許 宙 魯士珍 陳茂龍 朱穎越 丁 利 程云輝

(1. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114；2. 常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

雙酚A是一種固化聚碳酸酯塑料和合成環(huán)氧樹脂的有機(jī)小分子物質(zhì)[1]，其廣泛用于食品包裝容器、奶瓶、包裝材料、餐具和微波爐等的生產(chǎn)[2-3]。但BPA具有不穩(wěn)定性，酸、堿環(huán)境和加熱等因素均會(huì)導(dǎo)致其遷移至所包裝的食品或飲料中[4]，使其廣泛存在于環(huán)境和食物鏈。同時(shí)，BPA是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，可模擬雌激素的作用與雌激素受體結(jié)合干擾生物體內(nèi)的激素代謝[5-6]，從而導(dǎo)致人和動(dòng)物的生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)[7]以及免疫系統(tǒng)等異常，甚至有可能誘發(fā)癌變[8-9]和威脅胎兒及兒童的生長(zhǎng)和發(fā)育，使其出現(xiàn)出生缺陷，不孕、女孩早熟和肥胖等問(wèn)題[10]。

目前，測(cè)定雙酚A的主要分析方法是高效液相色譜[11]、液—質(zhì)聯(lián)用法、氣相色譜—質(zhì)譜法[12-13]、熒光法[14-15]和酶聯(lián)免疫吸附法[16-17]等，其中常用的分析方法為色譜法和MS技術(shù)。這些技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)雙酚A的高靈敏度分析，但需要專業(yè)人員操作、資本投入高、樣品制備和預(yù)處理復(fù)雜費(fèi)時(shí)等要求限制了其在雙酚A檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用[18-19]，且無(wú)法滿足目前對(duì)檢測(cè)技術(shù)高速度、高通量、高便攜性的要求。因此，建立一種樣品前處理簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高的雙酚A快速檢測(cè)方法具有重要意義。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)是當(dāng)能量供體分子的熒光光譜與能量受體分子的激發(fā)光譜重疊時(shí)，2個(gè)熒光分子之間通過(guò)偶極—偶極相互作用發(fā)生非輻射能量躍遷，供體分子激發(fā)態(tài)的能量通過(guò)分子間的電偶極相互作用轉(zhuǎn)移給受體分子基態(tài)，從而使能量供體分子的熒光強(qiáng)度減弱或淬滅、出現(xiàn)熒光壽命縮短，與此相反，能量受體分子的熒光強(qiáng)度增加，熒光壽命延長(zhǎng)的現(xiàn)象[20]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移是一種均相分析檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高，選擇性好、操作簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。傳統(tǒng)的熒光供體通常是有機(jī)熒光染料，存在吸收光譜較窄，吸收峰和發(fā)射峰之間的斯托克斯位移較小等缺陷。而上轉(zhuǎn)換熒光納米材料是使用近紅外光(980 nm或者880 nm)作為激發(fā)光源，發(fā)射光在可見(jiàn)光區(qū)域分布，具有寬廣的吸收光譜，斯托克斯位移較大等特點(diǎn)，并可以克服生物組織或者復(fù)雜樣品自身熒光干擾，降低了檢測(cè)體系中的信噪比。因此，上轉(zhuǎn)換納米材料是理想的熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系能量供體。

本研究擬利用適配體核苷酸的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用，驅(qū)動(dòng)適配體功能化AuNPs和適配體互補(bǔ)鏈功能化UCNPs進(jìn)行組裝，將適配體對(duì)BPA的識(shí)別過(guò)程轉(zhuǎn)化為檢測(cè)體系熒光發(fā)射強(qiáng)度變化，建立高選擇性、高靈敏度的BPA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

YCl3·6H2O(99.99%)、YbCl3·6H2O(99.99%)、ErCl3·6H2O(99.99%)、油酸(OA)、1-十八烯(ODE)、聚丙烯酸(PAA，相對(duì)分子量5 000)：北京百靈威科技有限公司；

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(suflo-NHS)：98%，上海麥克林生化科技有限公司；

氫氧化鈉、氟化銨、檸檬酸三鈉、氯金酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：≥99%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

