趙 敏 趙啟安 劉 博 王玥萱 張莉環(huán) 楊 寧

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

干旱是最嚴(yán)重的逆境環(huán)境之一，植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和作物的產(chǎn)量均會(huì)受到干旱脅迫的影響，可能會(huì)直接導(dǎo)致農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大[1]。植物主要通過(guò)改變一系列的生理生化和分子機(jī)制來(lái)響應(yīng)干旱脅迫[2]，而抗旱機(jī)制的研究也一直是國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)。長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物通過(guò)干旱脅迫引起植物生理響應(yīng)、形態(tài)結(jié)構(gòu)、種子萌發(fā)等的變化，植物可通過(guò)降低生長(zhǎng)速率、氣孔導(dǎo)度、組織滲透勢(shì)及提高抗氧化系統(tǒng)來(lái)抵御干旱脅迫的危害[3～4]。因此對(duì)植物開(kāi)展干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制的研究，對(duì)植物的生長(zhǎng)、農(nóng)作物的穩(wěn)產(chǎn)以及區(qū)域生態(tài)防御機(jī)制都具有重要的意義。

硫化氫(H2S)由于具有臭雞蛋味，常被認(rèn)為是有毒氣體，現(xiàn)代研究已證實(shí)它是除一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之外的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子[5]。H2S在哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量較為豐富，已研究證實(shí)生理濃度的H2S可以作為一種細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的氣態(tài)因子，在生理過(guò)程中扮演著重要角色，它的作用和NO、CO類似，具有調(diào)節(jié)血壓、舒張血管等多種生理功能，它的代謝異常與心腦血管疾病密切相關(guān)[6]。在植物中，H2S主要通過(guò)內(nèi)源酶促途徑生成，L-半胱氨酸脫硫基酶(L-CDes)和D-半胱氨酸脫硫基酶(D-CDes)分別催化L-半胱氨酸(L-Cys)和D-半胱氨酸(D-Cys)產(chǎn)生H2S、氨和丙酮酸[7]。硫氫化鈉(NaHS)常被用作H2S的外源供體，近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道了生理濃度的NaHS可以促進(jìn)種子發(fā)芽、根的形態(tài)建成[8～9]、調(diào)節(jié)花衰老[10]、保護(hù)多種植物抵御非生物脅迫，如干旱[11]、熱[12]與重金屬脅迫[13]等。

磷脂酶是位于細(xì)胞膜上可以水解磷脂酰膽堿的一類酶。根據(jù)其水解磷脂位置的不同，可劃分為磷脂酶D(phospholipase D，PLD)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、磷脂酶A1(phospholipase A1，PLA1)和磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)[14]。PLD是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱，在許多生物類群中均有分布，如細(xì)菌到高等植物體中，具有參與脂質(zhì)代謝，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生物膜的形成等重要生理功能[15]。不同的PLD可特異性水解各種磷脂，磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)作為直接產(chǎn)物，也是一種重要的信使物質(zhì)，它是通過(guò)激活靶物質(zhì)，使信號(hào)向下傳導(dǎo)，同時(shí)，PA還可以進(jìn)一步代謝產(chǎn)生其他物質(zhì)[16]。有研究表明，PA可以和某些特異性蛋白結(jié)合，可參與NADPH氧化酶的活化[17]，與活性氧的產(chǎn)生也有關(guān)系。也有研究證實(shí)[18]，細(xì)胞膜系統(tǒng)是最先感知干旱信號(hào)，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)入到細(xì)胞的內(nèi)部，使植物產(chǎn)生一系列的生理響應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，若不能及時(shí)清除會(huì)導(dǎo)致生物膜脂過(guò)氧化、引起蛋白質(zhì)等大分子的交聯(lián)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害，其中過(guò)氧化氫(H2O2)是活性氧的一種，也是一種重要的信號(hào)分子。但在一定程度上，植物細(xì)胞自身會(huì)通過(guò)抗氧化酶系(超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)、過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)來(lái)清除活性氧自由基，來(lái)減輕干旱對(duì)植物產(chǎn)生的傷害[19]，另外，當(dāng)植物處于干旱環(huán)境時(shí)，會(huì)導(dǎo)致電解質(zhì)滲漏率增加、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的改變，來(lái)增強(qiáng)植物的抗旱性[20]。

