píng)價(jià)無(wú)法準(zhǔn)確的識(shí)別4個(gè)年份的山葡萄酒樣品，對(duì)滋味完全無(wú)法識(shí)別。

2.2.2 不同年份的山葡萄酒PCA和LDA分析

4種年份的山葡萄酒樣品電子鼻PCA及LDA結(jié)果見圖5。由圖5A可知，PC1和PC2方差累計(jì)貢獻(xiàn)率為98.76%，保留了幾乎所有的原始信息。通過(guò)SPSS對(duì)四個(gè)年份十個(gè)傳感器的響應(yīng)值進(jìn)行主成分分析，得出第一主成分和第二主成分的成分矩陣表，進(jìn)而求得兩個(gè)主成分的表達(dá)公式：

第一主成分=0.321ZS1+0.327ZS2+0.329ZS3+0.320ZS4+0.329ZS5+0.290ZS6+0.315ZS7+0.316ZS8+0.314ZS9+0.300ZS10

（其中ZS1表示S1傳感器響應(yīng)值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的結(jié)果，其他傳感器數(shù)值同樣經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理）

四個(gè)年份的樣品在PC1軸上差異不大，在PC2軸上能夠區(qū)分開，山葡萄酒貯存年份相差越大，樣品間距離越遠(yuǎn)，可見不同貯存年份其香氣成分有差異，并且差異主要體現(xiàn)在第二主成分上。由第二主成分表達(dá)式可知，傳感器S6、S9和S10對(duì)第二主成分影響較大，即四個(gè)年份樣品第二主成分上的差異可能是由S6、S9和S10傳感器響應(yīng)值不同引起，結(jié)合表1各傳感器對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)可知，四個(gè)年份樣品中的甲烷等烷烴類及有機(jī)硫化物等芳香成分含量存在差異。由圖5B可知，不同年份的樣品間區(qū)分效果好，通過(guò)第一主成分就能夠分離開，并且樣品點(diǎn)相對(duì)于PCA圖中，分布更加集中，區(qū)分效果更好。

圖5 不同年份山葡萄酒的電子鼻PCA（A）和LDA（B）結(jié)果Fig.5 PCA(A)and LDA(B)results of E-nose of wild grape wines with different years

2.2.3 不同年份山葡萄酒的逐步線性判別分析

逐步判別分析法可以依據(jù)建立的模板，對(duì)未知酒樣品進(jìn)行識(shí)別。本實(shí)驗(yàn)選取了2014-2017年各10個(gè)樣品建立模板，對(duì)另外10個(gè)樣品進(jìn)行逐步線性判別分析，結(jié)果見表6。

表6 不同年份的山葡萄酒電子鼻逐步線性判別分析結(jié)果Table 6 Stepwise linear discriminant analysis results of E-nose for wild grape wines with different years

由表6可知，2014-2016年的10個(gè)樣品預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率均為100%，而2017年的10份樣品中有3個(gè)樣品被誤分到2016年，準(zhǔn)確率為70%，可能是由于2017年山葡萄酒貯存時(shí)間已達(dá)半年多，個(gè)別樣品香氣成分與2016年香氣成分可能比較接近的原因。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明利用電子鼻通過(guò)逐步線性判別分析法對(duì)山葡萄酒識(shí)別時(shí)，山葡萄酒的酒齡為一年半以上時(shí)能獲得100%的準(zhǔn)確率。

3 結(jié)論

電子鼻測(cè)定不同酒齡山葡萄酒時(shí)，樣品體積分?jǐn)?shù)，樣品體積和樣品瓶頂空生成時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果有很大影響，其中樣品體積的影響程度最大，對(duì)單個(gè)傳感器和復(fù)合傳感器影響均極顯著（P＜0.01）。結(jié)合PCA，LDA和ANOVA分析方法，確定出優(yōu)化參數(shù)為：樣品體積分?jǐn)?shù)10.0%、樣品體積5 mL、樣品瓶頂空生成時(shí)間30 min。

利用感官評(píng)價(jià)方法可以在一定程度上區(qū)分不同年份的山葡萄酒，但區(qū)分效果不佳，且無(wú)法進(jìn)行年份識(shí)別。而電子鼻在優(yōu)化參數(shù)條件下可以完全區(qū)分2014年、2015年、2016年和2017年的山葡萄酒樣品，并且在PCA和LDA分析圖上，各樣品的分布位置不同，儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)，樣品間距離越遠(yuǎn)，識(shí)別效果越好。對(duì)電子鼻各傳感器的響應(yīng)值進(jìn)行逐步線性判別分析，2014、2015和2016年的山葡萄酒預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為100%，2017年樣品預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為70%。