李遠(yuǎn)棟,王 平,張君濤,楊 光,張雪竹
(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,天津 300383)
骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP) 是一種以骨量低下,骨微結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致骨脆性增加,易發(fā)生骨折為特征的全身性骨?。ㄊ澜缧l(wèi)生組織 WHO)[1-2]。對中老年人及絕經(jīng)后女性身體健康有著嚴(yán)重威脅,且因骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折發(fā)生率在逐年上升[3],故骨質(zhì)疏松癥防治機(jī)制研究是眾多學(xué)者的工作重點,而對于瘦素(Leptin)的研究就是重要的一方面,并且近些年在骨代謝方面研究已成為新的熱點,可能為防治骨質(zhì)疏松癥提供新的研究思路[4-5]。本實驗利用增齡性骨質(zhì)疏松動物模型SAMP6鼠,觀察院內(nèi)制劑榮筋片對SAMP6鼠瘦素血清含量水平及骨組織蛋白表達(dá)水平的影響。
1.1 材料 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑榮筋片主要組成為牛膝、白蒺藜、陳皮、杜仲、茯苓、甘草等(批號:津藥制字(2001)Z 第 0195號)。羊抗兔二抗、B-ACTIN一抗(天津盛順生物試劑銷售有限公司),PVDF膜、BCA蛋白定量試劑盒(天津金博星生物科技有限公司)。Sigma 3C15K型高速冷凍離心機(jī)購自美國,分光光度計購自上海精密科學(xué)儀器有限公司(型號:722),勻漿機(jī)購自德國(型號:Heidolph DIAX90),UV300核酸蛋白分析儀購自英國(型號:PYE-UNICAM/SPECTRONIC),細(xì)胞超聲粉碎儀購自上海超聲波儀器廠(型號:CPS-1)。選取6月齡SAMP6鼠30只,按體質(zhì)量隨機(jī)分為SAMP6榮筋片組、空白對照組,同源對照組選取同月齡SAMR1鼠15只。
1.2 方法
1.2.1 灌胃方法 為保證藥物充分吸收,使小鼠空腹達(dá)6 nh以上。按人每kg體質(zhì)量用藥劑量計算,小鼠用藥劑量與人用藥劑量折算系數(shù)W=9.01,故小鼠用藥劑量(g/kg)計算公式應(yīng)為:人常用劑量(g/kg)xW[6]。榮筋片組給予3 mL藥液灌胃,空白對照組給予3 mL生理鹽水灌胃,每天1次,連續(xù)12周。
1.2.2 制備血清 在最后一次灌胃1 h后將小鼠摘眼球采血,不予抗凝并待血塊自然凝固收縮后1 500 rpm離心15 min,然后將分離出的上層血清保存在- 20 ℃下,用于酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定血清中瘦素(Leptin)的含量水平。
1.2.3 制備骨髓涂片 充分暴露小鼠股骨后將其剪斷,利用鑷子擠出或挑出骨髓,并將其放置于載玻片上,然后通過推玻片使骨髓液沿其邊緣散開,在維持30°~45°角的情況下將推玻片平穩(wěn)的推到載玻片另一邊[7],待涂片干燥后染色,每個標(biāo)本制作一張圖片。以便通過免疫組化測定骨組織中Leptin蛋白的表達(dá)水平。
1.2.4 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)利用 SPSS 17.0 軟件分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x± s )表示,組間比較采用單因素方差分析。
2.1 血清Leptin含量水平的比較 榮筋片組、SAMRl對照組血清瘦素含量水平明顯高于空白對照組(P<0.05),有顯著性差異;榮筋片組和SAMRl對照組組間沒有顯著性差異。見表1。
表1 各組血清Leptin含量(x± s )
2.2 骨組織Leptin蛋白表達(dá)水平的比較 榮筋片組、SAMRl對照組骨組織瘦素蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組(P<0.05),有顯著性差異;榮筋片組和SAMRl對照組組間沒有顯著性差異。見表2。
表2 骨組織Leptin蛋白表達(dá)的平均光密度(x± s )