高山離子芥(Chorisporabungeana)是十字花科(Brassicaceae)離子芥屬(Chorispora)的多年生草本植物，生長(zhǎng)在高山冰緣地帶，它與模式生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)具有較高的同源性，其經(jīng)常受到干旱、輻射、低溫等多種非生物脅迫的影響，但是高山離子芥不具有發(fā)達(dá)的表皮毛和其它結(jié)構(gòu)來(lái)抵御逆境脅迫，另外其葉在不同的營(yíng)養(yǎng)、生殖生長(zhǎng)階段都有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)，因此有學(xué)者認(rèn)為高山離子芥具有獨(dú)特的生理抗脅迫響應(yīng)機(jī)制[21～22]。它作為一種天然的抗逆植物，對(duì)于研究高山冰緣植物獨(dú)特的響應(yīng)機(jī)制來(lái)說(shuō)是一種很好的實(shí)驗(yàn)材料。本文選用高山離子芥試管苗為研究材料，以0.3 mol·L-1甘露醇模擬干旱脅迫，結(jié)合使用外源添加H2S供體NaHS、PLD下游產(chǎn)物PA及其抑制劑正丁醇和ROS抑制劑DPI，研究H2S對(duì)干旱脅迫下高山離子芥的膜系統(tǒng)損傷程度、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶系、ROS、PLD活性以及內(nèi)源H2S含量的影響，進(jìn)而探討PLD、ROS和H2S信號(hào)分子在高山離子芥中響應(yīng)干旱脅迫中的信號(hào)作用及關(guān)系，為后期深入研究H2S在生態(tài)環(huán)境中可能的作用提供科學(xué)依據(jù)，以及揭示PLD、ROS、H2S響應(yīng)干旱的信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 高山離子芥試管苗的培養(yǎng)

高山離子芥試管苗的培養(yǎng)方法參考楊寧等的實(shí)驗(yàn)方法[23]，略有改動(dòng)。具體操作如下：將高山離子芥(Chorasporabungeana)試管苗接種于MS+0.2 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+5 g·L-1瓊脂，pH5.8、溫度23℃、光周期12 h、培養(yǎng)15 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料的處理

以0.3 mol·L-1甘露醇模擬干旱脅迫，各處理方式如下，NaHS處理：將150 μmol·L-1NaHS分別添加于培養(yǎng)基中，然后選擇長(zhǎng)勢(shì)旺盛且生長(zhǎng)一致的高山離子芥接種于培養(yǎng)基中；PA處理：將80 μmol·L-1PA分別添加于培養(yǎng)基中；H2O2處理：將1 mmol·L-1H2O2添加于培養(yǎng)基中；PA+H2O2：將80 μmol·L-1PA和1 mmol·L-1H2O2添加于培養(yǎng)基中；PA+DPI：將80 μmol·L-1PA和10 μmol·L-1DPI添加于培養(yǎng)基中；正丁醇+H2O2處理：將0.2%正丁醇和1 mmol·L-1H2O2添加于培養(yǎng)基中；正丁醇+DPI處理：將0.2%正丁醇和10 μmol·L-1DPI添加于培養(yǎng)基中，然后選擇生長(zhǎng)一致，長(zhǎng)勢(shì)旺盛的高山離子芥分別接種于0.3 mol·L-1甘露醇培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)架上。以上處理每瓶至少接種3株，每處理3個(gè)平行。處理時(shí)間為6、12、24、48、72 h。實(shí)驗(yàn)以0 h作為空白對(duì)照，未添加甘露醇處理的作為陰性對(duì)照組，添加甘露醇處理的處理組為實(shí)驗(yàn)組，待脅迫處理結(jié)束后，取高山離子芥葉片為材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 干旱脅迫下高山離子芥試管苗膜系統(tǒng)損傷程度指標(biāo)測(cè)定

2.1.1 相對(duì)電導(dǎo)率(EL)的測(cè)定

相對(duì)電導(dǎo)率(EL)的測(cè)定參照Walker等的方法[24]。分別稱取不同處理的新鮮高山離子芥試管苗0.2 g，用超純水快速?zèng)_洗3次，置于5 mL超純水中，室溫25℃靜置2 h，使用電導(dǎo)儀測(cè)得C1，之后沸水浴30 min，待冷卻至室溫后用電導(dǎo)儀測(cè)得C2。設(shè)3個(gè)重復(fù)。

相對(duì)電導(dǎo)率：EL(%)=C1/C2×100%

(1)

