李遠棟，王 平，張君濤，楊 光，張雪竹

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300383）

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP） 是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)破壞，導致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病（世界衛(wèi)生組織 WHO）[1-2]。對中老年人及絕經(jīng)后女性身體健康有著嚴重威脅，且因骨質(zhì)疏松導致的骨折發(fā)生率在逐年上升[3]，故骨質(zhì)疏松癥防治機制研究是眾多學者的工作重點，而對于瘦素（Leptin）的研究就是重要的一方面，并且近些年在骨代謝方面研究已成為新的熱點，可能為防治骨質(zhì)疏松癥提供新的研究思路[4-5]。本實驗利用增齡性骨質(zhì)疏松動物模型SAMP6鼠，觀察院內(nèi)制劑榮筋片對SAMP6鼠瘦素血清含量水平及骨組織蛋白表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑榮筋片主要組成為牛膝、白蒺藜、陳皮、杜仲、茯苓、甘草等（批號：津藥制字（2001）Z 第 0195號）。羊抗兔二抗、B-ACTIN一抗（天津盛順生物試劑銷售有限公司），PVDF膜、BCA蛋白定量試劑盒（天津金博星生物科技有限公司）。Sigma 3C15K型高速冷凍離心機購自美國，分光光度計購自上海精密科學儀器有限公司（型號：722），勻漿機購自德國（型號：Heidolph DIAX90），UV300核酸蛋白分析儀購自英國（型號：PYE-UNICAM／SPECTRONIC），細胞超聲粉碎儀購自上海超聲波儀器廠（型號：CPS-1）。選取6月齡SAMP6鼠30只，按體質(zhì)量隨機分為SAMP6榮筋片組、空白對照組，同源對照組選取同月齡SAMR1鼠15只。

1.2 方法

1.2.1 灌胃方法 為保證藥物充分吸收，使小鼠空腹達6 nh以上。按人每kg體質(zhì)量用藥劑量計算，小鼠用藥劑量與人用藥劑量折算系數(shù)W＝9.01，故小鼠用藥劑量（g/kg）計算公式應(yīng)為：人常用劑量（g/kg）xW[6]。榮筋片組給予3 mL藥液灌胃，空白對照組給予3 mL生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)12周。

1.2.2 制備血清 在最后一次灌胃1 h后將小鼠摘眼球采血，不予抗凝并待血塊自然凝固收縮后1 500 rpm離心15 min，然后將分離出的上層血清保存在- 20 ℃下，用于酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定血清中瘦素（Leptin）的含量水平。

1.2.3 制備骨髓涂片 充分暴露小鼠股骨后將其剪斷，利用鑷子擠出或挑出骨髓，并將其放置于載玻片上，然后通過推玻片使骨髓液沿其邊緣散開，在維持30°～45°角的情況下將推玻片平穩(wěn)的推到載玻片另一邊[7]，待涂片干燥后染色，每個標本制作一張圖片。以便通過免疫組化測定骨組織中Leptin蛋白的表達水平。

1.2.4 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)利用 SPSS 17.0 軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x± s ）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血清Leptin含量水平的比較 榮筋片組、SAMRl對照組血清瘦素含量水平明顯高于空白對照組（P＜0.05），有顯著性差異；榮筋片組和SAMRl對照組組間沒有顯著性差異。見表1。

表1 各組血清Leptin含量（x± s ）

2.2 骨組織Leptin蛋白表達水平的比較 榮筋片組、SAMRl對照組骨組織瘦素蛋白表達水平明顯高于空白對照組（P＜0.05），有顯著性差異；榮筋片組和SAMRl對照組組間沒有顯著性差異。見表2。

表2 骨組織Leptin蛋白表達的平均光密度（x± s ）

3 討論

“骨質(zhì)疏松癥”病名并沒有在祖國醫(yī)學記載，其臨床表現(xiàn)及發(fā)病機理與中醫(yī)學的“骨病”相似，故可以參考中醫(yī)學的“骨痿”“骨痹”而辨證論治[8-9]?！端貑枴ば魑鍤馄吩唬骸澳I主骨”，《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰：“腎生骨髓”，《素問·六節(jié)藏象論》曰“腎其充在骨”[10-11]。故中醫(yī)學認為骨病多源于腎虛，腎精虛則生化無源，骨失所養(yǎng)，則易骨斷；腎精足則骨有所養(yǎng)，骨骼強健。所以中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥多以補腎為主[12-13]。

院內(nèi)制劑榮筋片是由我院骨傷科已故名老中醫(yī)葉希賢主任所創(chuàng)立,具有補益肝腎，強健筋骨功效，在臨床中已證實治療骨質(zhì)疏松癥有較好的療效[14]，藥物組成中杜仲補益肝腎，強筋壯骨,沙苑子、續(xù)斷補益肝腎，肝腎精氣足，則筋骨強；熟地養(yǎng)陰補血，填精益髓，精足則髓足，髓足則骨強。四藥共奏補益肝腎，強筋壯骨之功而為君藥。山藥滋養(yǎng)脾胃，平補三焦的作用，與茯苓、陳皮行氣健脾而合為臣藥，共奏運化脾胃之功。榮筋片中佐藥則為丹參、當歸、雞血藤，起到養(yǎng)血活血通絡(luò)之用。牛膝、蒺藜和甘草合為使藥而共奏引經(jīng)、調(diào)和諸藥之效。全方腎氣足，則精血足，精血足則髓足，髓足則骨健，共奏補益肝腎，強筋壯骨之效。

本實驗結(jié)果表明，榮筋片能夠提高血清瘦素含量和骨組織蛋白表達水平，可能會改善自發(fā)性骨質(zhì)疏松動物骨髓基質(zhì)干細胞成骨-成脂分化瘦素水平的異常。

SAMP6 鼠能夠很好地體現(xiàn)增齡性骨質(zhì)疏松癥的病理機制，是研究骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制及制定有效防治方案的理想模型[15-16]。故近些年來多數(shù)學者利用此模型研究骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機理。

眾多學者注重運用補腎中藥辨證論治對骨質(zhì)疏松癥整體調(diào)節(jié)，并顯示出獨特性，有望替代其他藥物治療骨質(zhì)疏松癥，其充分運用MSCs具有向脂肪細胞和成骨細胞方向分化的雙向分化潛能特點[17-18]，以補腎為主的中藥通過抑制MSCs向脂肪細胞分化、促進MSCs向成骨細胞分化及誘導脂肪細胞轉(zhuǎn)化為成骨細胞[19-20]，腎精充足，則骨髓得以滋養(yǎng)，骨骼強健，故可以防治骨質(zhì)疏松癥。

瘦素受體是刺激腹內(nèi)側(cè)下丘腦降低骨髓脂肪細胞使細胞凋亡作用而降低骨髓脂肪[21-22]。本實驗中小鼠的血清Leptin含量水平及骨組織Leptin蛋白表達水平均得到提高，但基于瘦素直接作用于MSCs或者間接作用中樞調(diào)節(jié)系統(tǒng)不同層次調(diào)節(jié)成骨-成脂分化機理[23-24]，榮筋片是中樞調(diào)節(jié)影響MSCs分化，還是直接作用MSCs促進向成骨細胞分化，抑制其向脂肪細胞分化[25]，需更進一步研究。并且中醫(yī)藥對抗骨質(zhì)疏松癥的機制研究還存在局限性。所以，應(yīng)運用現(xiàn)代科學技術(shù)對中醫(yī)藥進行更深入的研究，為中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的機制提供充分的證據(jù)。