張琛琳，陳 思，陳劍峰，*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江蘇 210046

2.無錫市中醫(yī)醫(yī)院骨科，江蘇 214000

腰椎椎間盤突出癥是臨床上常見的腰部疾患，腰椎椎間盤纖維環(huán)在退行性變或外力的作用下出現(xiàn)裂隙，使得其包繞的髓核組織向后方突出，刺激、壓迫脊髓神經(jīng)根，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)根出現(xiàn)炎癥、營養(yǎng)障礙，引起腰臀部及下肢的的酸麻疼痛，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)影響患者日常活動(dòng)，甚至出現(xiàn)二便失禁等馬尾神經(jīng)癥狀。腰椎椎間盤突出癥的發(fā)生機(jī)制尚未明確，目前公認(rèn)的機(jī)制主要有機(jī)械壓迫、化學(xué)性神經(jīng)根炎、椎間盤自身免疫3種觀點(diǎn)［1］。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基因多態(tài)性和基因突變與疾病發(fā)生的關(guān)聯(lián)受到關(guān)注。間隙性連接蛋白37（CX37）是一種可在細(xì)胞膜上形成間隙連接通道供細(xì)胞間直接信息交流的連接蛋白，它的異常與炎性反應(yīng)介導(dǎo)的疾病相關(guān)［2］。本研究對(duì)10例腰椎椎間盤突出癥患者及8例腰椎爆裂骨折患者（椎間盤部分損壞，無明顯退變）的椎間盤進(jìn)行影像學(xué)觀察、CX37和炎癥因子檢測(cè)，探討CX37在腰椎椎間盤突出癥炎性反應(yīng)中的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2014—2016年本院收治的10例腰椎椎間盤突出癥手術(shù)患者作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20 ～ 75歲；②符合腰椎椎間盤突出癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］；③CT、MRI顯示腰椎椎間盤突出。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他嚴(yán)重的器質(zhì)性病變，包括惡性腫瘤、骨折、腰椎滑脫等；②合并有心血管、肝、腎等系統(tǒng)嚴(yán)重原發(fā)性疾??；③精神疾病患者、治療不合作或同時(shí)進(jìn)行其他治療者。選擇腰椎爆裂骨折且MRI顯示椎間盤無明顯退行性變的8例患者作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。記錄患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、雙側(cè)大腿圍差值等基本信息。

1.2 影像學(xué)檢查

CT掃描層厚為3 mm，間距為1 mm，觀察患者椎間盤突出部位，分析是否有神經(jīng)根受壓。患者仰臥位進(jìn)行腰椎MRI檢查，攝橫斷面和矢狀面圖像，層厚為5 mm，評(píng)估患者脊髓是否存在變性。根據(jù)患者M(jìn)RI T2加權(quán)像進(jìn)行Pfirrmann分級(jí)［4］：Ⅰ級(jí)，椎間盤高度正常，組織信號(hào)均勻，髓核與纖維環(huán)分界清楚；Ⅱ級(jí)，椎間盤高度正常，椎間盤內(nèi)稍有不均勻結(jié)構(gòu)，髓核與纖維環(huán)分界清楚；Ⅲ級(jí)，椎間盤的高度與正常椎間盤相比輕度降低，椎間盤內(nèi)有不均勻結(jié)構(gòu)，信號(hào)欠均勻，纖維環(huán)與髓核分界不清；Ⅳ級(jí)，椎間盤的高度與正常椎間盤相比中度降低，椎間盤內(nèi)有不均勻結(jié)構(gòu)，椎間盤內(nèi)有低信號(hào)，髓核與纖維環(huán)界限基本消失；Ⅴ級(jí)，椎間盤高度重度降低，椎間盤內(nèi)有低信號(hào)與不均勻結(jié)構(gòu)，髓核與纖維環(huán)界限消失，椎間盤塌陷。Pfirrmann分級(jí)由2名醫(yī)師獨(dú)立完成，將2名醫(yī)師的分析結(jié)果行Kappa一致性檢驗(yàn)，意見不一致時(shí)由第3名醫(yī)師確定最終結(jié)果。

1.3 標(biāo)本采集與檢測(cè)

