孔令宇, 席 鏨, 馬文婷, 劉根生

(1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院, 河南 新鄉(xiāng) 453100; 2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院, 河南 新鄉(xiāng) 453100)

膿毒癥是重癥患者死亡的主要原因之一，膿毒癥和膿毒性休克導(dǎo)致的病死率分別高達(dá)50%和68%[1]。膿毒癥初期，在細(xì)菌內(nèi)毒素等物質(zhì)的誘導(dǎo)下，機(jī)體分泌大量炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致膿毒癥患者體內(nèi)存在強(qiáng)烈的免疫炎癥應(yīng)答。隨著疾病的持續(xù)進(jìn)展，機(jī)體出現(xiàn)免疫平衡紊亂和特異性免疫功能失調(diào)，使機(jī)體難以清除感染[2]，故膿毒癥患者存在著不同程度的細(xì)胞免疫功能紊亂或損害。目前國內(nèi)外對膿毒癥免疫障礙機(jī)制的研究越來越關(guān)注，尤其是經(jīng)臨床治療后，機(jī)體的免疫狀態(tài)與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有著密切關(guān)聯(lián)。近年來，連續(xù)性腎臟替代治療(continuous renal replacement therapy, CRRT)在非腎臟病領(lǐng)域的優(yōu)勢得以凸顯，傳統(tǒng)抗感染等集束化治療聯(lián)合CRRT能降低膿毒癥患者的炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答[3]。CRRT主要通過連續(xù)清除血液循環(huán)中的毒素、中小分子物質(zhì)、致病介質(zhì)來維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，具有清除率高、血流動力學(xué)穩(wěn)定等優(yōu)點。既往研究[4]已發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞參與膿毒癥疾病的主要過程，而CRRT對膿毒癥患者總T細(xì)胞數(shù)量、CD4+/CD8+T細(xì)胞比例等無明顯影響，但對膿毒癥患者CD8+T淋巴細(xì)胞的免疫功能影響尚不明確[5]。故本研究通過觀察膿毒癥患者CD8+T淋巴細(xì)胞的免疫功能變化，探究CRRT對膿毒癥患者CD8+T細(xì)胞免疫功能的影響。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2015年10月—2016年8月入住某院急診科的膿毒癥住院患者的病歷資料。膿毒癥的診斷依據(jù)2016年頒布的Sepsis 3.0膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；排除標(biāo)準(zhǔn)：既往存在慢性腎衰竭，需規(guī)律行透析的患者；接受過心、腎或肝移植術(shù)的患者；合并自身免疫性疾病的患者；合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病(如：惡性腫瘤終末期)的患者。本研究已取得患者及家屬的知情同意，并簽署知情同意書，研究方案經(jīng)該院倫理委員會審批通過，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 淋巴細(xì)胞分離液、LPS試劑均為美國Sigma公司產(chǎn)品。人CD8+T細(xì)胞分離液試劑盒為德國美天旎公司產(chǎn)品。干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)酶聯(lián)免疫斑點檢測(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)試劑盒、抗CD3-FITC和抗CD8-APC均為美國BD公司產(chǎn)品。Trizol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒PrimeScript RT reagent kit、實時定量PCR試劑盒STBR Premix Ex Taq均為TaKaRa公司產(chǎn)品。IFN-γ和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒為武漢華美公司產(chǎn)品。Trucount絕對計數(shù)管、CD3/CD4/CD8熒光標(biāo)記單克隆抗體、FACS Calibur流式細(xì)胞儀均為美國BD公司產(chǎn)品。磁力分離架為德國美天旎公司產(chǎn)品。ELISPOT讀板儀為德國AID公司產(chǎn)品。實時定量PCR分析儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 根據(jù)《中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南(2014)》[7]的推薦意見，所有膿毒癥患者均給予抗感染、針對原發(fā)病的對癥支持治療、機(jī)械通氣、預(yù)防深靜脈血栓等集束化治療，同時所有膿毒癥患者均在發(fā)病7 d內(nèi)行單次床旁CRRT，治療模式均為連續(xù)性靜脈-靜脈血液濾過(CVVHF)，血流量為180 mL/min，置換液量為4 L/h，持續(xù)透析24 h。濾器包括聚砜膜和AV69膜，血管通路均為股靜脈置管，置換液為碳酸氫鹽置換液，抗凝方式包括枸櫞酸和低分子肝素抗凝。

1.3.2 研究方法

1.3.2.1 外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)的分離 分別于CRRT前后采集膿毒血癥患者EDTA抗凝外周血10 mL，使用密度梯度離心法分離PBMCs(107個/mL)，于37℃、5% CO2條件下，用含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2.2 CD8+T淋巴細(xì)胞的純化與計數(shù) 應(yīng)用磁珠分離法純化CD8+T淋巴細(xì)胞：取107個PBMCs，離心后應(yīng)用40 μL緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL生物素標(biāo)記的抗體雞尾酒，混勻后于4℃靜置孵育5 min，加入30 μL緩沖液和20 μL CD8+T細(xì)胞免疫磁珠雞尾酒，混勻后于4℃靜置孵育10 min，將細(xì)胞懸液加入分離柱中，收集流出液，其中含有未被標(biāo)記的富集的CD8+T淋巴細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T淋巴細(xì)胞計數(shù)：向TruCOUNT絕對計數(shù)管中準(zhǔn)確加入20 μL CD3/CD4/CD8熒光標(biāo)記單克隆抗體和50 μL抗凝全血，4℃避光孵育15 min后加入450 μL FACS紅細(xì)胞裂解液，室溫避光孵育45 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測，MultiSET軟件分析CD8+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)。

