馬良坤，薛 勇，何婷超，張玉梅

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100730 2中國(guó)科學(xué)院微生物研究所病原微生物和免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 1001013北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191

美國(guó)醫(yī)學(xué)研究所(Institute of Medicine，IOM)早在1990年就提出孕期增重的適宜范圍，目的是減少低出生體質(zhì)量?jī)旱陌l(fā)生率。2009年結(jié)合世界衛(wèi)生組織對(duì)成人體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)分類進(jìn)一步完善，提出更為細(xì)致的推薦范圍[1]。孕期增重不適宜(不足和過(guò)量)與不良生殖結(jié)局密切相關(guān)，包括低于胎齡兒、大于胎齡兒、巨大兒、剖宮產(chǎn)、妊娠期糖尿病、子癇前期、產(chǎn)后體質(zhì)量滯留和子代肥胖等[2]。既往報(bào)道指出孕期不合理增重與孕婦年齡、孕前體質(zhì)量和孕期營(yíng)養(yǎng)等因素有關(guān)[3- 5]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，腸道微生態(tài)失調(diào)在肥胖和其他代謝性疾病中扮演重要的角色[6- 7]，但目前有關(guān)腸道菌群和孕期增重關(guān)系的報(bào)道較少。本研究調(diào)查了孕婦社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)因素和孕期增重情況，評(píng)估了孕晚期營(yíng)養(yǎng)狀況，同時(shí)對(duì)孕晚期婦女的糞便樣本進(jìn)行宏基因組檢測(cè)，探討了上述因素和孕期增重的關(guān)系，以期為孕婦營(yíng)養(yǎng)干預(yù)和健康管理提供參考。

對(duì)象和方法

對(duì)象2015年10月至2016年5月在北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科參加產(chǎn)檢的健康孕婦98例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)單胎；(2)年齡24～45歲；(3)孕齡≥27周；(4)在北京居住。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)過(guò)去1個(gè)月使用過(guò)抗生素；(2)妊娠期高血壓；(3)妊娠期糖尿病或孕前糖尿??；(4)心血管疾?。?5)慢性肝炎、慢性腎炎；(6)急、慢性胃腸炎；(7)肺結(jié)核、乙肝、人類免疫缺陷病毒感染等傳染性疾?。?8)精神疾病。本研究經(jīng)北京大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：IRB00001052- 15054)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

資料收集及分組孕婦在孕晚期產(chǎn)檢時(shí)進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，收集信息包括年齡、民族、文化程度、孕齡、身高、孕前體質(zhì)量等，并于分娩期測(cè)量產(chǎn)婦臨分娩前體質(zhì)量。依據(jù)研究對(duì)象身高和孕前體質(zhì)量計(jì)算孕前BMI，并根據(jù)孕前BMI分為低體質(zhì)量組(<18.5 kg/m2)、正常體質(zhì)量組(18.5～24.9 kg/m2)、超重組(25.0～29.9 kg/m2)和肥胖組4組(≥30.0 kg/m2)。孕期增重(kg)為臨分娩前體質(zhì)量減去孕前體質(zhì)量。根據(jù)孕期增重是否符合IOM推薦的孕期增重適宜范圍分為孕期增重不足組、孕期增重適宜組和孕期增重過(guò)量組3組。IOM孕期增重適宜范圍：孕前低體質(zhì)量孕婦為12.5～18.0 kg、孕前正常體質(zhì)量孕婦為11.5～16.0 kg、孕前超重孕婦為7.0～11.5 kg、孕前肥胖孕婦為5.0～9.0 kg。

營(yíng)養(yǎng)狀況評(píng)估孕晚期時(shí)采用24 h膳食回顧的方法調(diào)查研究對(duì)象在過(guò)去24 h內(nèi)所有攝入的食物，包括自制、市場(chǎng)購(gòu)買等。經(jīng)培訓(xùn)合格的專業(yè)調(diào)查人員指導(dǎo)研究對(duì)象進(jìn)行回憶，在膳食圖譜的幫助下回憶每種食物的攝入量。依據(jù)《食物成分表》(2002和2004版)計(jì)算能量、宏量營(yíng)養(yǎng)素和微量營(yíng)養(yǎng)素的攝入量。