“骨質(zhì)疏松癥”病名并沒有在祖國醫(yī)學(xué)記載,其臨床表現(xiàn)及發(fā)病機(jī)理與中醫(yī)學(xué)的“骨病”相似,故可以參考中醫(yī)學(xué)的“骨痿”“骨痹”而辨證論治[8-9]?!端貑枴ば魑鍤馄吩唬骸澳I主骨”,《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰:“腎生骨髓”,《素問·六節(jié)藏象論》曰“腎其充在骨”[10-11]。故中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨病多源于腎虛,腎精虛則生化無源,骨失所養(yǎng),則易骨斷;腎精足則骨有所養(yǎng),骨骼強(qiáng)健。所以中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥多以補(bǔ)腎為主[12-13]。
院內(nèi)制劑榮筋片是由我院骨傷科已故名老中醫(yī)葉希賢主任所創(chuàng)立,具有補(bǔ)益肝腎,強(qiáng)健筋骨功效,在臨床中已證實治療骨質(zhì)疏松癥有較好的療效[14],藥物組成中杜仲補(bǔ)益肝腎,強(qiáng)筋壯骨,沙苑子、續(xù)斷補(bǔ)益肝腎,肝腎精氣足,則筋骨強(qiáng);熟地養(yǎng)陰補(bǔ)血,填精益髓,精足則髓足,髓足則骨強(qiáng)。四藥共奏補(bǔ)益肝腎,強(qiáng)筋壯骨之功而為君藥。山藥滋養(yǎng)脾胃,平補(bǔ)三焦的作用,與茯苓、陳皮行氣健脾而合為臣藥,共奏運化脾胃之功。榮筋片中佐藥則為丹參、當(dāng)歸、雞血藤,起到養(yǎng)血活血通絡(luò)之用。牛膝、蒺藜和甘草合為使藥而共奏引經(jīng)、調(diào)和諸藥之效。全方腎氣足,則精血足,精血足則髓足,髓足則骨健,共奏補(bǔ)益肝腎,強(qiáng)筋壯骨之效。
本實驗結(jié)果表明,榮筋片能夠提高血清瘦素含量和骨組織蛋白表達(dá)水平,可能會改善自發(fā)性骨質(zhì)疏松動物骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨-成脂分化瘦素水平的異常。
SAMP6 鼠能夠很好地體現(xiàn)增齡性骨質(zhì)疏松癥的病理機(jī)制,是研究骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制及制定有效防治方案的理想模型[15-16]。故近些年來多數(shù)學(xué)者利用此模型研究骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)理。
眾多學(xué)者注重運用補(bǔ)腎中藥辨證論治對骨質(zhì)疏松癥整體調(diào)節(jié),并顯示出獨特性,有望替代其他藥物治療骨質(zhì)疏松癥,其充分運用MSCs具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞方向分化的雙向分化潛能特點[17-18],以補(bǔ)腎為主的中藥通過抑制MSCs向脂肪細(xì)胞分化、促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化及誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞[19-20],腎精充足,則骨髓得以滋養(yǎng),骨骼強(qiáng)健,故可以防治骨質(zhì)疏松癥。
瘦素受體是刺激腹內(nèi)側(cè)下丘腦降低骨髓脂肪細(xì)胞使細(xì)胞凋亡作用而降低骨髓脂肪[21-22]。本實驗中小鼠的血清Leptin含量水平及骨組織Leptin蛋白表達(dá)水平均得到提高,但基于瘦素直接作用于MSCs或者間接作用中樞調(diào)節(jié)系統(tǒng)不同層次調(diào)節(jié)成骨-成脂分化機(jī)理[23-24],榮筋片是中樞調(diào)節(jié)影響MSCs分化,還是直接作用MSCs促進(jìn)向成骨細(xì)胞分化,抑制其向脂肪細(xì)胞分化[25],需更進(jìn)一步研究。并且中醫(yī)藥對抗骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制研究還存在局限性。所以,應(yīng)運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對中醫(yī)藥進(jìn)行更深入的研究,為中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制提供充分的證據(jù)。