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        基于上轉(zhuǎn)換納米粒子與金納米粒子構(gòu)建熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)雙酚A方法研究

        2018-11-02 09:35:00魯士珍陳茂龍朱穎越程云輝
        食品與機(jī)械 2018年9期
        關(guān)鍵詞:能量轉(zhuǎn)移功能化雙酚

        許 宙 魯士珍 陳茂龍 朱穎越 丁 利 程云輝

        (1. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410114;2. 常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500)

        雙酚A是一種固化聚碳酸酯塑料和合成環(huán)氧樹(shù)脂的有機(jī)小分子物質(zhì)[1],其廣泛用于食品包裝容器、奶瓶、包裝材料、餐具和微波爐等的生產(chǎn)[2-3]。但BPA具有不穩(wěn)定性,酸、堿環(huán)境和加熱等因素均會(huì)導(dǎo)致其遷移至所包裝的食品或飲料中[4],使其廣泛存在于環(huán)境和食物鏈。同時(shí),BPA是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,可模擬雌激素的作用與雌激素受體結(jié)合干擾生物體內(nèi)的激素代謝[5-6],從而導(dǎo)致人和動(dòng)物的生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)[7]以及免疫系統(tǒng)等異常,甚至有可能誘發(fā)癌變[8-9]和威脅胎兒及兒童的生長(zhǎng)和發(fā)育,使其出現(xiàn)出生缺陷,不孕、女孩早熟和肥胖等問(wèn)題[10]。

        目前,測(cè)定雙酚A的主要分析方法是高效液相色譜[11]、液—質(zhì)聯(lián)用法、氣相色譜—質(zhì)譜法[12-13]、熒光法[14-15]和酶聯(lián)免疫吸附法[16-17]等,其中常用的分析方法為色譜法和MS技術(shù)。這些技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)雙酚A的高靈敏度分析,但需要專業(yè)人員操作、資本投入高、樣品制備和預(yù)處理復(fù)雜費(fèi)時(shí)等要求限制了其在雙酚A檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用[18-19],且無(wú)法滿足目前對(duì)檢測(cè)技術(shù)高速度、高通量、高便攜性的要求。因此,建立一種樣品前處理簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高的雙酚A快速檢測(cè)方法具有重要意義。

        熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET)是當(dāng)能量供體分子的熒光光譜與能量受體分子的激發(fā)光譜重疊時(shí),2個(gè)熒光分子之間通過(guò)偶極—偶極相互作用發(fā)生非輻射能量躍遷,供體分子激發(fā)態(tài)的能量通過(guò)分子間的電偶極相互作用轉(zhuǎn)移給受體分子基態(tài),從而使能量供體分子的熒光強(qiáng)度減弱或淬滅、出現(xiàn)熒光壽命縮短,與此相反,能量受體分子的熒光強(qiáng)度增加,熒光壽命延長(zhǎng)的現(xiàn)象[20]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移是一種均相分析檢測(cè)技術(shù),具有靈敏度高,選擇性好、操作簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。傳統(tǒng)的熒光供體通常是有機(jī)熒光染料,存在吸收光譜較窄,吸收峰和發(fā)射峰之間的斯托克斯位移較小等缺陷。而上轉(zhuǎn)換熒光納米材料是使用近紅外光(980 nm或者880 nm)作為激發(fā)光源,發(fā)射光在可見(jiàn)光區(qū)域分布,具有寬廣的吸收光譜,斯托克斯位移較大等特點(diǎn),并可以克服生物組織或者復(fù)雜樣品自身熒光干擾,降低了檢測(cè)體系中的信噪比。因此,上轉(zhuǎn)換納米材料是理想的熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系能量供體。

        本研究擬利用適配體核苷酸的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用,驅(qū)動(dòng)適配體功能化AuNPs和適配體互補(bǔ)鏈功能化UCNPs進(jìn)行組裝,將適配體對(duì)BPA的識(shí)別過(guò)程轉(zhuǎn)化為檢測(cè)體系熒光發(fā)射強(qiáng)度變化,建立高選擇性、高靈敏度的BPA檢測(cè)方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與設(shè)備

        YCl3·6H2O(99.99%)、YbCl3·6H2O(99.99%)、ErCl3·6H2O(99.99%)、油酸(OA)、1-十八烯(ODE)、聚丙烯酸(PAA,相對(duì)分子量5 000):北京百靈威科技有限公司;

