齊鳳慧 陳思齊 景天忠 張宇昕 詹亞光*

(1.東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040； 3.東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱 150040)

沒食子酸(Gallic acid,GA)，即3，4，5-三羥基苯甲酸，又稱倍酸、五倍子酸，是在植物中發(fā)現(xiàn)的游離或酯化形式的主要內(nèi)源性酚酸之一。沒食子酸是一種重要的生物活性物質(zhì)。早在1983年，劉國卿等從野葡萄中分離獲得沒食子酸，藥理研究表明，沒食子酸對蛋清，5-羥色胺、甲醛引起的大鼠足跖腫脹有良好的抗炎作用，對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，對沒食子酸的生物活性研究更加廣泛。除了抗菌活性外，GA還具有抗氧化活性[1]，能快速、有效的清除DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)自由基、過氧化氫和羥自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應[2]。GA對多種腫瘤有抑制作用[3]，并能直接殺傷腫瘤細胞。如黑色素瘤細胞[4]、膠質(zhì)瘤細胞[5]、肺癌[6]、白血病[7]等。近年來的研究還表明GA能通過Ca2+/calpain I介導的壞死級聯(lián)反應引起選擇性HSC(hepatic stellate cells)細胞的死亡，表明其可用于治療肝臟纖維化[8]。

GA在輕工、染料、制藥等領(lǐng)域也有廣泛應用。以GA為原料，采用分段蒸餾、分層冷凝收集的方法[9]或通過微生物降解沒食子酸生產(chǎn)焦性沒食子酸[10]。沒食子酸還可以用來制造多種燃料、焰火穩(wěn)定劑、藍黑墨水等，也是紫外線吸收劑、阻燃劑，半導體光致抗蝕原料，可配制防銹底漆和鋁合金有機涂層，配制水基鉆探泥漿用流化劑，其效果可與木質(zhì)素磺酸鹽相媲美，甚至更好[11]。

GA在植物中主要以酚酸類物質(zhì)的形式存在[12]，而游離的成份非常低。所以工業(yè)生產(chǎn)GA的方法主要是用酸、堿或單寧酶水解單寧[13～14]，而單寧則來自于富含單寧的植物，如茶條槭[15]、塔拉[14]等。這類生產(chǎn)方法需要大量的原材料，容易導致對原材料植物的掠奪式開發(fā)，破壞生態(tài)環(huán)境。此外，這類生產(chǎn)方法，特別是采用酸、堿水解的方法，往往對環(huán)境的污染也很大。因此，利用生物技術(shù)開辟了另一種途徑，即細胞培養(yǎng)來生產(chǎn)這些化合物。用細胞培養(yǎng)可以連續(xù)生產(chǎn)植物產(chǎn)品，而不受季節(jié)或環(huán)境的影響[16～17]。

目前已經(jīng)建立了通過愈傷組織繁殖茶條槭細胞生產(chǎn)沒食子酸的方法[18]。同時還建立了懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，并對GA的生產(chǎn)進行了優(yōu)化[19]。然而，和其他植物次生代謝產(chǎn)物一樣，GA合成通常在植物細胞培養(yǎng)中被抑制[20]。而真菌誘導子廣泛應用于植物細胞次生代謝產(chǎn)物合成中，植物細胞與真菌的相互作用中通過信號傳導途徑，引起植物基因表達發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑中相關(guān)酶的活性，最終刺激植物發(fā)生防御反應，誘導特定次生代謝產(chǎn)物的生成和積累，從而提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此，本文通過添加真菌誘導子促進合成沒食子酸，并對誘導過程中細胞的生長狀況進行檢測，為茶條槭細胞生產(chǎn)沒食子酸研究和利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 茶條槭懸浮細胞的培養(yǎng)

細胞采用3倍大量元素的WPM培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，培養(yǎng)溫度為(24±1)℃，暗培養(yǎng)。每隔約15天繼代1次，實驗前，將培養(yǎng)了3～4代以上長勢良好的細胞，分裝到含50 mL新鮮液體培養(yǎng)基的250 mL椎形瓶中，接入約4 g鮮重的細胞進行培養(yǎng)，用于實驗研究。

1.2 內(nèi)生真菌誘導子的制備

選擇Phomopsissp.內(nèi)生真菌，用打孔器(直徑1 cm)取1個菌餅接種于含有PDA液體培養(yǎng)基的250 mL椎形瓶中，28℃，110 r·min-1搖床上，培養(yǎng)7 d收獲菌絲。

采用直接酸解法：取10 g菌絲研磨后，加入1 L酸化蒸餾水(pH=2)中并保持沸騰1 h。加壓抽濾，取濾液，定容為1 L，用NaOH調(diào)pH為5.0，冷凍保存，使用時用0.22 μmol·L-1濾膜過濾滅菌，每個培養(yǎng)瓶中添加2.5 mL，相當于真菌多糖98 mg·L-1[21]。