1.3.2.3 脂多糖(LPS)刺激后分泌IFN-γ的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù) 向包被抗IFN-γ單克隆抗體的96孔PVDF膜板中加入100 μL PBMCs(106個/mL)和LPS(10 μg/L)，陽性對照組加入PBMCs和植物血凝素，陰性對照僅加入PBMCs，于37℃、5%CO2條件下孵育12 h，洗滌后每孔加入100 μL生物素標(biāo)記的抗IFN-γ單克隆抗體，室溫孵育1 h，洗滌后每孔加入100 μL堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈球菌親和素，室溫避光孵育45 min，洗滌后加入顯色劑反應(yīng)15～20 min。終止反應(yīng)后使用ELISPOT讀板儀計數(shù)，以斑點形成細(xì)胞數(shù)(spot forming cells, SFC)/106PBMCs為單位計數(shù)產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T淋巴細(xì)胞。

1.3.2.4 檢測CD8+T細(xì)胞中細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)、程序性死亡受體1(PD-1)、T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域的分子3(TIM-3)、CD28、IFN-γ、TNF-α的表達(dá) 應(yīng)用實時定量PCR檢測CD8+T細(xì)胞CTLA-4、PD-1 、含TIM-3和CD28的表達(dá)：取106個分離的CD8+T細(xì)胞，加入LPS刺激培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清進(jìn)行后續(xù)實驗。將收集的細(xì)胞于2 h內(nèi)使用Trizol試劑提取總RNA。建立反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。建立SYBR實時定量PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性(95℃，30 s)；PCR反應(yīng)(95℃，5 s；60℃，30 s)。應(yīng)用2-ΔΔCT法對目的片段的相對表達(dá)水平進(jìn)行分析。引物序列如表1所示。收集培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α的表達(dá)水平。

表1 實時定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 一般資料 2015年10月—2016年8月共有37例膿毒癥住院患者符合入選條件，其中男性23例，女性14例，平均年齡為(49.83±11.52)歲。引發(fā)膿毒癥病因有肺部感染(22例)、腹腔感染(10例)、急性重癥胰腺炎(2例)、多發(fā)傷(2例)、植入物感染(1例)。所有患者血培養(yǎng)均為革蘭陰性(G-)菌，其中感染的細(xì)菌種類為肺炎克雷伯菌(22株)、鮑曼不動桿菌(11株)、陰溝腸桿菌(3株)。

2.2 CRRT前后患者一般情況比較 膿毒癥患者接受CRRT后平均動脈壓、血紅蛋白、血小板計數(shù)、清蛋白、血鉀、血鈉、APACHE Ⅱ評分、SOFA評分較治療前均無明顯變化(均P>0.05)；體溫、心率、白細(xì)胞計數(shù)、尿素氮、血肌酐水平均較治療前下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

2.3 CRRT前后總CD8+T細(xì)胞數(shù)量和分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞數(shù)量 膿毒癥患者總CD8+T細(xì)胞數(shù)量在CRRT前后無明顯變化(P>0.05)；CRRT后分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞數(shù)量較治療前升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4 CRRT前后CTLA-4、PD-1、TIM-3、CD28、IFN-γ、TNF-α表達(dá)情況 膿毒癥患者經(jīng)CRRT后CD8+T細(xì)胞(受LPS刺激后)產(chǎn)生抑制性分子CTLA-4、PD-1、TIM-3 mRNA的水平均較治療前降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而產(chǎn)生共刺激性分子CD28 mRNA的水平較治療前升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CRRT后CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平較治療前升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但分泌TNF-α的水平治療前后無明顯變化(P>0.05)。見表4。

表2 CRRT前后膿毒癥患者一般情況比較

表3CRRT前后總CD8+T細(xì)胞和分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞數(shù)量比較

Table3 Comparison of total CD8+T cell count and IFN-γ-secreting CD8+T cell count before and after CRRT

組別總CD8+T細(xì)胞(個/μL)分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞(SFC/106 PBMCs)治療前450.50±62.9840.25±9.00治療后426.80±84.5691.25±21.58t0.4343.584P0.6940.037

3 討論

隨著對CRRT認(rèn)識的深入和技術(shù)的完善，CRRT在膿毒癥治療中的作用已得到了廣泛認(rèn)可。CRRT不僅能有效清除膿毒癥患者中小分子溶質(zhì)、與膿毒癥相關(guān)的炎癥因子、糾正電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂，而且還可在穩(wěn)定血流動力學(xué)的基礎(chǔ)上改善免疫應(yīng)答失衡、保護(hù)重要臟器功能、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8-9]。

