陳 嬌，劉 康，李劍平，吳秀珍，胡雪飛，陳開森，陳 賀

(1 江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，江西 南昌 330052； 2 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006； 3 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii，AB)是醫(yī)院感染的常見病原菌之一，廣泛分布在醫(yī)院環(huán)境中，可引起嚴(yán)重的肺炎、尿路感染、血流感染等多種醫(yī)院感染，特別易引起免疫力低下重癥患者的感染[1-3]。AB對(duì)多種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥，使其成為最具有挑戰(zhàn)性的病原菌之一，Xie等[4]報(bào)道，在過去的16年(2006—2016年)經(jīng)合組織國(guó)家AB的耐藥性在快速增長(zhǎng)；AB由于多重耐藥，限制了抗感染治療的選擇，使疾病更為嚴(yán)重[5]。因此，AB感染已成為日益顯著的公共健康問題[6]和全球醫(yī)院感染的主要的威脅[7]。AB的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，可由多種耐藥機(jī)制介導(dǎo)，如外膜蛋白表達(dá)改變，造成抗菌藥物通透障礙；拓?fù)洚悩?gòu)酶和DNA旋轉(zhuǎn)酶的改變；多種藥物的外排泵過度表達(dá)；PBPs改變；β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生等[8]。主動(dòng)外排泵機(jī)制是AB出現(xiàn)耐藥的主要機(jī)制之一，其可以將進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)的藥物排出，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)藥物濃度降低，使抗菌藥物不足以發(fā)揮抗菌作用而出現(xiàn)耐藥。與AB耐藥有關(guān)的外排系統(tǒng)主要有ATP結(jié)合盒式蛋白家族(ATP-binding cassette superfamily，ABC)、耐藥結(jié)節(jié)分化家族(resistance-nodulation family，RND)、小多耐藥家族(small multidrug resistance family，SMR)、多藥與毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family，MATE)和主要易化因子超家族(major facilitator superfamily，MFS)，其中RND主動(dòng)外排系統(tǒng)在革蘭陰性菌中普遍存在，并且有大量的研究報(bào)道[9]，AB的多重耐藥與RND基因過度表達(dá)密切相關(guān)。本文將探討AB中RND主動(dòng)外排系統(tǒng)的分布情況,比較不同耐藥表型的AB間外排泵基因的表達(dá)情況，從而闡述其與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 59株AB來自于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床送檢的各種標(biāo)本。ATCC 25922、ATCC 27853菌株由江西省臨床檢驗(yàn)中心吳茂紅主任技師贈(zèng)予，ATCC 19606菌株購(gòu)自Microbiologics公司。

1.3 鮑曼不動(dòng)桿菌DNA的制備 按照Omega公司細(xì)菌DNA提取試劑盒的操作步驟提取菌株DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增 PCR引物由上海Sangon合成。具體引物序列及引物長(zhǎng)度見表1。

表1 普通PCR的基因引物序列及產(chǎn)物大小

1.5 DNA序列驗(yàn)證 所獲基因的DNA序列均由上海Sangon測(cè)序后經(jīng)NCBI GenBank Blast驗(yàn)證。

1.6 外排泵基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

1.6.1 試驗(yàn)菌株 從59株AB中挑取8株同時(shí)攜帶三種RND外排泵基因且耐藥性具有一定差別的菌株作為試驗(yàn)菌株，對(duì)其進(jìn)行外排泵基因的相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定，8株AB試驗(yàn)菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥結(jié)果見表2。

表2 8株AB試驗(yàn)菌株對(duì)臨床常見抗菌藥物的敏感結(jié)果

R:耐藥；I:中介；S:敏感

1.6.2 總RNA提取 按照Omega公司細(xì)菌RNA提取試劑盒的操作步驟提取菌株RNA，使用核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA的濃度，并取RNA進(jìn)行電泳。

1.6.3 逆轉(zhuǎn)錄 (1)逆轉(zhuǎn)錄前需要去除殘留DNA；(2)冰上配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：采用Transgen公司的cDNA合成試劑盒合成cDNA。

1.6.4 熒光定量PCR(RT-PCR)擴(kuò)增外排泵系統(tǒng)相關(guān)基因 熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括上、下游引物(引物序列見表3)各0.4 μL, cDNA模板2 μL， Mix 10 μL，Passive Reference 0.4 μL，用RNase-free H2O補(bǔ)足體積。擴(kuò)增條件為三步法，第一步95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；第二步95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-△△Ct的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，△Ct=Ct目的基因- Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct耐藥菌株-△Ct標(biāo)準(zhǔn)菌株。