        1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(suflo-NHS):98%,上海麥克林生化科技有限公司;

        氫氧化鈉、氟化銨、檸檬酸三鈉、氯金酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉:≥99%,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

        氯化鈉、氯化鉀:≥99%,廣東光華科技股份有限公司;

        十二烷基磺酸鈉(SDS):99%,合肥博美生物科技責(zé)任有限公司;

        實(shí)驗(yàn)室用超純水:18.2 MΩ·cm的Millipore制備;

        其他試劑:分析純,市售;

        熒光分光光度計(jì):F96PRO型,上海棱光技術(shù)有限公司;

        激光發(fā)射器:MDL-III-980-2W型,中國(guó)長(zhǎng)春新產(chǎn)品光電技術(shù)有限公司;

        磁力攪拌電熱套:ZNCL-TS型,河南鞏義市宏華儀器設(shè)備有限公司;

        透射電子顯微鏡:JEOLJEM-2100型,日本電子株式會(huì)社;

        紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):UV-1800型,日本島津公司。

        1.2 方法

        1.2.1 水溶性上轉(zhuǎn)換納米材料的制備 按照Li等[17]報(bào)道的合成方法制備油溶性上轉(zhuǎn)換納米材料:稱取YCl3·6H2O 0.236 g、YbCl3·6H2O 0.077 g、ErCl3·6H2O 0.007 g(Ln:78% Y3+、20% Yb3+、2% Er3+;共計(jì)1 mmol)加入到100 mL 三頸燒瓶中,加入4 mL OA和15 mL 1-ODE,1 500 r/min 磁力攪拌同時(shí)逐漸升溫至130 ℃,氮?dú)獗Wo(hù)以除去環(huán)境中的空氣和水蒸氣,進(jìn)一步升溫至160 ℃,至混合物形成均一溶液后自然冷卻至室溫;準(zhǔn)確稱取0.13 g NaOH和0.13 g NH4F溶于10 mL甲醇中,將上述溶液逐滴加入到三頸燒瓶中,磁力攪拌30 min至反應(yīng)體系充分混合,隨后緩慢加熱以蒸發(fā)甲醇,再逐漸升溫至300 ℃,氮?dú)獗Wo(hù)加熱1 h后,溶液自然冷卻,產(chǎn)品用乙醇從溶液中沉淀出來(lái),乙醇/環(huán)己烷(體積比5∶1) 清洗3次,烘干,即得NaY0.78F4:Yb0.2;Er0.02油溶性上轉(zhuǎn)換熒光納米材料。

        油酸包覆的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料由于油酸分子的烴鏈起疏水作用,材料在水中的分散性極差,需要對(duì)該材料表面進(jìn)行PAA修飾。本研究按照Dai等[21]報(bào)道采用配體交換法制備PAA包裹的水溶性上轉(zhuǎn)換熒光納米材料:10 mL PAA分散在乙醇溶液(~20 mL wt 99.8%)中,5 mL OA-UCNPs分散在氯仿(~10 mL wt 99.8% ),然后將乙醇溶液加入到氯仿中,隔夜攪拌。再用乙醇清洗3次,最后將上轉(zhuǎn)換熒光納米材料分散在水中。

        1.2.2 金納米顆粒的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[22]記錄采用檸檬酸三鈉還原氯金酸(HAuCl4)法來(lái)合成金納米顆粒,步驟如下:取超純水97.5 mL以及質(zhì)量濃度為0.412% (10 mmol/L)的HAuCl4溶液2.5 mL加入到有磁性攪拌子的潔凈錐形瓶中,采用磁力加熱攪拌器,攪拌、加熱至沸騰,7~8 min 后,加入質(zhì)量濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液2 mL,溶液從無(wú)色變?yōu)榫萍t色,保持10 min,然后停止加熱,但保持原來(lái)的磁力攪拌狀態(tài);維持15 min后從磁力加熱攪拌器上取下錐形瓶,所得酒紅色液體即為13 nm AuNPs。

        1.2.3 金納米探針的制備 利用BPA適配體取1 mL制備得到的AuNPs溶液高速離心得到AuNPs沉淀,然后分散在1 mL 10 mmol/L pH 7.4 PBS緩沖液中,加入BPA適配體溶液(DNA1)10 μL,振蕩混合后搖床孵育過(guò)夜,反應(yīng)結(jié)束后,溶液用12 000 r/min離心15 min,棄上清,保留底部暗紅色的AuNPs-DNA1探針,重懸于SDS溶液中,于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