2.1.2 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定

MDA的測(cè)定方法采用硫代巴比妥酸法，參考Amako等的方法并略有改動(dòng)[25]，簡(jiǎn)述如下，稱取0.2 g經(jīng)處理的幼苗，加入10%三氯乙酸2 mL，研磨成勻漿，4 000 r·min-1離心10 min。取1 mL上清液，加入0.6% TBA 1 mL，溶液95℃水浴15 min后迅速冷卻，分別在450、532和600 nm測(cè)其吸光度值，重復(fù)3次，計(jì)算公式如下：

MDA濃度(μmol·mL-1)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(2)

MDA含量(μg·g-1)=提取液中MDA濃度(μmol·mL-1)×提取液體積(mL)/幼苗鮮重(g)

(3)

2.2 干旱脅迫下高山離子芥試管苗葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測(cè)定

2.2.1 脯氨酸含量的測(cè)定

脯氨酸含量的測(cè)定采用磺基水楊酸法[26]，具體方法如下，準(zhǔn)確稱取不同處理的待測(cè)植物葉片各0.2 g，加入2 mL 3%磺基水楊酸研磨，吸取至10 mL離心管中，4℃條件下離心10 min，取上清液，沸水浴10 min。冷卻后取上清液1 mL，分別加入1 mL蒸餾水、1 mL冰乙酸、2 mL 2.5%酸性茚三酮溶液，然后沸水浴中孵育60 min。冷卻后加入2 mL甲苯萃取，震蕩30 s后靜置，分層后取甲苯相在分光光度計(jì)上520 nm下測(cè)定OD值，計(jì)算脯氨酸的含量。

2.2.2 可溶性糖的測(cè)定

采用蒽酮比色法[27]測(cè)定可溶性糖含量，準(zhǔn)確稱取不同處理的待測(cè)植物葉片各0.2 g，加入2 mL蒸餾水研磨，吸取至10 mL離心管中，4℃下離心10 min，取上清液0.5 mL，加入1.5 mL蒸餾水，再分別加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯和5 mL濃H2SO4，以蒸餾水為空白對(duì)照，震蕩沸水浴1 min，冷卻后630 nm下測(cè)定OD值，計(jì)算可溶性糖含量。

2.3 干旱脅迫下高山離子芥試管苗葉片中抗氧化酶系測(cè)定

2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[28]，以抑制NBT光化學(xué)還原的50%為一個(gè)酶活單位(U)，酶的活性以U·g-1·min-1表示。

2.3.2 過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定

過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定參照愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定[28]，以每分鐘OD470升高0.01為一個(gè)酶活單位(U)，酶活性以U·g-1·min-1表示。

2.3.3 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定

過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定參照Cakmak等[29]方法測(cè)定，以每分鐘OD240減少0.01為一個(gè)酶活單位(U)，活性以U·g-1·min-1表示。

2.4 PLD、H2S、H2O2含量以及O·-2含量的測(cè)定

PLD酶活性、H2S含量由上海酶聯(lián)生物公司的試劑盒測(cè)定，具體測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。H2O2含量測(cè)定參照Li等[30]方法測(cè)定，略有改動(dòng)，稱取新鮮高山離子芥葉片0.2 g，加入4℃下預(yù)冷的丙酮和少許石英砂研磨成勻漿后，3 000 r·min-1離心10 min，棄去殘?jiān)∩锨? mL，分別加入0.1 mL 5%硫酸鈦和0.2 mL濃氨水，待沉淀形成后離心10 min，棄去上清液。沉淀用丙酮反復(fù)洗滌3～5次，直到去除植物色素，加入2 mmol·L-1硫酸5 mL，待沉淀完全溶解后，415 nm下測(cè)定。O·-2含量測(cè)定參照李忠光等[31]方法測(cè)定，稱取0.2 g不同處理的新鮮高山離子芥葉片，加入0.05 mol·mL-1的磷酸鉀緩沖液(pH7.8)2 mL及少許石英砂，充分冰浴研磨，將勻漿液置于2 mL離心管中于8 000 r·min-1離心10 min，取上清液1.5 mL加入0.5 mL磷酸鉀緩沖液(pH7.8)和10 mmol·mL-1鹽酸羥胺0.1 mL，搖勻后25℃水浴10 min。取出后加入58 mmol·mL-1氨基苯磺酸1 mL、7 mmol·mL-1α-萘胺1 mL，30℃水浴30 min，最后加3 mL氯仿，10 000 r·min-1離心3 min，小心吸取上層粉色水相，室溫A530 nm下測(cè)定。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0對(duì)組間隨時(shí)間變化的差異性多重比較采用LSD法分析，作圖在Orgin pro 9.0中進(jìn)行，每次實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 外源添加H2S供體NaHS濃度的篩選