1.3 內(nèi)生真菌誘導子添加濃度的選擇

在細胞培養(yǎng)當天加入0、1、2、2.5、3、4 mL的真菌誘導子，培養(yǎng)5 h后檢測PAL酶活性和沒食子酸含量。

1.4 細胞形態(tài)觀察

PI-Hoechst 33342雙重染色及熒光顯微鏡觀察：參照Ormerod等人的方法[22]，熒光染料Hoechst 33342與PI購自Sigma公司，分別用雙蒸水配制成10和50 μg·mL-1的濃度，4℃保存待用。取懸浮培養(yǎng)的細胞0.5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，棄去培養(yǎng)液，用pH5.8的PBS沖洗3次，同時用吸管將細胞吹打均勻，防止細胞聚集成團。在200 μL的細胞懸液中同時加入各20 μL的Hoechst 33342和PI，室溫下放置15 min，取適量細胞懸液涂片，以380 nm為激發(fā)波長，以400 nm為發(fā)散波長，激光共聚焦掃描拍照。

1.5 細胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測

熒光探針導入：探針均購自sigma公司，用DMSO配制成1 mmol·L-1的貯液。取懸浮細胞至1.5 mL離心管中，3 000 r·min-1，10 min后棄上清，加入200 μL WPM培養(yǎng)基(與茶條槭懸浮細胞液體培養(yǎng)基成分相同)和5 μL探針至終濃度為25 μmol·L-1(加入探針后均要避光進行后續(xù)實驗)小心混勻，冰上放置，置于搖床上振蕩2 h。離心棄上清，用培養(yǎng)基洗2次除去多余的探針，室溫放置1 h后涂片觀察。

激光掃描共聚焦掃描熒光：CLSM的工作條件為：Ex=488 nm，在λ mode選擇起始、終止波長分別為516.1和601.7 nm。output 60%，F(xiàn)rame 1024×1024，speed=6，mean=4，Z軸掃描。每10秒檢測一次圖像和熒光數(shù)據(jù)，總時間為10 min。為確保不同實驗之間具有一定的可比性，所有的熒光圖像都在相同的設置下獲得(即通過人工將儀器中相關(guān)參數(shù)如Iris，Gain，Offset，Power等設置為固定值)。

1.6 培養(yǎng)液電導率和pH的測定

采用精密酸度計(上海雷磁儀表廠)和電導率儀(型號：DDS-22C)測定。

1.7 沒食子酸含量檢測

沒食子酸對照品購自中國藥品生物制品檢定所。使用Waters液相色譜系統(tǒng)(包括600泵、717自動進樣器、2487檢測器、2996檢測器、柱溫箱等)，C18色譜柱4.6 mm×250 mm，5 μm，流動相為甲醇∶水=4∶6，流速為0.5 mL·min-1，檢測波長：270 nm；進樣量為10 μL；柱溫為25℃。標準品配置：精確稱取沒食子酸標準品0.005 0 g，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。配制成0.1 mg·mL-1的標準液。

樣品處理：精密稱定經(jīng)100目細胞篩篩過的茶條槭懸浮培養(yǎng)細胞干粉末0.100 g，精密加入2.0 mL 10%濃硫酸，2.0 mL甲醇，超聲2 min，加入甲醇定溶至5 mL，60℃水浴1 h，0.45 μm濾膜過濾，超聲10 s，進樣[23]。

1.8 PAL酶活測定

PAL酶提取液配制：100 mL 0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH7.2)，加入1 g PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)。使用前現(xiàn)加入15 μL巰基乙醇和5 μL的100 mmol·L-1的PMSF(苯甲基磺酰氟)。

PAL粗酶液提?。喝H7.2磷酸鹽緩沖液懸浮洗滌細胞，抽濾。加液氮研磨成粉，稱取粉末0.2 g，放于1.5 mL的離心管，加入提取液0.6 mL，振蕩混勻，以上操作均在冰上進行。4℃ 8 000 g，離心30 min。上清轉(zhuǎn)移至新1.5 min離心管，立即進行酶活測定。以每小時吸光值增0.1為一個酶活單位(U)，即A290/Δt=0.1/1 h為1 U[24]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)圖(直方圖、折線圖)和方差分析均采用SPSS15.0軟件。在顯著性分析時，α′值取0.1。

2 結(jié)果

2.1 真菌誘導子添加濃度的選擇

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應的關(guān)鍵酶和限速酶，因此調(diào)節(jié)這些酶的表達活性，可有效地調(diào)節(jié)與之相應的次級代謝產(chǎn)物的生物合成。本文在細胞培養(yǎng)當天加入0、1、2、2.5、3、4 mL的真菌誘導子，培養(yǎng)5 h后檢測PAL酶活性和沒食子酸含量，結(jié)果(圖1～2)表明濃度為2.5 mL時PAL酶活性和GA含量最高。因此選用填加2.5 mL真菌誘導子為后續(xù)實驗誘導濃度。