        雙酚A適配體序列5端巰基:5-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCAT-CACGGGTTCGCACCA-3。

        1.2.4 上轉(zhuǎn)換熒光納米探針的制備 稱取10 mg PAA修飾的NaYF4:Yb0.2,Er0.02UCNPs(PAA-UCNPs)分散在5 mL 10 mmol/L PBS(pH 7.4)緩沖液中,超聲充分分散,加入200 mmol/L EDC和100 mmol/L sulfo-NHS溶液各100 μL,37 ℃搖床活化2 h。之后加入一定量的BPA適配體互補(bǔ)鏈(DNA2),在37 ℃搖床中孵育過(guò)夜,離心收集材料,用PBS緩沖液清洗3次,將最后得到的核酸適配體互補(bǔ)鏈修飾的功能化UCNPs(UCNPs-DNA2)分散在0.01% SDS溶液中,UCNPs-DNA2的濃度為2 nmol/L。

        互補(bǔ)鏈5端氨基修飾:5-CCCACCTGACCACCCAC CGG-3。

        1.2.5 檢測(cè)體系的構(gòu)建 用超純水配制所需濃度的BPA標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-3,1.0×10-4,1.0×10-5,1.0×10-6,1.0×10-7,1.0×10-8,1.0×10-9mol/L),各取10 μL加入到制備好的功能化金納米探針(AuNPs-DNA1)中,室溫下振蕩孵育3.0 h;離心分離去除未反應(yīng)的雙酚A,水洗3次重懸于500 μL 的0.01%的SDS緩沖液中,制備得AuNPs-DNA1-BPA納米粒子;向上述溶液中加入500 μL制備好的功能化UCNPs(UCNPs-DNA2),混合均勻,室溫下振蕩孵育1.0 h后,用激光發(fā)射器980 nm激發(fā)檢測(cè)體系,紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其在500~700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 檢測(cè)原理

        檢測(cè)原理如圖1所示。通過(guò)BPA適配體功能化修飾的AuNPs與雙酚A發(fā)生特異性識(shí)別,當(dāng)檢測(cè)體系中沒(méi)有BPA存在時(shí),功能化AuNPs與功能化UCNPs通過(guò)DNA雜交作用進(jìn)行結(jié)合;反之,當(dāng)體系中存在BPA時(shí),BPA會(huì)與適配體功能化AuNPs發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,導(dǎo)致功能化AuNPs從UCNPs表面脫落。隨著B(niǎo)PA濃度的升高,功能化UCNPs與功能化AuNPs結(jié)合形成組裝體的程度逐漸降低,使用激光980 nm 激發(fā)檢測(cè)體系,隨著組裝體組裝程度降低,在發(fā)射光543 nm波長(zhǎng)處特征峰的光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),據(jù)此建立基于FRET原理的金納米粒子淬滅上轉(zhuǎn)換熒光的BPA檢測(cè)傳感平臺(tái)。

        圖1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)雙酚A原理圖Figure 1 Schematic diagram of FRET sensor for detection BPA

        2.2 功能化AuNPs和UCNPs納米材料的表征

        透射電鏡分析是納米材料最重要的表征手段之一,可以直觀地反映納米材料的形貌、粒徑和分散性等狀態(tài)。其中,材料粒徑過(guò)大易導(dǎo)致聚沉而無(wú)法滿足檢測(cè)要求;分散性是該傳感器建立的重要條件,直接影響納米材料的功能化修飾和特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果。圖2、3是透射電子顯微鏡(TEM)和水合粒徑儀(DLS)對(duì)適配體功能化AuNPs和互補(bǔ)鏈功能化UCNPs的表征結(jié)果。從圖2可觀察到,功能化UCNPs和AuNPs均呈現(xiàn)出良好的分散性,并且顆粒大小相對(duì)均勻、一致,其平均粒徑分別為120,13 nm。當(dāng)體系中不存在雙酚A時(shí),UCNPs表面的適配體互補(bǔ)鏈會(huì)與金納米粒子表面的適配體發(fā)生特異性結(jié)合,如圖2(c)所示。