表3熒光定量PCR的基因引物序列及產(chǎn)物大小

Table3 Gene primer sequences and product size of real-time PCR

基因引物序列(5’-3’)產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)16SrRNA-FCAGCTCGTGTCGTGAGATGT15016SrRNA-RCGTAAGGGCCATGATGACTT qadeB-F ACAAGACCGCGCTAACTTAGGT67qadeB-R TGCCATTGCCATAAGTTCATCT qadeR-F CGCTCTAGTGCATCGCTATC313qadeR-R GCATTACGCATAGGTGCAGA qadeS-FTCGCAAAGCGTTTTATTGTG175qadeS-RGCATTTTTGACGGAAACCTC qadeJ-FGGTCATTAATATCTTTGGC222qadeJ-RGGTACGAATACCGCTGTCA qadeG-FTTCATCTAGCCAAGCAGAAG469qadeG-RGTGTAGTGCCACTGGTTACT

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)中采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(GraphPad Prism 5軟件)，當(dāng)P≤0.5認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AB臨床分布及耐藥性 臨床分離的59株AB主要來自于新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(NICU，15株，25.4%)，其次來自于綜合重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU，11株，18.6%)、神經(jīng)外科(10株，16.9%)，有27.1%的AB來自于其他ICU(燒傷外科ICU及急診ICU各5株，呼吸內(nèi)科ICU 3株，心胸外科ICU 2株，神經(jīng)內(nèi)科ICU 1株)。74.6%(44株)的AB來自于痰，其次來自于血(5株，8.5%)。54.2%(32株)的AB對(duì)SAM、IPM、GEN、CIP、LVX均耐藥，AB對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況見表4。

表459株AB對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況

Table4 Antimicrobial resistance of 59 strains of AB to commonly used antimicrobial agents

抗菌藥物耐藥株數(shù)耐藥率(%)SAM55 93.2TZP53 89.8CAZ57 96.6FEP56 94.9IPM56 94.9GEN52 88.1TOB43 72.9CIP57 96.6LVX31 52.5SXT40 67.8

2.2 AB主動(dòng)外排泵基因及整合子的檢測(cè)結(jié)果 59株AB經(jīng)外排泵及整合子基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)，48株(81.4%)攜帶adeR，54株(91.5%)攜帶adeS，55株(93.2%)攜帶adeB，59株(100%)攜帶adeJ，36株(61.0%)攜帶adeG。AB菌株外排泵基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。

2.3adeR及adeS基因測(cè)序結(jié)果 對(duì)adeABC外排泵的調(diào)控基因adeR和adeS的堿基序列進(jìn)行比對(duì)分析，AB試驗(yàn)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株19606的基因序列一致性達(dá)100%，未出現(xiàn)基因突變或插入序列。AB試驗(yàn)菌株adeR、adeS基因PCR產(chǎn)物部分測(cè)序結(jié)果見圖2-3。

注：1泳道為Marker；2—6泳道分別為AB菌株adeR、adeS、adeB、adeJ、adeG基因陽性標(biāo)本

圖1AB菌株外排泵基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure1 Electrophoresis map of PCR amplified product of efflux pump genes of AB strains

圖2 AB試驗(yàn)菌株adeR基因PCR產(chǎn)物部分測(cè)序結(jié)果

圖3 AB試驗(yàn)菌株adeS基因PCR產(chǎn)物部分測(cè)序結(jié)果

2.4 主動(dòng)外排系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)水平 采用熒光定量PCR對(duì)AB試驗(yàn)菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株19606進(jìn)行主動(dòng)外排系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測(cè)，結(jié)果見表5。

2.5 主動(dòng)外排泵基因的表達(dá)與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系 按細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性將AB分為耐藥組及非耐藥組，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GEN、IPM、SAM耐藥組與非耐藥組adeB、adeJ基因的表達(dá)量相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

表5AB試驗(yàn)菌株主動(dòng)外排泵基因的相對(duì)表達(dá)量

Table5 Relative expression of efflux pump genes in tested AB strains

菌株adeSadeRadeBadeJadeG196061.00 1.00 1.00 1.00 1.00 AB42.344.2210.737.241.25AB92.672.1914.91 8.71 1.34 AB272.171.912.242.281.56AB542.142.253.783.351.67AB783.232.677.67 5.34 1.57 AB792.211.893.233.452.01AB831.071.671.571.541.12AB853.544.579.565.682.35

注：R為耐藥組，S為敏感組

3 討論

在不動(dòng)桿菌屬中，AB是引起醫(yī)院感染最重要的病原菌之一[10]，也是引起與機(jī)械通氣相關(guān)肺炎的最常見細(xì)菌之一[11]，一旦擴(kuò)散，極易造成暴發(fā)流行。本研究中71.2%的AB菌株來源于ICU，74.6%的AB菌株來源于痰標(biāo)本。由于抗菌藥物的不合理使用及醫(yī)院感染管理控制措施的缺失或執(zhí)行不到位，使得細(xì)菌的耐藥性呈不斷上升趨勢(shì)，多重耐藥AB(multidrug-resistantAcinetobacterbaumannii，MDR-AB)已成為醫(yī)院感染的主要病原菌[7]，并在全球播散。本文探討的主動(dòng)外排系統(tǒng)機(jī)制是AB主要耐藥機(jī)制之一，科學(xué)家們通過利用外排泵抑制劑，如羰基氰氯苯腙等作用于MDR-AB，從而改變AB的耐藥表型來證明主動(dòng)外排系統(tǒng)在MDR-AB中的作用，本文則通過AB不同的耐藥表型與外排泵基因的不同表達(dá)，探索AB耐藥性與主動(dòng)外排系統(tǒng)之間的復(fù)雜關(guān)系。