圖1 不同濃度真菌誘導子誘導細胞內(nèi)PAL活性Fig.1 Activity of PAL of the plant cell after induced by the fungal elicitor with different concentration

2.2 真菌誘導子誘導茶條槭細胞沒食子酸含量的改變

在細胞培養(yǎng)14 d時添加真菌誘導子結(jié)果如圖3所示，誘導組中沒食子酸含量在24 h前呈平緩狀態(tài)，誘導24 h后開始快速升高，并在48 h達到最高點，之后又降低。說明在24 h前細胞生長和相關(guān)酶類活性的增加，為細胞后期產(chǎn)生沒食子酸提供了可能性，使沒食子酸逐漸積累在48 h達到高峰，其含量為12.2 mg﹒g-1DW，是對照組的1.58倍左右。方差分析表明，細胞誘導培養(yǎng)24 h后，差異達到極顯著(F=41.134，P=0.003)。表明真菌誘導子(擬莖點霉屬Phomopsissp.)對茶條槭細胞中沒食子酸合成是有促進作用的。

圖2 不同濃度真菌誘導子誘導細胞內(nèi)沒食子酸含量Fig.2 Gallic acid content of the plant cell after induced by the fungal elicitor with different concentration

圖3 真菌誘導子誘導茶條槭細胞沒食子酸含量的積累Fig.3 Gallic acid content of the cell after induced by the fungal elicitor

圖4 真菌誘導子作用后細胞膜透性變化 A1,B1,C1.用Hoechst33342染色；A2,B2,C2.用PI染色；A3,B3,C3.是PI-Hoechst33342結(jié)合Fig.4 Membrane permeability of the cell after induced by the fungal elicitor A1,B1,C1.Nuclear dyed with hoechst 33342; A2,B2,C2.Nuclear dyed with PI; A3,B3,C3.Combination of a,b and c

2.3 真菌誘導子誘導茶條槭細胞膜通透性的改變

本文選用Hoechst 33342和propidium-iodide(PI)雙染的方法對誘導子作用下的細胞核形態(tài)進行了觀察(圖4)。PI、Hoechst 33342均可與細胞核DNA(或RNA)結(jié)合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故正常細胞均可被Hoechst著色，呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒，細胞膜通透性增大時細胞核可被PI染成紅色。通過PI-Hoechst 33342雙重染色及激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在沒有加真菌誘導子的細胞中，細胞膜的通透性良好，PI染料沒有通過細胞膜，細胞核只呈藍色(圖4:A1)，而無紅色(圖4:A2)；在細胞被誘導5 h時，部分細胞的細胞膜通透性增大，細胞核被PI染料染成紅色(圖4:B2)，PI染色后的細胞核與Hoechst 33342染色后的細胞核完全重合(圖4:B3)；隨著誘導時間的增加，在細胞被誘導24 h時，通過PI-Hoechst 33342雙染發(fā)現(xiàn)細胞核被染成藍色和紅色，這說明真菌誘導子可使茶條槭細胞膜的通透性增大。同時還觀察到在一個細胞中出現(xiàn)兩個細胞核(圖4:C1～3)。說明真菌誘導子有可能促進了核內(nèi)有絲分裂。

2.4 真菌誘導子誘導茶條槭細胞培養(yǎng)液的pH值和電導率變化

在茶條槭細胞懸浮培養(yǎng)14 d時，加入真菌誘導子后，細胞培養(yǎng)液pH值與對照相比發(fā)生了變化，呈降升交替變化趨勢，其中在誘導5 h時，pH值由誘導起始時的6.79升高到7.08，之后迅速降低，在24 h時又達到另一個高峰，但此時的pH值低于起始時的pH值。而對照組開始基本不變，在5 h時開始降低，在10～48 h內(nèi)基本沒有改變(圖5)。方差分析表明，這種差異不顯著(F=1.295，P=0.274)。電導率反映了無機鹽離子的吸收利用的情況。本研究中，培養(yǎng)液中電導率如圖6所示：在真菌誘導子作用下，培養(yǎng)液中電導率逐漸降低，在48 h時達到低谷，之后開始上升。而對照組電導率一直呈上升趨勢。方差分析表明，這種差異顯著(F=9.382，P=0.008)。這一結(jié)果說明真菌誘導子可能促進了細胞對培養(yǎng)液中的無機鹽離子的吸收，以滿足細胞快速生長的需要。

圖5 加入真菌誘導子后茶條槭細胞培養(yǎng)液pH的變化Fig.5 The pH of the culture media after the fungal elicitor was added