便樣采集及處理采用專門的裝置采集，包括一次性便盆、無(wú)菌手套、含DNA穩(wěn)定劑的采樣管(STRATEC Biomedical AG，Birkenfeld，Germany)。DNA穩(wěn)定劑可保證便樣常溫放置3 d左右。采集當(dāng)天或次日送到婦產(chǎn)科，并立即凍存到-80 ℃冰箱待檢。采用PSP Spin Stool DNA Plus試劑盒(STRATEC Biomedical AG，Birkenfeld，Germany)進(jìn)行便樣DNA的提取，NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)測(cè)量DNA濃度，A260/A230吸光度比值在1.8～2.0間，并用1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)價(jià)DNA提取質(zhì)量。采用NEXTflexTMRapid DNA-Seq試劑盒進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建，Illumina HiSeq X Ten platform進(jìn)行雙端測(cè)序。

質(zhì)量控制和物種豐度計(jì)算下機(jī)所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后得到有效數(shù)據(jù)(clean data)，過(guò)濾步驟如下：(1)去除所含低質(zhì)量堿基(質(zhì)量值≤38)超過(guò)一定比例的reads；(2)去除N堿基達(dá)到一定比例的reads；(3)去除與Adapter之間重疊超過(guò)一定閾值的reads；(4)過(guò)濾掉宿主的reads(采用SoapAligner軟件)。使用Metaphlan2軟件[8]對(duì)Clean Data進(jìn)行分析，獲得不同分類層級(jí)的物種豐度表(物種豐度是指計(jì)算樣品中各微生物所占百分比)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，事后檢驗(yàn)采用LSD；分類資料的組間比較采用卡方檢驗(yàn)；所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在種的水平上計(jì)算Alpha多樣性(指一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用物種豐富度來(lái)度量)，包括Shannon指數(shù)(假設(shè)在無(wú)限大的群落中對(duì)個(gè)體隨機(jī)取樣，而且樣本包含了群落中所有的物種，個(gè)體出現(xiàn)的機(jī)會(huì)即為多樣性指數(shù))和Simpson指數(shù)(假設(shè)對(duì)無(wú)限大的群落隨機(jī)取樣，樣本中兩個(gè)不同種個(gè)體相遇的概率可認(rèn)為是一種多樣性的測(cè)度)，采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較組間Alpha多樣性差異，采用LEfSe分析比較不同組間差異明顯的菌群，并計(jì)算相應(yīng)線性判別式分析(linear discriminant analysis，LDA)得分，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05和LDA>2.0為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況98名孕婦的平均年齡為(32.7±3.4)歲(24.6～42.6 歲)，平均孕齡為(32.8±3.3)周(27～40 周)；民族以漢族(91.8%)為主，文化程度以大學(xué)及以上(91.8%)為主。根據(jù)孕期增重是否符合IOM推薦范圍分為：(1)孕期增重不足組(n=15，15.3%)：平均增重(8.8±2.7)kg(3.5～11.0 kg)；(2)孕期增重適宜組(n=34，34.7%)：平均增重(13.4±1.8)kg(9.0～16.5 kg)；(3)孕期增重過(guò)量組(n=49，50.0%)：平均增重(19.0±3.0)kg(14.0～31.0 kg)。3組間在年齡(F=2.495，P=0.088)、孕齡(F=0.696，P=0.501)、民族(χ2=0.065，P=0.968)、文化程度(χ2=0.827，P=0.661)、身高(F=2.283，P=0.108)、孕前體質(zhì)量(F=0.392，P=0.677)和孕前BMI(F=0.121，P=0.887)方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

孕晚期營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入24 h膳食回顧調(diào)查顯示，相比孕期增重不足組，孕期增重過(guò)量組脂肪(F=3.113，P=0.049)、α-生育酚(F=4.419，P=0.015)攝入較高，而碳水化合物(F=3.750，P=0.027)、膳食纖維(F=4.499，P=0.014)、鈣(F=7.380，P=0.001)、鉀(F=5.209，P=0.007)和硒(F=3.303，P=0.041)攝入較低(表2)。