相對(duì)電導(dǎo)率(EL)和丙二醛含量(MDA)能夠反映干旱脅迫下植物細(xì)胞膜的損傷程度。如圖1所示，與對(duì)照組相比，0.3 mol·L-1甘露醇處理下EL和MDA含量顯著上升，表明干旱脅迫會(huì)對(duì)高山離子芥試管苗細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷；然而，當(dāng)外源添加一定生理濃度(≤0.2 mmol·L-1)的NaHS時(shí)，EL和MDA顯著下降，表明外源H2S的加入對(duì)干旱脅迫下高山離子芥試管苗細(xì)胞膜具有一定的保護(hù)作用，減輕膜脂過(guò)氧化程度。但當(dāng)濃度增大到一定程度時(shí)，會(huì)對(duì)其產(chǎn)生毒害作用。其中，外源NaHS濃度為0.15 mmol·L-1時(shí)，EL、MDA較對(duì)照下降最為明顯，因此選擇0.15 mmol·L-1為后續(xù)實(shí)驗(yàn)外源添加NaHS的濃度。

圖1 0.3 mol·L-1甘露醇處理下不同濃度的NaHS對(duì)高山離子芥試管苗中相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of NaHS on Relative Electricity and malondialdehyde content in C.bungeana plantlets under 0.3 mol·L-1 mannitol

圖2 干旱脅迫下，H2S對(duì)高山離子芥試管苗相對(duì)電導(dǎo)率(A)、丙二醛含量(B)的影響 圖中小寫(xiě)字母表示同一時(shí)間不同濃度在P≤0.05時(shí)的顯著性差異，大寫(xiě)字母表示不同時(shí)間同一濃度在P≤0.05時(shí)的顯著性差異，下同。Fig.2 Effect of H2S on the relative conductivity(A) and malondialdehyde(B) in C.bungeana plantlets under drought stress The lower case letters indicate the same time different concentrations at P≤0.05 when the significant difference between the capital letters that the same concentrations at the different time in the P≤0.05 significant difference,the same as below.

圖3 干旱脅迫下，外源H2S對(duì)高山離子芥試管苗脯氨酸含量(A)、可溶性糖含量(B)的影響Fig.3 Effect of H2S on proline content(A) and soluble sugar content(B) in C.bungeana plantlets under drought stress

圖4 干旱脅迫下，外源H2S對(duì)高山離子芥試管苗SOD活性(A)、POD活性(B)、CAT活性(C)的影響Fig.4 Effect of exogenous H2S on SOD activity(A),POD activity(B) and CAT activity(C) in C.bungeana plantlets under drought stress

3.2 干旱脅迫下H2S對(duì)高山離子芥試管苗膜系統(tǒng)損傷程度的影響

圖2A表明，相對(duì)電導(dǎo)率隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在48 h有下降趨勢(shì)，但都顯著高于陰性對(duì)照組，但當(dāng)外源添加H2S時(shí)，干旱脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率顯著下降，表明H2S可能對(duì)干旱下細(xì)胞膜透性有一定的保護(hù)作用。

干旱脅迫可誘導(dǎo)MDA含量的顯著變化(圖2B)，在干旱處理6～72 h時(shí)間內(nèi)，MDA含量呈先升高后下降趨勢(shì)，在24 h時(shí)達(dá)到最大值，外源添加H2S后，干旱脅迫下MDA含量與對(duì)照相比呈顯著下降趨勢(shì)，說(shuō)明H2S會(huì)降低干旱脅迫下膜脂過(guò)氧化程度。

3.3 干旱脅迫下，H2S對(duì)高山離子芥試管苗葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

干旱脅迫下外源H2S對(duì)高山離子芥的脯氨酸和可溶性糖含量測(cè)定顯示，在干旱脅迫6～72 h內(nèi)，脯氨酸含量(圖3A)呈上升趨勢(shì)，并且始終高于對(duì)照組，且在48h時(shí)達(dá)到最大值。通過(guò)外源施加NaHS，脯氨酸含量顯著提高，72 h時(shí)達(dá)到最大?？扇苄蕴呛?圖3B)隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈波動(dòng)趨勢(shì)，在24 h達(dá)到最大值。添施NaHS后，可溶性糖含量顯著高于0.3 mol·L-1甘露醇處理，脅迫后期的下降可能是植物作出的適應(yīng)性反應(yīng)。植物脯氨酸含量、可溶性糖在細(xì)胞質(zhì)中大量積累有利于抵抗逆境環(huán)境的影響，防止原生質(zhì)脫水，平衡細(xì)胞質(zhì)與液泡間的滲透勢(shì)。外源H2S可增加高山離子芥試管苗葉片中脯氨酸含量、可溶性糖以抵御干旱脅迫造成的植物損傷。