圖6 真菌誘導子誘導茶條槭細胞培養(yǎng)液的電導率的改變Fig.6 Electric conductivity of the culture media after the fungal elicitor was added

2.5 真菌誘導子誘導茶條槭細胞PAL酶的活性變化

PAL是催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應的關(guān)鍵酶和限速酶，本研究中(圖7)在真菌誘導子作用下，細胞PAL酶活性升高，但并不是一直上升，而是有升有降，在誘導3、10和48 h時達到高峰，其中在10和48 h時強度分別是對照的1.16和1.75倍左右。方差分析表明，這種差異達到顯著水平(F=4.404，P=0.054)。說明是細胞對外界刺激后產(chǎn)生快速應答的反應，真菌誘導子可使細胞內(nèi)PAL酶活性在短時間內(nèi)升高；而隨著細胞內(nèi)次生產(chǎn)物的合成，消耗一部分PAL酶，而導致PAL活性降低，之后再積累升高，消耗降低，這樣循環(huán)往復，促使次生代謝產(chǎn)物的積累。

圖7 真菌誘導子對PAL酶活性的影響Fig.7 PAL activity of the suspension cells after the fungal elicitor was added

2.6 真菌誘導子對茶條槭細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的影響

細胞培養(yǎng)24 h后加入Fluo-3/AM鈣離子熒光探針，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)真菌誘導子誘導的懸浮細胞內(nèi)只有微弱的熒光(圖8)，這說明真菌誘導子在誘導細胞內(nèi)沒食子酸合成時，Ca2+濃度沒有明顯增加。這一結(jié)果可能是由于誘導子的起源，并且植物可能對內(nèi)生菌和病原體顯著反應。Lecourieux等人也報道了類似的結(jié)果，在用寡聚半乳糖醛酸苷和昆布多糖誘導的煙草細胞中沒有檢測到Ca2+濃度的增加[25～26]。

圖8 真菌誘導子作用后茶條槭細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化紅、黃、綠、藍顏色表示熒光強度依次降低Fig.8 Calcium influx of the plant cell after induced by the fungal elicitor Red,yellow,green and blue indicate descending fluorescence intensity

3 討論

已有研究表明，添加真菌誘導子能夠促進植物細胞次生代謝產(chǎn)物的積累，李家儒等[27]在細胞生長第20天，每100 mL培養(yǎng)液加入2 mL桔青霉誘導子，可使胞內(nèi)的紫杉醇含量達199.1 μg·g-1DW。徐志榮等[28]在細胞懸浮培養(yǎng)第8天加入100 μg·mL-1真菌誘導子，可明顯增加懸浮細胞的生物量，紫杉醇的含量也有提高。研究表明對細胞具有誘導活性成分的主要是真菌誘導子中的多糖物質(zhì)[29]。真菌誘導子通常包含寡糖，肽和脂質(zhì)，這些物質(zhì)均可以被植物細胞膜相應的位點所識別，從而改變細胞膜的特性，而植物細胞膜上的質(zhì)子泵活性是鈣離子通道的動力來源。細胞培養(yǎng)液pH值增加意味著培養(yǎng)液中的質(zhì)子濃度下降，為了保持細胞內(nèi)外的離子濃度平衡，必然有陽離子由胞內(nèi)流向胞外，從而引發(fā)一系列的生物學效應。而本研究中，真菌誘導子在添加后48 h時使沒食子酸含量達到最高為12.2 mg·g-1DW，茶條槭細胞膜的通透性增大，但培養(yǎng)基中的pH值并沒有明顯變化，誘導后的細胞也未觀察到鈣離子流入。培養(yǎng)液中的無機成分和礦物質(zhì)營養(yǎng)素的消耗會導致電導率的下降[30]。本研究中電導率在誘導組和對照組中均逐漸下降，統(tǒng)計分析表明真菌誘導子對電導率下降有顯著影響，這表明細胞在真菌誘導子誘導后可能消耗更多的礦物質(zhì)營養(yǎng)來進行次生代謝產(chǎn)物的合成[30]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是連接初生代謝和次生代謝的關(guān)鍵酶，PAL的活性與細胞的分化密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)真菌誘導子促進沒食子酸在茶條槭細胞中積累的同時，也促使了細胞中PAL活性顯著升高，由此推測PAL酶可能參與了真菌誘導沒食子酸的合成。

綜上所述，真菌誘導子能夠?qū)Ｒ?、快速的誘導植物細胞中特定基因的表達，從而使次生代謝途徑中關(guān)鍵酶活性增強、使目的次生代謝產(chǎn)物含量增加。因此，本研究分析了真菌誘導子對茶條槭細胞膜通透性及PAL酶活性的影響等，明確了真菌誘導子提高茶條槭細胞中沒食子酸含量的同時，細胞及培養(yǎng)基中一些生理特征的變化情況，為進一步研究真菌誘導子誘導機制奠定基礎。