氯化鈉、氯化鉀：≥99%，廣東光華科技股份有限公司；

十二烷基磺酸鈉(SDS)：99%，合肥博美生物科技責(zé)任有限公司；

實(shí)驗(yàn)室用超純水：18.2 MΩ·cm的Millipore制備；

其他試劑：分析純，市售；

熒光分光光度計(jì)：F96PRO型，上海棱光技術(shù)有限公司；

激光發(fā)射器：MDL-III-980-2W型，中國(guó)長(zhǎng)春新產(chǎn)品光電技術(shù)有限公司；

磁力攪拌電熱套：ZNCL-TS型，河南鞏義市宏華儀器設(shè)備有限公司；

透射電子顯微鏡：JEOLJEM-2100型，日本電子株式會(huì)社；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-1800型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 水溶性上轉(zhuǎn)換納米材料的制備 按照Li等[17]報(bào)道的合成方法制備油溶性上轉(zhuǎn)換納米材料：稱取YCl3·6H2O 0.236 g、YbCl3·6H2O 0.077 g、ErCl3·6H2O 0.007 g(Ln：78% Y3+、20% Yb3+、2% Er3+；共計(jì)1 mmol)加入到100 mL 三頸燒瓶中，加入4 mL OA和15 mL 1-ODE，1 500 r/min 磁力攪拌同時(shí)逐漸升溫至130 ℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)以除去環(huán)境中的空氣和水蒸氣，進(jìn)一步升溫至160 ℃，至混合物形成均一溶液后自然冷卻至室溫；準(zhǔn)確稱取0.13 g NaOH和0.13 g NH4F溶于10 mL甲醇中，將上述溶液逐滴加入到三頸燒瓶中，磁力攪拌30 min至反應(yīng)體系充分混合，隨后緩慢加熱以蒸發(fā)甲醇，再逐漸升溫至300 ℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)加熱1 h后，溶液自然冷卻，產(chǎn)品用乙醇從溶液中沉淀出來(lái)，乙醇/環(huán)己烷(體積比5∶1) 清洗3次，烘干，即得NaY0.78F4:Yb0.2；Er0.02油溶性上轉(zhuǎn)換熒光納米材料。

油酸包覆的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料由于油酸分子的烴鏈起疏水作用，材料在水中的分散性極差，需要對(duì)該材料表面進(jìn)行PAA修飾。本研究按照Dai等[21]報(bào)道采用配體交換法制備PAA包裹的水溶性上轉(zhuǎn)換熒光納米材料：10 mL PAA分散在乙醇溶液(～20 mL wt 99.8%)中，5 mL OA-UCNPs分散在氯仿(～10 mL wt 99.8% )，然后將乙醇溶液加入到氯仿中，隔夜攪拌。再用乙醇清洗3次，最后將上轉(zhuǎn)換熒光納米材料分散在水中。

1.2.2 金納米顆粒的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[22]記錄采用檸檬酸三鈉還原氯金酸(HAuCl4)法來(lái)合成金納米顆粒，步驟如下：取超純水97.5 mL以及質(zhì)量濃度為0.412% (10 mmol/L)的HAuCl4溶液2.5 mL加入到有磁性攪拌子的潔凈錐形瓶中，采用磁力加熱攪拌器，攪拌、加熱至沸騰，7～8 min 后，加入質(zhì)量濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液2 mL，溶液從無(wú)色變?yōu)榫萍t色，保持10 min，然后停止加熱，但保持原來(lái)的磁力攪拌狀態(tài)；維持15 min后從磁力加熱攪拌器上取下錐形瓶，所得酒紅色液體即為13 nm AuNPs。

1.2.3 金納米探針的制備 利用BPA適配體取1 mL制備得到的AuNPs溶液高速離心得到AuNPs沉淀，然后分散在1 mL 10 mmol/L pH 7.4 PBS緩沖液中，加入BPA適配體溶液(DNA1)10 μL，振蕩混合后搖床孵育過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后，溶液用12 000 r/min離心15 min，棄上清，保留底部暗紅色的AuNPs-DNA1探針，重懸于SDS溶液中，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

雙酚A適配體序列5端巰基：5-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCAT-CACGGGTTCGCACCA-3。