觀察組患者通過椎間盤摘除術(shù)取出椎間盤組織，對(duì)照組患者通過減壓手術(shù)取出少量損傷椎間盤。將取出的髓核組織用生理鹽水沖洗后置于液氮集中保存。采用PCR方法檢測(cè)髓核組織中CX37、IL-6與TNF-α的mRNA表達(dá)水平。提取髓核組織中的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：β-actin上游引物為5′-CACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游引物為5′-GTAGTCTGTCAGGTCCCG-3′；CX37上游引物為5′-CCTCCTCAGACCCTTACACGG-3′，下游引物為5′-CATCCCAGGCAGCCAGACT-3′；IL-6上游引物為5′-AAATCCCTCCTCGCCAATCT-3′，下游引物為5′-CCCTCACGGTCTTCTCCATAAA-3′；TNF-α上游引物為5′-ATCCGCGACGTGGAACTG-3′，下游引物為5′-ACCGCCTGGAGTTCTGGAA-3′。PCR 反應(yīng)程序 ：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算各目的基因在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)比較組間差異，以P ＜ 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson法分析CX37與IL-6、TNF-α表達(dá)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2組患者一般資料見表1。2組患者年齡、性別、BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05，表1）；觀察組雙下肢大腿圍差值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，表1）。

2.2 影像學(xué)特征分析

CT顯示8例腰椎爆裂骨折患者均有不同程度的椎間盤損傷（圖1a）；10例腰椎椎間盤突出癥患者中，有4例出現(xiàn)髓核脫垂，5例出現(xiàn)髓核突出壓迫硬膜囊（圖1b），1例出現(xiàn)后緣銳角。MRI顯示8例腰椎爆裂骨折患者中，6例椎間盤損傷、硬膜囊完整，2例出現(xiàn)椎間盤向后突出、硬膜囊稍有受壓（圖1c）；10例腰椎椎間盤突出癥患者均可見椎間盤明顯突出（圖1d），有4例出現(xiàn)髓核脫垂，4例邊緣不規(guī)則，2例椎間盤有變性。經(jīng)Pfirrmann分級(jí)，對(duì)照組Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí)2例；觀察組Ⅲ級(jí)3例，Ⅳ級(jí)3例，Ⅴ級(jí)4例。

表1 一般資料Tab.1 General data

圖1 2組患者CT和MRIFig.1 CT and MRI imaging in 2 groups

2.3 髓核組織中CX37、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)

PCR結(jié)果顯示觀察組CX37、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，圖2）。

圖2 髓核組織中CX37、IL-6和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression quantity of CX37，IL-6 and TNF-α mRNA in nucleus pulposus

2.4 Pearson相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，炎癥因子IL-6，TNF-α與CX37均呈正相關(guān)（表2）。

表2 炎癥因子IL-6，TNF-α與CX37相關(guān)性Tab.2 Correlation between inflammatory factors IL-6，TNF-α and CX37

3 討 論

間隙連接蛋白（CX）是指相鄰細(xì)胞間的跨膜離子及低分子通道中組成連接子的功能一致的亞單位，其通過細(xì)胞間隙連接通訊（GJIC），將細(xì)胞質(zhì)膜上的環(huán)狀連接子橫向移動(dòng)到相鄰細(xì)胞的邊緣，并與相鄰細(xì)胞中的對(duì)應(yīng)物對(duì)接，形成細(xì)胞間通道［5-7］。CX37是目前發(fā)現(xiàn)的20余種CX中的一種，通常在內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞中表達(dá)［8］，前期在動(dòng)脈粥樣硬化的研究中發(fā)現(xiàn)，CX37通過GJIC使得腺苷與內(nèi)皮細(xì)胞和某些炎性細(xì)胞表面的受體結(jié)合而具有抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用；CX37缺陷的單核細(xì)胞可減少腺苷的產(chǎn)生，促進(jìn)小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，有利于促炎性環(huán)境的形成［9-12］。Chanson等［2］認(rèn)為CX37是炎性疾病的潛在修飾基因，巨噬細(xì)胞之間的間隙連接主要是基于電耦聯(lián)，通過染料轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證巨噬細(xì)胞與其他細(xì)胞的間隙連接時(shí)發(fā)現(xiàn)，CX37在單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞中存在染料轉(zhuǎn)移。至于CX37與腰椎椎間盤突出癥引起的炎性反應(yīng)是否有關(guān)，本研究組前期的研究發(fā)現(xiàn)腰椎椎間盤突出癥的發(fā)生與CX37基因的CC基因型和C等位基因頻率（CC+CT）增高有關(guān)，提示CC+CT增高可能與突出的髓核物質(zhì)中所含的內(nèi)源性化學(xué)炎性介質(zhì)有關(guān)［13］。

