梁棟，李維茹，鐘沛文，徐禮江

(佛山市第一人民醫(yī)院，廣東佛山528000)

近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。目前認(rèn)為，子宮內(nèi)膜癌形成是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過程，其具體機(jī)制尚不完全清楚。溶酶體相關(guān)4次跨膜蛋白B(LAPTM4B)是一種癌基因，尤其LAPTM4B-35，在多種腫瘤組織中過表達(dá)[1]。富亮氨酸α2糖蛋白1(LRG1)屬于富亮氨酸重復(fù)家族成員，可參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β通路活性，促進(jìn)新生血管生成，尤其是腫瘤血管生成[2]。目前關(guān)于LAPTM4B-35、LRG1在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中作用的研究甚少。本研究觀察了子宮內(nèi)膜癌組織LAPTM4B-35、LRG1表達(dá)變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，旨在探討二者在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 臨床資料

選擇2010年1月～2012年12月佛山市第一人民醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜癌患者86例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均行手術(shù)治療，術(shù)后組織病理檢查明確診斷為子宮漿液性癌或內(nèi)膜樣癌；②首次發(fā)??；③術(shù)前未行任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮和卵巢雙發(fā)癌且不能確定原發(fā)灶；②合并全身感染、其他惡性腫瘤以及嚴(yán)重肝腎功能不全；③術(shù)前行抗腫瘤治療?；颊吣挲g34～76(54.39±14.32)歲，其中≤50歲35例、>50歲51例；病理類型：腺癌65例，其他類型21例；臨床分期(FIGO分期)：Ⅰ期59例，Ⅱ、Ⅲ期27例；組織分化程度：高分化32例，中分化27例，低分化27例；浸潤深度：≤1/2肌層61例，>1/2肌層患者25例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例。本研究經(jīng)佛山市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬均知情同意。

2 方法與結(jié)果

2.2 子宮內(nèi)膜癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織LAPTM4B-35、LRG1 mRNA表達(dá)檢測 取手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌組織及其配對(duì)的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>2.0 cm，經(jīng)組織病理檢查證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜組織)各86例份，按TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.1，滿足實(shí)驗(yàn)要求。取總RNA 0.5 μg，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-80 ℃冰箱保存。引物序列：LAPTM4B-35上游引物5′-GCCCGGAGCGATGAAGATG-3′，下游引物5′-CAACAGTACCACAGCATTGATGA-3′；LRG1上游引物5′-AGAACCTGAGCGACCTCTATC-3′，下游引物5′-CACAGCGCGTGTCATTCTG-3′；GAPDH上游引物5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′，下游引物5′-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3′。PCR反應(yīng)體系共10 μL：2×SYBR Mixture 5 μL，上下游引物各0.25 μL，cDNA 0.4 μL，ddH2O 4.1 μL；反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)熱2 min，95 ℃ 3 min，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s、95 ℃ 15 s共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁正常組織LAPTM4B-35 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.42±1.32、1.21±0.43，LRG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為4.18±1.65、1.18±0.21。子宮內(nèi)膜癌組織LAPTM4B-35、LRG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于癌旁正常組織(t分別為12.216、13.323，P均<0.05)。以LAPTM4B-35、LRG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)(3.42、4.18)為界值，將患者分為LAPTM4B-35、LRG1高表達(dá)者與低表達(dá)者。其中，LAPTM4B-35高表達(dá)者45例、低表達(dá)者41例，LRG1高表達(dá)者43例、低表達(dá)者43例。