腸道菌群信息和多樣性比較采用Metaphlan2軟件對(duì)Clean Data進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有351個(gè)種，屬于121個(gè)屬和12個(gè)門。在種的水平上計(jì)算Alpha多樣性，結(jié)果顯示，孕期增重不足組、孕期增重適宜組和孕期增重過(guò)量組的Shannon指數(shù)分別為3.05(2.63，3.31)、3.04(2.88，3.22)和3.03(2.58，3.20)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.891，P=0.641)；Simpson指數(shù)分別為0.91(0.87，0.94)、0.92(0.89，0.93)和0.91(0.85，0.93)，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.097，P=0.578)。

腸道菌群組間比較結(jié)果采用LEfSe分析比較不同組間差異明顯的腸道菌群，結(jié)果顯示：在門水平上，孕期增重過(guò)量組Verrucomicrobia豐度顯著高于孕期增重適宜組；在屬水平上，孕期增重過(guò)量組Akkermansia和Atopobium豐度顯著高于孕期增重適宜組，而Holdemania和Sutterellaceaeunclassified豐度顯著較低；在種水平，孕期增重過(guò)量組Akkermansiamuciniphila、Atopobiumparvulum和Alistipesindistinctus豐度顯著高于孕期增重適宜組，而Lactobacillusrhamnosus、Weissellaunclassified、Eubacteriumventriosum、Ruminococcustorques和Bacteroidesuniformis豐度顯著較低。進(jìn)一步比較孕期增重不足組和孕期增重適宜組的菌群差異，結(jié)果顯示：在門水平上，兩組未見顯著性差異；在屬水平上，孕期增重不足組Dialister、Anaerococcus和Parvimonas豐度顯著高于孕期增重適宜組；在種水平上，孕期增重不足組Dialisterinvisus、Alistipesunclassified、Peptoniphilusharei、Escherichiaunclassified、Parvimonasunclassified、Campylobacterureolyticus、Lactobacilluscrispatus和Fusobacteriumnucleatum豐度顯著高于孕期增重適宜組，而Eubacteriumventriosum豐度顯著較低(圖1、2)。

討 論

孕期合理的體質(zhì)量增加不僅有助于胎兒正常的發(fā)育，也有助于減少妊娠期并發(fā)癥和促進(jìn)產(chǎn)后的健康。部分孕期婦女由于體力活動(dòng)減少，同時(shí)攝入大量高蛋白、高熱量的食物，容易導(dǎo)致體質(zhì)量過(guò)量增加。本研究顯示孕期體質(zhì)量增加符合推薦范圍者僅占34.7%，高達(dá)50.0%孕婦體質(zhì)量增加高于推薦值范圍。杜秋菊等[9]對(duì)合肥市929例足月單胎孕產(chǎn)婦的調(diào)查顯示，孕期體質(zhì)量增長(zhǎng)過(guò)量者達(dá)47.3%。邵盈盈等[3]對(duì)2000至2014年浙江舟山市孕婦孕期增重的變化趨勢(shì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高達(dá)44.4%的孕婦增重超過(guò)推薦標(biāo)準(zhǔn)，并且有逐年增加的趨勢(shì)。綜上可見，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平的提高，各城市地區(qū)孕期增重過(guò)高的現(xiàn)象比較常見。

代正燕等[4]研究發(fā)現(xiàn)，孕期增重和年齡、城市相關(guān)，城市地區(qū)孕期增重過(guò)多率較高，年齡偏大的更容易孕期增重過(guò)多。邵盈盈等[3]也調(diào)查顯示，孕期增重和孕婦年齡、孕前BMI、文化程度、受孕季節(jié)等有關(guān)。本研究結(jié)果則顯示，孕期增重和年齡、民族、文化程度、孕前BMI等因素?zé)o關(guān)，推測(cè)其原因可能是樣本量有限，同時(shí)納入的研究對(duì)象基本信息比較類似。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)孕期增重過(guò)量組脂肪攝入顯著高于孕期增重不足組，而碳水化合物和膳食纖維攝入則相反，可見脂肪攝入相比碳水化合物和膳食纖維更容易導(dǎo)致孕期體質(zhì)量增加。