3.4 干旱脅迫下H2S對(duì)高山離子芥試管苗葉片中抗氧化酶系的影響

SOD、POD、CAT等是植物對(duì)膜脂過(guò)氧化的酶促防御系統(tǒng)的重要酶，這些酶具有抗氧化作用，其活性提高與抵御逆境脅迫和抑制細(xì)胞膜脂過(guò)氧化等相關(guān)。如圖4所示，0.3 mol·L-1干旱脅迫單獨(dú)處理時(shí)，SOD、POD、CAT的活性均呈升高趨勢(shì)，有利于抵御干旱脅迫導(dǎo)致的高山離子芥試管苗的氧化損傷。用0.15 mmol·L-1NaHS處理干旱脅迫下高山離子芥試管苗，不同處理時(shí)間下SOD活性變化如圖4A所示，干旱脅迫導(dǎo)致高山離子芥試管苗SOD活性增加，并表現(xiàn)為脅迫初期上升，后期有所下降；說(shuō)明隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，高山離子芥試管苗的抗氧化能力下降。而外施H2S進(jìn)一步誘導(dǎo)了SOD活性的上升，表明H2S可以提高干旱脅迫下高山離子芥試管苗的抗氧化能力。

圖4B表示干旱脅迫下，外源H2S對(duì)POD活性的影響，在脅迫早期，POD活性對(duì)干旱不敏感，脅迫12 h后，干旱誘導(dǎo)POD活性增加，在24 h達(dá)到最大值。外源添加H2S后，極大程度誘導(dǎo)POD活性，表明H2S可能是通過(guò)增強(qiáng)POD活性從而抵御干旱脅迫對(duì)高山離子芥試管苗造成的氧化損傷。

圖4C所示，CAT參與了整個(gè)干旱脅迫過(guò)程，在脅迫12 h時(shí)CAT活性達(dá)到最大值，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT活性又會(huì)受到抑制，但始終顯著高于對(duì)照組。外源H2S誘導(dǎo)CAT活性，使CAT活性顯著高于0.3 mol·L-1甘露醇單處理，表明H2S增強(qiáng)酶促作用來(lái)增強(qiáng)高山離子芥試管苗抗旱能力。

3.5 干旱脅迫對(duì)高山離子芥試管苗中PLD活性、H2S含量變化的影響

干旱脅迫下PLD活性隨處理時(shí)間的變化如圖5A所示，從圖5中可以看出，在不同的干旱脅迫時(shí)間下，PLD活性均顯著高于空白對(duì)照組。與對(duì)照組相比，0.3 mol·L-1甘露醇處理6～72 h，PLD活性在12 h達(dá)到最大，為85.78%，且PLD活性整體呈波動(dòng)變化趨勢(shì)，分別在72 h最低，12 h達(dá)到最高值。由圖5B可知，高山離子芥試管苗葉片中可產(chǎn)生內(nèi)源H2S，干旱脅迫可誘導(dǎo)高山離子芥葉片H2S含量的增加，且H2S含量在脅迫48h后達(dá)到最大值，較對(duì)照增高141.23%，由此得出H2S響應(yīng)干旱脅迫。

圖6 干旱脅迫下，外源H2S對(duì)高山離子芥試管苗H2O2含量(A)、O·-2含量(B)、的影響Fig.6 Effect of exogenous H2S on H2O2 content(A),O·-2 content(B) in C.bungeana plantlets under drought stress

圖7 干旱脅迫下外源PA、正丁醇對(duì)高山離子芥試管苗中H2O2含量(A)、O·-2含量(B)的影響Fig.7 Effects of exogenous PA,1-butanol on H2O2 content(A),O·-2 content(B) in C.bungeana plantlets under drought stress