1.2.4 上轉(zhuǎn)換熒光納米探針的制備 稱取10 mg PAA修飾的NaYF4：Yb0.2，Er0.02UCNPs(PAA-UCNPs)分散在5 mL 10 mmol/L PBS(pH 7.4)緩沖液中，超聲充分分散，加入200 mmol/L EDC和100 mmol/L sulfo-NHS溶液各100 μL，37 ℃搖床活化2 h。之后加入一定量的BPA適配體互補(bǔ)鏈(DNA2)，在37 ℃搖床中孵育過(guò)夜，離心收集材料，用PBS緩沖液清洗3次，將最后得到的核酸適配體互補(bǔ)鏈修飾的功能化UCNPs(UCNPs-DNA2)分散在0.01% SDS溶液中，UCNPs-DNA2的濃度為2 nmol/L。

互補(bǔ)鏈5端氨基修飾：5-CCCACCTGACCACCCAC CGG-3。

1.2.5 檢測(cè)體系的構(gòu)建 用超純水配制所需濃度的BPA標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-3，1.0×10-4，1.0×10-5，1.0×10-6，1.0×10-7，1.0×10-8，1.0×10-9mol/L)，各取10 μL加入到制備好的功能化金納米探針(AuNPs-DNA1)中，室溫下振蕩孵育3.0 h；離心分離去除未反應(yīng)的雙酚A，水洗3次重懸于500 μL 的0.01%的SDS緩沖液中，制備得AuNPs-DNA1-BPA納米粒子；向上述溶液中加入500 μL制備好的功能化UCNPs(UCNPs-DNA2)，混合均勻，室溫下振蕩孵育1.0 h后，用激光發(fā)射器980 nm激發(fā)檢測(cè)體系，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其在500～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

檢測(cè)原理如圖1所示。通過(guò)BPA適配體功能化修飾的AuNPs與雙酚A發(fā)生特異性識(shí)別，當(dāng)檢測(cè)體系中沒(méi)有BPA存在時(shí)，功能化AuNPs與功能化UCNPs通過(guò)DNA雜交作用進(jìn)行結(jié)合；反之，當(dāng)體系中存在BPA時(shí)，BPA會(huì)與適配體功能化AuNPs發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，導(dǎo)致功能化AuNPs從UCNPs表面脫落。隨著BPA濃度的升高，功能化UCNPs與功能化AuNPs結(jié)合形成組裝體的程度逐漸降低，使用激光980 nm 激發(fā)檢測(cè)體系，隨著組裝體組裝程度降低，在發(fā)射光543 nm波長(zhǎng)處特征峰的光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，據(jù)此建立基于FRET原理的金納米粒子淬滅上轉(zhuǎn)換熒光的BPA檢測(cè)傳感平臺(tái)。

圖1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)雙酚A原理圖Figure 1 Schematic diagram of FRET sensor for detection BPA

2.2 功能化AuNPs和UCNPs納米材料的表征

透射電鏡分析是納米材料最重要的表征手段之一，可以直觀地反映納米材料的形貌、粒徑和分散性等狀態(tài)。其中，材料粒徑過(guò)大易導(dǎo)致聚沉而無(wú)法滿足檢測(cè)要求；分散性是該傳感器建立的重要條件，直接影響納米材料的功能化修飾和特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果。圖2、3是透射電子顯微鏡(TEM)和水合粒徑儀(DLS)對(duì)適配體功能化AuNPs和互補(bǔ)鏈功能化UCNPs的表征結(jié)果。從圖2可觀察到，功能化UCNPs和AuNPs均呈現(xiàn)出良好的分散性，并且顆粒大小相對(duì)均勻、一致，其平均粒徑分別為120，13 nm。當(dāng)體系中不存在雙酚A時(shí)，UCNPs表面的適配體互補(bǔ)鏈會(huì)與金納米粒子表面的適配體發(fā)生特異性結(jié)合，如圖2(c)所示。

從圖3(a)、(b)可觀察到功能化UCNPs和AuNPs均呈正態(tài)分布，說(shuō)明2種材料均呈現(xiàn)良好的分散性且顆粒大小相對(duì)均勻，其平均粒徑分別為92，23 nm，分散性和粒徑均滿足下一步組裝要求。在圖3(c)中顯示，組裝后形成的UCNPs-AuNPs復(fù)合物的平均粒徑分布范圍為30～820 nm，基本對(duì)應(yīng)AuNPs-DNA1和UCNPs-DNA2數(shù)據(jù)的加和，說(shuō)明功能化修飾的UCNPs-DNA2和AuNPs-DNA1通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)生DNA雜交，形成UCNPs-AuNPs復(fù)合物，滿足形成FRET原理中縮短供受體之間的空間距離的要求。