表4 CRRT前后CD8+T細(xì)胞中抑制性分子、CD28 mRNA及分泌細(xì)胞因子變化

因此，無論膿毒癥患者是否存在急性腎功能-損傷，均可在集束化治療的基礎(chǔ)上加用CRRT，最終降低膿毒癥患者病死率。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者經(jīng)CRRT后，白細(xì)胞計數(shù)、尿素氮、血肌酐較治療前改善，提示CRRT對小分子溶質(zhì)有良好的清除作用；同時患者體溫、心率較治療前下降，考慮不但與炎癥介質(zhì)清除有關(guān)，還可能與治療時置換液的溫度導(dǎo)致物理降溫有關(guān)?；颊逤RRT前后平均動脈壓、血紅蛋白、清蛋白、血鉀、血鈉均未見明顯變化，提示CRRT具有良好的血流動力學(xué)穩(wěn)定性，且對患者的營養(yǎng)狀態(tài)影響不大，進(jìn)一步證實了CRRT對膿毒癥患者的安全性和有效性[10]。

既往研究[11]表明，膿毒癥患者通常對由CD8+T細(xì)胞控制的細(xì)胞內(nèi)病原體的“繼發(fā)性”感染高度敏感。在外源性致敏源的刺激下，CD8+T細(xì)胞通過特異性識別由MHC I類分子提呈的內(nèi)源性抗原肽，進(jìn)而殺傷病原體感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，在感染和腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用；CD8+T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用可通過分泌細(xì)胞因子、調(diào)控靶細(xì)胞壞死和凋亡等機(jī)制實現(xiàn)，同時多種因素可調(diào)控CD8+T細(xì)胞免疫功能[12]。Burnner等[13]研究已證實，在嚴(yán)重膿毒癥發(fā)展過程中出現(xiàn)了傾向于Th2型的免疫反應(yīng)，即T細(xì)胞免疫有向Th2方向漂移趨勢，明顯損害了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。由于本研究中CD8+T細(xì)胞免疫功能需要對其進(jìn)行刺激培養(yǎng)，對膿毒癥患者而言，G-菌感染占大多數(shù)，同時LPS作為G-菌細(xì)胞壁最外層的類脂多糖類物質(zhì)，雖抗原性較弱，但毒性作用大致相同，可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、休克等癥狀；因此，在本研究中選擇了G-菌感染所致的膿毒癥患者作為研究對象，使用LPS作為刺激源對膿毒癥患者CD8+T細(xì)胞免疫功能進(jìn)行分析。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者在CRRT前后總CD8+T細(xì)胞的數(shù)量無明顯變化，與既往研究[5]結(jié)果一致。但在LPS刺激下，無論總PBMCs中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量還是分離純化的CD8+T細(xì)胞直接分泌IFN-γ的水平，在CRRT后均明顯升高，提示CRRT可提升CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力。IFN-γ是殺傷細(xì)胞內(nèi)寄生病原體的主要細(xì)胞毒性因子，進(jìn)一步提示CRRT可提升CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞殺傷功能，進(jìn)而有效控制膿毒癥的病情進(jìn)展。

然而，CRRT提升CD8+T細(xì)胞免疫功能的機(jī)制尚不清楚，抑制性免疫分子可調(diào)控CD8+T細(xì)胞免疫功能。在膿毒癥患者中，抑制性免疫分子PD-1、CTLA-4和TIM-3在CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)升高，提示上述抑制性因子可促進(jìn)膿毒癥患者CD8+T細(xì)胞衰竭，抑制免疫應(yīng)答，導(dǎo)致機(jī)體不能清除病原體而使疾病進(jìn)展[14]。同時，PD-1/PD-L1和TIM-3信號通路均可作為預(yù)測膿毒癥/膿毒性休克治療效果和預(yù)后的指標(biāo)[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者經(jīng)CRRT后，即使經(jīng)LPS刺激，分離純化的CD8+T細(xì)胞中PD-1、CTLA-4和TIM-3 的表達(dá)水平明顯降低，而共刺激分子CD28水平顯著升高，提示CRRT可通過降低抑制性免疫分子的表達(dá)促進(jìn)CD8+T細(xì)胞免疫功能，但這種作用是直接性還是間接性還有待進(jìn)一步研究，同時在患者免疫系統(tǒng)中體液免疫和細(xì)胞免疫之間的相互作用，未作為研究的關(guān)注點。本次研究未包含革蘭陽性菌感染的膿毒血癥患者，由于不同種類的細(xì)菌代謝產(chǎn)物等有所不同，可能對CD8+T細(xì)胞免疫功能的激活途徑不同，希望后期實驗對這個因素進(jìn)行排除干擾。

總之，CRRT在膿毒癥患者的治療中具有良好的安全性和有效性，不但能改善膿毒癥患者的生命體征和腎功能，還可增強(qiáng)膿毒癥患者外周血CD8+T細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)機(jī)體清除病原體感染，對降低膿毒癥患者病死率和改善預(yù)后均具有重要意義。