腰椎椎間盤突出癥中，發(fā)生退行性變的椎間盤往后突出，壓迫神經(jīng)根與硬膜囊，局部產(chǎn)生神經(jīng)根炎，從而導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)的發(fā)生。一方面，腰部炎性反應(yīng)的產(chǎn)生將會(huì)不同程度地限制患側(cè)下肢活動(dòng)，造成腰部及患側(cè)下肢肌肉退化，出現(xiàn)下肢肌肉控制能力的減退，長(zhǎng)此以往會(huì)形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致患側(cè)下肢肌肉進(jìn)行性萎縮［14］；本研究發(fā)現(xiàn)觀察組患者的雙下肢大腿圍差值明顯大于對(duì)照組，證實(shí)了腰椎椎間盤突出癥患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的患側(cè)下肢肌肉萎縮。另一方面，McCarron等［15］研究發(fā)現(xiàn)，突出物邊緣區(qū)域是以新生血管形成和巨噬細(xì)胞浸潤為主的肉芽組織，病灶附近常存在充血、炎性反應(yīng)，突出的髓核中所含的內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)會(huì)引起炎性反應(yīng)，并且存在以巨噬細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤。本研究發(fā)現(xiàn)，CT、MRI影像結(jié)果顯示2組患者椎間盤及脊髓的形態(tài)存在差異，部分椎間盤突出癥患者的髓核突出，壓迫硬膜囊，且對(duì)照組患者椎間盤Pfirrmann分級(jí)為Ⅰ或Ⅱ級(jí)，觀察組患者椎間盤Pfirrmann分級(jí)為Ⅲ～Ⅴ級(jí)，說明腰椎椎間盤突出癥患者椎間盤均發(fā)生明顯的退行性變，壓迫硬膜囊導(dǎo)致炎性反應(yīng)的產(chǎn)生。

Mochida等［16］研究認(rèn)為，正常椎間盤中不存在巨噬細(xì)胞，當(dāng)椎間盤組織突出暴露于硬膜外后，可將血管撕破，刺激新生血管中的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞長(zhǎng)入突出組織內(nèi)進(jìn)行吞噬。巨噬細(xì)胞分泌某些生物活性物質(zhì)，如IL-1、IL-6、TNF等也參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，并且有著明顯的致痛覺過敏作用。張威林等［17］亦認(rèn)為炎性成分可導(dǎo)致椎間盤發(fā)生退行性變，其中IL-6、TNF等炎癥因子的表達(dá)在椎間盤退行性變過程中顯著增高。

TNF-α是最早出現(xiàn)且最重要的炎性因子，能激活中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞從而參與炎性反應(yīng)；IL-6主要由T細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，其通過影響細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖、膠原及機(jī)體免疫應(yīng)答促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生［18］。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組髓核組織中IL-6與TNF-α水平明顯高于對(duì)照組，表明確有炎性反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)CX37水平也明顯高于對(duì)照組，且與炎癥因子IL-6，TNF-α呈正相關(guān)。分析其原因可能是，在炎性反應(yīng)過程中隨著巨噬細(xì)胞的釋放，CX37的表達(dá)明顯增高［2］，而巨噬細(xì)胞同時(shí)會(huì)分泌IL-6、TNF-α等炎性因子共同參與炎性反應(yīng)；CX37可能通過GJIC使得巨噬細(xì)胞與某些炎性細(xì)胞表面的受體結(jié)合而使炎性反應(yīng)加劇。

綜上所述，CX37可能通過GJIC調(diào)控炎性因子參與腰椎椎間盤突出癥炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。但本研究樣本量較小，本課題組正在進(jìn)一步收集資料，將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行后續(xù)研究，探索CX37與腰椎椎間盤突出癥炎性反應(yīng)之間的具體機(jī)制，為腰椎椎間盤突出癥的機(jī)制研究及臨床診治提供依據(jù)。