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織LAPTM4B-35、LRG1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌組織LAPTM4B-35 mRNA表達(dá)與臨床分期、組織病理分級(jí)、浸潤深度有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)；子宮內(nèi)膜癌組織LRG1 mRNA表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、病理類型、組織病理分級(jí)和浸潤深度無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織LAPTM4B-35、LRG1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 子宮內(nèi)膜癌組織LAPTM4B-35、LRG1 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 術(shù)后采用電話或門診復(fù)查方式隨訪，隨訪時(shí)間以術(shù)后出院為起點(diǎn)，隨訪60個(gè)月，以患者死亡或隨訪時(shí)間結(jié)束為終點(diǎn)。隨訪時(shí)間1～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為46個(gè)月。LAPTM4B-35低表達(dá)者與高表達(dá)者術(shù)后5年生存率分別為90.24%(37/41)、66.67%(30/45)，術(shù)后生存時(shí)間分別為(49.20±9.46)、(30.60±17.21)個(gè)月，二者比較P均<0.05。LRG1低表達(dá)者與高表達(dá)者術(shù)后5年生存率分別為88.37%(38/43)、67.44%(29/43)，術(shù)后生存時(shí)間分別為(50.21±7.44)、(28.28±18.05)個(gè)月，二者比較P均<0.05。見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜癌組織LAPTM4B-35、LRG1 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

LAPTM4B基因是一種與肝細(xì)胞癌相關(guān)的癌基因，定位于人染色體8q22.1，含有2個(gè)等位基因，可編碼2種蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量分別為35、24 kDa。研究發(fā)現(xiàn)，LAPTM4B基因多態(tài)性與胃癌、子宮內(nèi)膜癌等易感性有關(guān)[3，4]。LAPTM4B能激活PI3K/Akt信號(hào)通路，通過調(diào)節(jié)下游信號(hào)分子活性而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[5]。LAPTM4B還可參與細(xì)胞周期蛋白基因、p53基因的表達(dá)和功能調(diào)控，發(fā)揮促癌基因作用。LAPTM4B-35(NP 060877)蛋白是由LAPTM4B(NM 018407)基因編碼、由317個(gè)氨基酸殘基組成的、相對(duì)分子質(zhì)量約為35 kDa的跨膜蛋白[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤中LAPTM4B-35表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系，而與腫瘤組織分化程度、患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[8，9]；LAPTM4B-35可能通過調(diào)控MMP-9基因表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移，誘導(dǎo)腫瘤惡性進(jìn)展[10]。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織LAPTM4B-35 mRNA表達(dá)增加，提示在子宮內(nèi)膜癌形成過程中LAPTM4B-35可能發(fā)揮癌基因作用，與其在其他惡性腫瘤形成中的作用類似。LAPTM4B-35 mRNA表達(dá)與腫瘤病理類型、臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明LAPTM4B-35可能參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，LAPTM4B-35高表達(dá)者術(shù)后5年生存率明顯低于LAPTM4B-35低表達(dá)者，提示LAPTM4B-35高表達(dá)者預(yù)后較差，與其在前列腺癌、胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤中一致[11，12]。

LRG1于1977年從人類血清中首次分離出來，其基因定位于人染色體19p13.3，由312個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約45 kDa。LRG1蛋白又稱富亮氨酸α2糖蛋白1，屬于富亮氨酸重復(fù)家族蛋白類的高度保守因子，可參與蛋白間相互作用，在多種信號(hào)傳導(dǎo)等生理過程中發(fā)揮重要作用，如LRG1可通過TGF-β信號(hào)通路促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和腫瘤新生血管形成。研究證實(shí)，LRG1能夠促進(jìn)血管生成，其較少參與正常血管生成，主要是對(duì)異常血管生長起作用，并在免疫應(yīng)答、粒細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖或凋亡、細(xì)胞黏附等生理過程中發(fā)揮重要作用。LRG1在毛細(xì)血管靜脈中異常表達(dá)，并趨向與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合，與多種惡性腫瘤的形成密切相關(guān)，如消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等惡性腫瘤[13，14]。LRG1高表達(dá)可顯著促進(jìn)腫瘤血管生成，其分子機(jī)制主要為通過調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路來發(fā)揮作用，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中均具有重要作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織LRG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織。說明LRG1可參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，LRG1 mRNA表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且LRG1高表達(dá)者術(shù)后5年總生存率明顯低于LRG1低表達(dá)者。因此推測，LRG1可能通過促進(jìn)腫瘤血管形成，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織LAPTM4B-35、LRG1過表達(dá)，二者表達(dá)變化可能與患者病情進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)。LAPTM4B-35、LRG1有可能成為子宮內(nèi)膜癌患者病情判斷和預(yù)后預(yù)測的腫瘤分子標(biāo)志物。