3.6 干旱脅迫下，H2S對(duì)高山離子芥試管苗葉片中活性氧(ROS)的影響

如圖6所示，外源H2S對(duì)干旱脅迫下ROS產(chǎn)生具有積極作用。圖6A所示，干旱脅迫下H2O2含量顯著上升，脅迫24 h達(dá)到最大值，約為空白對(duì)照組的4倍。外施NaHS后，H2O2含量顯著下降，處理48 h時(shí)較干旱脅迫相比下降50.46%。干旱脅迫下，外源H2S對(duì)高山離子芥試管苗O·-2含量的影響如圖6B所示，干旱脅迫激活O·-2的應(yīng)答，在處理時(shí)間內(nèi)顯著上升，脅迫6 h時(shí)，O·-2含量上升最低，48 h達(dá)到最大值，外施NaHS后，干旱脅迫下O·-2含量得到不同程度的降低，6～72 h內(nèi)，分別降低34.38%，31.36%，46.39%，39.42%，45.13%。表明一定濃度的H2S可以不同程度的抑制干旱脅迫下ROS的積累，緩解干旱脅迫引起的氧化損傷。

3.7 干旱脅迫下外源PA、正丁醇對(duì)高山離子芥試管苗中ROS的影響

圖5～6的結(jié)果表明，ROS、PLD活性和H2S含量均能積極應(yīng)答干旱脅迫，說(shuō)明三者之間可能存在一定的聯(lián)系。通過(guò)外源添加PLD下游產(chǎn)物磷脂酸(PA)以及PLD抑制劑正丁醇，研究PLD對(duì)ROS的影響。結(jié)果如圖7所示，外源添加PA顯著增加干旱脅迫下H2O2含量、O·-2含量，而外源添加正丁醇后，H2O2含量、O·-2含量得到顯著降低，說(shuō)明PA參與ROS的生成，PLD可能位于ROS上游發(fā)揮作用。

3.8 干旱脅迫下外源PA、DPI、正丁醇對(duì)高山離子芥試管苗中H2S含量的影響

二聯(lián)苯碘(DiphenyleneIodonium，DPI)是NADPH氧化酶抑制劑，而NADPH氧化酶是ROS產(chǎn)生的主要途徑，通過(guò)外源添加DPI可抑制ROS的產(chǎn)生。采用外源添加PA、DPI和正丁醇，研究干旱脅迫下，PLD、ROS、H2S三者之間的聯(lián)系。如圖8所示，分別外源添加PA、H2O2均可顯著促進(jìn)干旱脅迫下H2S的釋放，初步說(shuō)明PA、ROS與干旱脅迫下H2S的產(chǎn)生密切相關(guān)，PLD、ROS可能均位于H2S的上游發(fā)揮作用，當(dāng)同時(shí)外援施加PA和DPI后，干旱脅迫下H2S含量沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明PLD下游產(chǎn)物PA影響H2S的產(chǎn)生依賴于ROS，當(dāng)同時(shí)外源施加PLD抑制劑正丁醇與DPI后，顯著抑制干旱脅迫下H2S含量的產(chǎn)生，進(jìn)一步表明干旱脅迫誘導(dǎo)的H2S產(chǎn)生需要PLD與ROS的參與，由此表明ROS位于PLD上游，位于H2S下游發(fā)揮作用。

圖8 干旱脅迫下外源PA、DPI、正丁醇對(duì)高山離子芥試管苗中H2S含量的影響Fig.8 Effect of exogenous PA,DPI and 1-butanol on the content of H2S in C.bungeana plantlets under drought stress

4 討論

干旱是重要的非生物脅迫之一，可影響細(xì)胞膜完整性，參與滲透調(diào)節(jié)并能影響光合能力變化等，是植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要限制因素，嚴(yán)重的干旱脅迫降低作物的生產(chǎn)，并可能導(dǎo)致作物災(zāi)難性的欠收[32]，因此研究干旱條件下植物的抗旱機(jī)制具有重要意義。植物PLD是一類位于質(zhì)膜上的磷脂水解酶，有關(guān)研究表明[33]植物遭受逆境環(huán)境時(shí)可激活PLD，可引起植物膜系統(tǒng)磷脂降解產(chǎn)生PA，PA可作為第二信使參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。植物內(nèi)源H2S主要以L/D-Cys為底物，通過(guò)半胱氨酸脫巰基酶(CDes)的催化產(chǎn)生的。H2S可參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和生物及非生物脅迫應(yīng)答中重要的氣體信號(hào)分子，且NaHS被常用于植物H2S供體研究，參與多種脅迫應(yīng)答過(guò)程，例如外源H2S緩解鋁脅迫對(duì)大麥的生長(zhǎng)抑制[34]。干旱脅迫下植物體內(nèi)會(huì)合成大量ROS，導(dǎo)致生物膜脂過(guò)氧化，在一定程度上植物又會(huì)產(chǎn)生ROS清除劑(SOD、POD、CAT)來(lái)清除ROS自由基，以減輕干旱對(duì)細(xì)胞造成的損傷[35]。已有研究表明[36]，由PLD/PA介導(dǎo)的脂質(zhì)信號(hào)會(huì)調(diào)節(jié)暴露于短期和長(zhǎng)期低溫脅迫下大麥幼苗中H2O2水平。H2S通過(guò)上調(diào)抗氧化酶活性來(lái)減輕由Cd脅迫引起的細(xì)胞死亡，以去除過(guò)量的活性氧物質(zhì)并減少細(xì)胞氧化損傷[37]，但是關(guān)于高山冰緣植物PLD、ROS與H2S信號(hào)研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。本文主要以干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程中H2S調(diào)節(jié)高山離子芥的膜系統(tǒng)損傷程度、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶系中的作用，以及干旱脅迫下PLD、ROS與H2S信號(hào)分子在高山離子芥中的作用和可能存在的信號(hào)關(guān)系進(jìn)行研究，為深入研究干旱脅迫下H2S在高山離子芥中的信號(hào)作用奠定了一定的基礎(chǔ)。