表 1 組間一般情況的比較Table 1 Comparisons of general data among three groups

GWG：孕期增重；BMI：體質(zhì)量指數(shù)

GWG：pregnancy weight gain；BMI：body mass index

表 2 3組膳食營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入的比較Table 2 Comparisons of dietary nutrient intake among three groups

人體共生的腸道菌群在維持機(jī)體正常的代謝、消化和免疫功能等方面發(fā)揮著重要作用，既往研究證明，腸道菌群紊亂與肥胖、糖尿病和心血管疾病等密切相關(guān)[10]。孕期攝入大量的高能量、高蛋白的食物，很容易導(dǎo)致體質(zhì)量增加過(guò)量，腸道菌群在其中可能扮演重要角色。有研究檢測(cè)不同孕期的便樣，發(fā)現(xiàn)隨著孕周的增加，菌群多樣性顯著降低，而Proteobacteria和Actinobacteria出現(xiàn)明顯增加[11]。進(jìn)一步對(duì)功能進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)孕晚期腸道菌群介導(dǎo)炎癥和能量損耗的能力明顯增加，可見腸道菌群可能深入?yún)⑴c孕婦的炎癥反應(yīng)和能量代謝等。本研究深入分析了腸道菌群和孕期體質(zhì)量增加的關(guān)系，雖然Alpha多樣性各組未見顯著性差異，但在不同進(jìn)化等級(jí)上均發(fā)現(xiàn)腸道菌群和孕期增重存在明顯關(guān)聯(lián)。Stanislawski等[12]采用16S RNA基因測(cè)序的方法分析了169例孕婦分娩前的便樣，也發(fā)現(xiàn)孕期增重和腸道菌群存在密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，與孕期增重適宜組相比，孕期增重過(guò)量組Akkermansiamuciniphila、Atopobiumparvulum和Alistipesindistinctus豐度明顯較高，而Lactobacillusrhamnosus、Weissellaunclassified、Eubacteriumventriosum、

圖1LEfSe分析比較孕期增重過(guò)量組和適宜組腸道菌群組成的差異

Fig1Differences of gut microbiota between excessive and appropriate gestational weight gain groups using LEfSe analysis

圖2LEfSe分析比較孕期增重不足組和適宜組腸道菌群組成的差異

Fig2Differences of gut microbiota between insufficient and appropriate gestational weight gain groups using LEfSe analysis

Ruminococcustorques和Bacteroidesuniformis豐度明顯較低。Lactobacillusrhamnosus是常見的益生菌，廣泛應(yīng)用于食品和保健品中，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善乳糖代謝、降低膽固醇等功能[13]，孕期增重適宜組Lactobacillusrhamnosus豐度的較高可能有助于孕婦維持其腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，并改善其糖、脂代謝，繼而促進(jìn)孕期體質(zhì)量的合理增加。Eubacteriumventriosum、Ruminococcustorques和Bacteroidesuniformis均能通過(guò)酵解纖維素產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)，SCFAs尤其是丁酸對(duì)于調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道上皮細(xì)胞功能等具有重要意義，同時(shí)SCFAs的產(chǎn)生也能降低食欲，緩解周圍組織的胰島素抵抗[14]，可見SCFAs產(chǎn)生菌的富集可能是孕期增重適宜組體質(zhì)量合理增加的重要原因。與此同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)孕期增重不足組中多種微生物的豐度顯著高于孕期增重適宜組。其中Fusobacteriumnucleatum是口腔中的一種常見菌，與牙周病有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)usobacteriumnucleatum能夠轉(zhuǎn)移到胎盤，進(jìn)而導(dǎo)致早產(chǎn)[15]。流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，孕期增重不足是早產(chǎn)的危險(xiǎn)因素[16]，腸道菌群是否在其中發(fā)揮一定的作用有待于進(jìn)一步研究。

綜上，本研究結(jié)果顯示，孕期不合理增重現(xiàn)象比較普遍，除脂肪、碳水化合物、膳食纖維攝入外，腸道菌群和孕期增重也存在顯著關(guān)聯(lián)。腸道菌群與孕期營(yíng)養(yǎng)代謝、分娩結(jié)局、后代健康的關(guān)聯(lián)有待于進(jìn)一步研究。