林高城 陳云歡 楊莉惠 陳雨 鄒愉龍 余友金

動(dòng)脈粥樣硬化（As） 是一種由血脂代謝紊亂和血管慢性炎癥共同作用而形成的疾病，單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在AS形成中扮演著重要的角色[1]。在高脂血癥狀態(tài)下，為了清除局部組織和血液系統(tǒng)中過(guò)多的脂質(zhì)，全身單核/巨噬細(xì)胞被激活，大量增生并攝取氧化型低密度脂蛋白從而轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，分泌大量的炎癥因子如IL-1β、TNF-α、IL-6，加重局部炎癥反應(yīng)。澤瀉湯具有降脂、利水、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[2]。本文在張仲景《金匱要略》記載的澤瀉、白術(shù)5：2配伍比例的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了 1：1、2：5組，來(lái)對(duì)比研究澤瀉湯的降血脂以及抑制炎癥因子表達(dá)的作用，探討配伍比例對(duì)澤瀉湯降血脂及抗炎癥因子作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

TNF-α、IL-6購(gòu)自于武漢博士德生物科技有限公司，脂多糖為Sigma公司，臺(tái)盼藍(lán)染色液購(gòu)于solarbio公司，PBS緩沖液、1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone有限公司，SD大鼠（雄性）40只，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK（閩）2012-0001），Leica DM IL LED 倒置顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)箱（ Therom 公司，美國(guó)） 等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD大鼠40只，體質(zhì)量160～260 g，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高脂血癥組、A組、B組，C組，每組8只，飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫25℃、濕度 45%～65% ，喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2015～2017年。

1.3 澤瀉湯的制備

澤瀉、白術(shù)均購(gòu)自于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，參考中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)（上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，李儀奎著）制備相當(dāng)于生藥材2.64 g/ml的藥液：第一煎加水量約為總藥量的6倍，浸泡1 h，煎煮大概 20 min；第二煎加水量約為總藥量的4倍，煎0.5 h，兩次藥液混合后，再濃煎壓縮，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動(dòng)物造模

正常對(duì)照組SD大鼠用普通大鼠飼料常規(guī)喂養(yǎng)，高脂血癥組、A組、B組、C組均用大鼠高脂飼料（即豬油10%，丙基硫氧嘧啶0.2%，膽固醇1%，脫氧膽酸鈉0.5%，蛋黃粉5%，蔗糖5%，基礎(chǔ)飼料78.3%，配方參照王瓊等[3]的研究）喂養(yǎng)，A、B、C組在給予高脂飲食喂養(yǎng)的同時(shí)給予相對(duì)應(yīng)的澤瀉湯灌胃，按1 ml/100 g灌胃給藥，A組：澤瀉：白術(shù)＝5：2， B組：澤瀉：白術(shù)＝1：1，C組，澤瀉：白術(shù)＝2：5；每天2次，連續(xù)20 d，正常對(duì)照組及高脂血癥組給予等量生理鹽水灌胃。

1.5 血脂檢測(cè)

5組大鼠在干預(yù)第20日后，均禁食不禁水12 h，經(jīng)大鼠眼眶取血，根據(jù)各指標(biāo)試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)血漿中TC、TG、LDL-C含量。

1.6 大鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取及細(xì)胞培養(yǎng)

借鑒蘭青等[4]辦法提取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，詳細(xì)方法如下：頸椎脫臼處死大鼠，手抓大鼠尾部將其浸入70%乙醇中，浸泡5～8 min后，從大鼠腹腔一側(cè)近45°角刺入腹腔，注射 1 640培養(yǎng)液 35～50 ml，在工作臺(tái)上打開(kāi)大鼠腹腔，吸取其腹腔液約10 ml，1 200 r/min 離心8 min。去掉上清液后，留下離心管底部乳白色沉淀物，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞存活率＞95%。

1.7 脂多糖干預(yù)及炎癥因子測(cè)定

各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸去上清液，加入脂多糖（ 10 mg /L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后進(jìn)行TNF-α及IL-6的檢測(cè)。EILSA法檢測(cè)IL-6和 TNF-α濃度。操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。均在450 nm波長(zhǎng)讀取OD值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算IL-6和TNF-α濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，組間差異比較用F檢驗(yàn)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同配伍澤瀉湯對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響