細(xì)胞膜是具有選擇透過(guò)性半透膜，在一些逆境條件下如干旱、低溫等細(xì)胞膜會(huì)受損，造成植物細(xì)胞損傷，檢測(cè)細(xì)胞膜相對(duì)透性變化的指標(biāo)就是相對(duì)電導(dǎo)率(EL)。丙二醛(MDA)是膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，是長(zhǎng)期以來(lái)用于間接反應(yīng)細(xì)胞損傷程度的一個(gè)重要指標(biāo)[38]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.3 mol·L-1甘露醇模擬的干旱條件下，相對(duì)電導(dǎo)率顯著增加，當(dāng)外源添加NaHS后，干旱脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率有所下降(圖2A)，表明外源H2S在一定程度上可保護(hù)細(xì)胞膜透性，避免細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲。這與柏桂生等的研究[39]H2S可降低Cd脅迫下小麥種子的質(zhì)膜透性結(jié)果相似。也有研究表明[40]，在干旱脅迫下未經(jīng)NaHS處理植物幼苗中的MDA含量上升幅度始終高于NaHS處理，且MDA含量隨著干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸上升。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相一致，干旱脅迫可誘導(dǎo)MDA含量的顯著變化(圖2B)，高山離子芥細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增加，通過(guò)外源添加NaHS后，干旱脅迫下MDA含量與對(duì)照相比均顯著下降，說(shuō)明外源H2S能夠降低干旱脅迫下膜脂過(guò)氧化程度，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生從而降低對(duì)植物的傷害，緩解干旱脅迫對(duì)高山離子芥的不利影響。

干旱脅迫下植物通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持蛋白質(zhì)水化程度來(lái)減輕干旱對(duì)植物造成的傷害[41]在本研究中干旱誘導(dǎo)脯氨酸含量(圖3A)、可溶性糖含量(圖3B)積累，在干旱脅迫時(shí)間內(nèi)，脯氨酸含量、可溶性糖含量均呈上升趨勢(shì)，表明干旱誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)生改變來(lái)應(yīng)答所處的逆境環(huán)境。干旱脅迫下，通過(guò)外源添加NaHS后，脯氨酸含量、可溶性糖含量顯著高于0.3 mol·L-1甘露醇單處理，脅迫后期的下降可能是高山離子芥對(duì)干旱前期的抗旱鍛煉，對(duì)干旱作出的適應(yīng)性反應(yīng)。

干旱脅迫也會(huì)造成植物細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)爆發(fā)，造成膜脂過(guò)氧化進(jìn)而損害植物細(xì)胞，植物為了清除累積的ROS則會(huì)啟動(dòng)抗氧化酶清除系統(tǒng)如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)來(lái)清除植物體內(nèi)多余的活性氧，抑制膜脂過(guò)氧化作用，從而保護(hù)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使植物減輕甚至免受逆境脅迫的傷害[42]。本研究結(jié)果表明，外源H2S抑制干旱脅迫下高山離子芥ROS的產(chǎn)生，如圖6所示，H2O2含量(圖6A)、O·-2含量(圖6B)均能夠積極響應(yīng)干旱脅迫，H2O2含量達(dá)到最大值的時(shí)間早于O·-2含量，可能是因?yàn)镠2O2是產(chǎn)生O·-2的前體所致。通過(guò)外源添加NaHS，干旱脅迫下H2O2含量、O·-2含量得到不同程度的降低，說(shuō)明一定濃度的NaHS處理可以不同程度的減少干旱脅迫下ROS的積累，緩解干旱脅迫引起的氧化損傷，這與Shi等[43]的研究結(jié)果外源NaHS可以緩解脅迫并增強(qiáng)植物耐受性，且H2S上調(diào)了多種非生物和生物脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄物，與抑制活性氧(ROS)積累的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