        從圖3(a)、(b)可觀察到功能化UCNPs和AuNPs均呈正態(tài)分布,說(shuō)明2種材料均呈現(xiàn)良好的分散性且顆粒大小相對(duì)均勻,其平均粒徑分別為92,23 nm,分散性和粒徑均滿足下一步組裝要求。在圖3(c)中顯示,組裝后形成的UCNPs-AuNPs復(fù)合物的平均粒徑分布范圍為30~820 nm,基本對(duì)應(yīng)AuNPs-DNA1和UCNPs-DNA2數(shù)據(jù)的加和,說(shuō)明功能化修飾的UCNPs-DNA2和AuNPs-DNA1通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)生DNA雜交,形成UCNPs-AuNPs復(fù)合物,滿足形成FRET原理中縮短供受體之間的空間距離的要求。

        2.3 BPA測(cè)定

        通過(guò)BPA與AuNPs表面的適配體特異性結(jié)合改變檢測(cè)體系中功能化納米材料組裝程度,考察不同濃度的鎘離子對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度的影響,由圖4可知,在檢測(cè)體系中加入BPA后,檢測(cè)體系在543 nm處的特征峰熒光強(qiáng)度逐漸提高。由圖5可知,檢測(cè)體系在543 nm處的特征峰值與BPA濃度之間存在線性關(guān)系y=18.967ln(x)+539.36(R2=0.992 3),檢出限為1×10-10mol/L。

        圖2 功能化UCNPs、功能化AuNPs、UCNPs-AuNPs 復(fù)合物的透射電鏡圖

        Figure 2 TEM of functionalized UCNPs, functionalized AuNPs, assembled nanocompositec

        圖3 功能化UCNPs、功能化AuNPs、UCNPs-AuNPs復(fù)合物的水合粒徑圖Figure 3 DLS of functionalized UCNPs, functionalized AuNPs, assembled nanocompositec

        圖4 不同BPA濃度對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射光譜圖

        Figuer 4 A typical recording output for the detection of different concentrations of BPA by the developed method

        圖5 BPA濃度與543 nm處的熒光信號(hào)強(qiáng)度的線性關(guān)系

        Figuer 5 Standard curve of the fluorescence at 543 nm versus BPA concentration by the developed method

        2.4 特異性分析

        為了評(píng)價(jià)本方法對(duì)雙酚A的檢測(cè)特異性,采用多種BPA結(jié)構(gòu)類似物檢驗(yàn)檢測(cè)體系,如對(duì)苯二甲酸二辛酯(DOTP)、己二酸二(2-乙基己基)酯(DEHA)、雙酚F雙(2,3-二羥基丙基)醚(BFDGE)、雙酚A二(3-氯-2-羥基醚)醚(DOA)、雙酚F縮水甘油醚(BDFGE)、4-辛基酚(4-OP)進(jìn)行了分析檢測(cè),添加濃度為1 μmol/L,在對(duì)照組中添加BPA(濃度為100 nmol/L),結(jié)果如圖6所示,1 μmol/L BPA結(jié)構(gòu)類似物回收率均低于5%,說(shuō)明本試驗(yàn)所構(gòu)建的BPA適配體傳感器具有良好的特異性。

        圖6 不同BPA結(jié)構(gòu)類似物對(duì)傳感器的影響

        Figuer 6 Different fluorescence response of the aptasensor at 543 nm to BPA and different BPA analogs

        2.5 回收試驗(yàn)

        為了驗(yàn)證所建立的上轉(zhuǎn)換-熒光共振能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的實(shí)用性,本研究對(duì)牛奶和自來(lái)水樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)。在實(shí)際樣品中加入不同濃度的BPA,用本研究建立的上轉(zhuǎn)換-熒光共振能量轉(zhuǎn)移生物傳感器進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如表1 所示,自來(lái)水的回收率為95.6%~103.1%;經(jīng)過(guò)前處理后牛奶樣品的回收率為91.2%~92.3%,說(shuō)明本研究構(gòu)建的生物傳感器適合用于自來(lái)水和牛奶的分析檢測(cè)。

        表1 實(shí)際樣品(自來(lái)水、牛奶)回收率測(cè)定Table 1 Recoveries of BPA

        3 結(jié)論

        本研究利用雙酚A適配體功能化金納米粒子與適配體互補(bǔ)鏈功能化上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子構(gòu)建了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的雙酚A檢測(cè)方法。方法最低檢測(cè)限為1×10-10mol/L,該方法相比于傳統(tǒng)熒光檢測(cè)方法可以克服樣品中生物組織帶來(lái)的熒光干擾,且前處理簡(jiǎn)單快速,能夠獲得高回收率。為具有生物熒光背景的食品樣品提供一種快速檢測(cè)小分子危害因子的新思路。

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