與正常對(duì)照組比較，高脂血癥組大鼠血清TC、TG、LDL-C明顯上升（P＜0.05），說(shuō)明建立模型成功；A組、B組、C組的TC、LDL-C 的水平均顯著低于高脂血癥組（P＜0.05）,但高脂血癥組與澤瀉湯不同比例配伍組的TG比較變化不顯著（P＞0.05），說(shuō)明不同配伍比例的澤瀉湯組都具有明顯的降低TC、LDL-C作用。A組、B組的TC、LDL-C的水平均明顯小于C組（P＜0.05），且A組降脂幅度更優(yōu)于B組（P＜0.05），說(shuō)明澤瀉：白術(shù)＝5：2在降血脂方面有明顯優(yōu)勢(shì)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，高脂血癥組TNF-α、IL-6 表達(dá)均增加顯著（P＜0. 05）；與高脂血癥組比較，A組、B組、C組TNF-α、IL-6 表達(dá)均明顯下降（P＜0. 05）；A組、B組TNF-α、IL-6 表達(dá)均明顯小于C組（P＜0. 05）；且以A組下降更為顯著（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明澤瀉含有重要降血脂作用的成分為三萜類化合物，這種化合物主要有澤瀉醇 A、澤瀉醇 B、24-乙酰澤瀉醇A等。研究發(fā)現(xiàn)澤瀉醇 B 能影響血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)揮澤瀉治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用[5]，24-乙酰澤瀉醇A 不僅能抑制巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)而且還能抑制平滑肌細(xì)胞遷移、表型轉(zhuǎn)化，改善泡沫細(xì)胞脂質(zhì)累積等作用[6-7]。炒白術(shù)有比較顯著抗脂質(zhì)沉積及抗氧化作用，能增強(qiáng)人的免疫功能。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察，不同配伍比例的澤瀉湯均能顯著降低高脂血癥大鼠血清中的 TC、LDL-C 水平，其中澤瀉、白術(shù)按經(jīng)典比例配伍即 5：2 降血脂效果最明顯，配伍比例1：1 的降血脂作用次之，由此可見(jiàn)，配伍比例對(duì)澤瀉湯降血脂作用有一定影響。

表1 各組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，；與高脂血癥組比較；與澤瀉湯 A 組比較

表2 各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及IL-6 表達(dá)比較（ng/L，）

表2 各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及IL-6 表達(dá)比較（ng/L，）

注：與正常對(duì)照組比較，；與高脂血癥組比較；與澤瀉湯 A組比較

已有研究表明高脂血癥可促進(jìn)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞[8]，經(jīng)過(guò)LPS刺激后巨噬細(xì)胞可分泌大量的炎癥因子[9]如TNF-α、IL-1β、IL-6加重局部病灶的炎癥反應(yīng)。腫瘤壞死因子α通過(guò)促進(jìn)血栓形成，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死、新生微小血管形成從而促進(jìn)AS發(fā)生，在AS形成病理學(xué)方面，不管是在動(dòng)脈發(fā)生內(nèi)膜增生還是內(nèi)皮功能紊亂的過(guò)程中，TNF-α都扮演著重要作用[10-12]。TNF-α和IL-6通過(guò)抑制ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇排出[13]，白介素6可上調(diào)巨噬細(xì)胞低密度脂蛋白受體表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬更多的低密度脂蛋白，加速脂質(zhì)沉積在血管壁上從而形成動(dòng)脈斑塊,白介素6還可通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1），MCP-1可促使單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集于血管內(nèi)皮引起炎癥反應(yīng)[14]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的高脂飲食喂養(yǎng)，成功建立高脂血癥模型，研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥組巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-6的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加，提示高脂血癥大鼠處于慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)，TNF-α和IL-6協(xié)同參與了動(dòng)脈粥樣的形成，經(jīng)澤瀉湯治療后的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-6明顯減少，尤其是經(jīng)典澤瀉湯配伍A組下降最明顯。澤瀉湯可通過(guò)影響炎癥因子與血脂代謝改善大鼠機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)，然而這一過(guò)程涉及的機(jī)制十分復(fù)雜，尚需更深入的研究與探索。