2.3 BPA測(cè)定

通過(guò)BPA與AuNPs表面的適配體特異性結(jié)合改變檢測(cè)體系中功能化納米材料組裝程度，考察不同濃度的鎘離子對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度的影響，由圖4可知，在檢測(cè)體系中加入BPA后，檢測(cè)體系在543 nm處的特征峰熒光強(qiáng)度逐漸提高。由圖5可知，檢測(cè)體系在543 nm處的特征峰值與BPA濃度之間存在線性關(guān)系y=18.967ln(x)+539.36(R2=0.992 3)，檢出限為1×10-10mol/L。

圖2 功能化UCNPs、功能化AuNPs、UCNPs-AuNPs 復(fù)合物的透射電鏡圖

Figure 2 TEM of functionalized UCNPs, functionalized AuNPs, assembled nanocompositec

圖3 功能化UCNPs、功能化AuNPs、UCNPs-AuNPs復(fù)合物的水合粒徑圖Figure 3 DLS of functionalized UCNPs, functionalized AuNPs, assembled nanocompositec

圖4 不同BPA濃度對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射光譜圖

Figuer 4 A typical recording output for the detection of different concentrations of BPA by the developed method

圖5 BPA濃度與543 nm處的熒光信號(hào)強(qiáng)度的線性關(guān)系

Figuer 5 Standard curve of the fluorescence at 543 nm versus BPA concentration by the developed method

2.4 特異性分析

為了評(píng)價(jià)本方法對(duì)雙酚A的檢測(cè)特異性，采用多種BPA結(jié)構(gòu)類似物檢驗(yàn)檢測(cè)體系，如對(duì)苯二甲酸二辛酯(DOTP)、己二酸二(2-乙基己基)酯(DEHA)、雙酚F雙(2,3-二羥基丙基)醚(BFDGE)、雙酚A二(3-氯-2-羥基醚)醚(DOA)、雙酚F縮水甘油醚(BDFGE)、4-辛基酚(4-OP)進(jìn)行了分析檢測(cè)，添加濃度為1 μmol/L，在對(duì)照組中添加BPA(濃度為100 nmol/L)，結(jié)果如圖6所示，1 μmol/L BPA結(jié)構(gòu)類似物回收率均低于5%，說(shuō)明本試驗(yàn)所構(gòu)建的BPA適配體傳感器具有良好的特異性。

圖6 不同BPA結(jié)構(gòu)類似物對(duì)傳感器的影響

Figuer 6 Different fluorescence response of the aptasensor at 543 nm to BPA and different BPA analogs

2.5 回收試驗(yàn)

為了驗(yàn)證所建立的上轉(zhuǎn)換-熒光共振能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的實(shí)用性，本研究對(duì)牛奶和自來(lái)水樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)。在實(shí)際樣品中加入不同濃度的BPA，用本研究建立的上轉(zhuǎn)換-熒光共振能量轉(zhuǎn)移生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1 所示，自來(lái)水的回收率為95.6%～103.1%；經(jīng)過(guò)前處理后牛奶樣品的回收率為91.2%～92.3%，說(shuō)明本研究構(gòu)建的生物傳感器適合用于自來(lái)水和牛奶的分析檢測(cè)。

表1 實(shí)際樣品(自來(lái)水、牛奶)回收率測(cè)定Table 1 Recoveries of BPA

3 結(jié)論

本研究利用雙酚A適配體功能化金納米粒子與適配體互補(bǔ)鏈功能化上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子構(gòu)建了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的雙酚A檢測(cè)方法。方法最低檢測(cè)限為1×10-10mol/L，該方法相比于傳統(tǒng)熒光檢測(cè)方法可以克服樣品中生物組織帶來(lái)的熒光干擾，且前處理簡(jiǎn)單快速，能夠獲得高回收率。為具有生物熒光背景的食品樣品提供一種快速檢測(cè)小分子危害因子的新思路。