干旱脅迫下，抗氧化酶系(SOD、POD和CAT)參與整個(gè)脅迫過(guò)程(圖4)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，脅迫后期有下降趨勢(shì)，說(shuō)明隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，高山離子芥試管苗的抗氧化能力下降，但均顯著高于對(duì)照組，其中SOD和MDA達(dá)到最大值的時(shí)間相類似，進(jìn)一步證明了干旱脅迫下抗氧化酶不能及時(shí)清除ROS導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化作用加強(qiáng)，導(dǎo)致更多的電解質(zhì)外漏，對(duì)高山離子芥試管苗造成傷害。外源添加H2S后，SOD、POD和CAT活性均有不同程度的提高，表明H2S可以提高干旱脅迫下高山離子芥試管苗的抗氧化能力，且NaHS處理下，3種酶可能在清除過(guò)量ROS過(guò)程中起到協(xié)同互補(bǔ)作用來(lái)增強(qiáng)高山離子芥試管苗抗旱能力。

已知ROS(圖6)、PLD活性和H2S含量(圖5)均能積極應(yīng)答干旱脅迫，暗示三者之間可能存在某種聯(lián)系。通過(guò)外源添加PLD下游產(chǎn)物磷脂酸(PA)以及PLD抑制劑正丁醇，研究PLD對(duì)ROS的影響。如圖7所示，外源添加PA能夠顯著增加干旱脅迫下H2O2含量和O·-2含量，而外源添加正丁醇后，H2O2含量和O·-2含量顯著降低，說(shuō)明ROS的產(chǎn)生與PA有關(guān)，PLD可能位于ROS上游發(fā)揮作用。二聯(lián)苯碘DPI可抑制ROS的產(chǎn)生，通過(guò)外施PA、DPI、正丁醇，研究干旱脅迫下，PLD、ROS和H2S三者之間的聯(lián)系。圖8表明，分別外源添加PA、H2O2均可顯著促進(jìn)干旱脅迫下H2S的釋放，表明干旱脅迫下H2S的產(chǎn)生與PLD、ROS有關(guān)，又如圖6所示，外源H2S會(huì)抑制ROS產(chǎn)生來(lái)緩解干旱脅迫造成的氧化損傷，另一方面，外源添加ROS供體H2O2又會(huì)顯著促進(jìn)H2S的釋放，表明H2S與ROS的信號(hào)關(guān)系不單單是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。當(dāng)同時(shí)外源添加PA與DPI后，DPI將ROS抑制后，干旱脅迫下H2S含量沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明PLD影響H2S的產(chǎn)生依賴于ROS，當(dāng)外源同時(shí)添加正丁醇與DPI后，PLD與ROS都抑制后，干旱脅迫下H2S含量顯著下降，進(jìn)一步表明干旱脅迫誘導(dǎo)的H2S產(chǎn)生與PLD、ROS密切相關(guān)，且ROS位于PLD上游，且位于H2S下游發(fā)揮作用(圖9)。

圖9 H2S調(diào)節(jié)干旱脅迫下高山離子芥的抗旱模式圖Fig.9 A model showing the H2S regulated rought-resistance of C.bungeana plantlets under drought stress

H2S響應(yīng)干旱脅迫下高山離子芥的作用如圖9所示，H2S會(huì)顯著降低干旱脅迫對(duì)高山離子芥試管苗細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷程度、提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與抗氧化酶系、抑制ROS產(chǎn)生，從而增強(qiáng)高山離子芥的抗旱能力；信號(hào)分子H2S、PLD活性和ROS對(duì)干旱脅迫均能做出響應(yīng)，干旱脅迫下，高山離子芥中ROS位于PLD的下游、H2S的上游發(fā)揮作用。后期將對(duì)信號(hào)分子H2S、PLD以及抗氧化酶合成基因等在干旱脅迫下的作用機(jī)制繼續(xù)進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步研究植物的抗旱機(jī)制提供部分依據(jù)。