RND家族是不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌最主要也是最早發(fā)現(xiàn)的外排泵系統(tǒng)，由于其外排底物的廣泛性，外排泵的過度表達(dá)可使更多的抗菌藥物被排出菌體外，從而引起多重耐藥。RDN外排泵一般由膜融合蛋白(MFP)、RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、外膜蛋白(OMF)三部分組成，其中MFP使細(xì)菌內(nèi)外膜結(jié)合緊密，使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有識(shí)別藥物并將其主動(dòng)轉(zhuǎn)出細(xì)胞膜的功能；OMF位于細(xì)胞外膜，具有孔道蛋白的作用，使藥物排出菌體[9]。此三種蛋白通常由操縱子編碼，其中RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特征決定了底物的廣泛性，常作為流行病學(xué)的檢測(cè)指標(biāo)。在AB中已發(fā)現(xiàn)與多重耐藥相關(guān)的RND外排系統(tǒng)主要有adeABC、 adeIJK、adeFGH、adeDE、adeXYZ，其中對(duì)AdeDE、AdeXYZ研究較少，其表達(dá)及調(diào)控機(jī)制還未見報(bào)道。目前少有AB外排泵基因流行情況的報(bào)道，本文通過檢測(cè)RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白adeB、adeJ、adeG外排泵基因，分析adeABC、 adeIJK、adeFGH外排泵在AB中的存在情況，研究發(fā)現(xiàn)55株(93.2%)AB攜帶adeB基因，59株(100%)AB攜帶adeJ，36株(61.0%)AB攜帶adeG，可見RND外排系統(tǒng)在AB中普遍存在。López等[12]報(bào)道，RND主動(dòng)外排系統(tǒng)在病原菌毒力因子的調(diào)節(jié)、排除細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡和細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面均有一定的作用，此或許是RND在細(xì)菌中普遍存在的原因。

為更好地揭示AB耐藥性與RND外排泵基因表達(dá)之間的關(guān)系，本研究從試驗(yàn)菌株中挑選了耐藥表型不同的AB，檢測(cè)其不同外排泵基因的表達(dá)。從熒光定量PCR的結(jié)果分析來看，AB耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，主動(dòng)外排系統(tǒng)僅起到了部分作用，對(duì)一種抗菌藥物耐藥可與多種外排泵基因有關(guān)，但一種主動(dòng)外排系統(tǒng)同時(shí)可以導(dǎo)致AB對(duì)多種抗菌藥物出現(xiàn)MIC值升高或耐藥。在本研究中經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，GEN、IPM、SAM耐藥組與非耐藥組ABadeB、adeJ基因的表達(dá)量相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且耐藥組均表現(xiàn)為多重耐藥，其他抗菌藥物耐藥組及非耐藥組RND外排泵基因的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Chang等[13]報(bào)道，adeABC外排泵的過度表達(dá)與氨基糖苷類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類、替加環(huán)素等抗菌藥物的耐藥性有關(guān)，而AB對(duì)氨基糖苷類耐藥與adeABC或abeM(MATE)有關(guān)，對(duì)氟喹諾酮類耐藥與adeABC、adeIJK、adeFGH、abeS(SMR)、abeM(MATE)有關(guān)，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥與adeABC、adeIJK有關(guān)[14]。

RND外排泵中adeABC是由位于adeB基因上游的adeR與adeS基因分別編碼的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白adeR和感應(yīng)激酶adeS這兩種蛋白組成調(diào)控系統(tǒng)控制的[15]。研究[16]表明，adeRS的變異與adeABC的過度表達(dá)和耐藥性有關(guān)。本研究中adeABC外排泵的調(diào)控基因adeR和adeS的堿基序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株19606的基因序列一致性達(dá)100%，未出現(xiàn)基因突變或插入序列?？梢姳狙芯恐械腁B菌株adeABC外排泵的表達(dá)升高并不是由其調(diào)控基因adeR、adeS的基因突變或插入序列引起，可能存在其他機(jī)制。

總之，AB的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，其中RND外排系統(tǒng)在MDR-AB中普遍存在，RND外排系統(tǒng)中adeB和adeJ基因的表達(dá)水平升高與細(xì)菌對(duì)GEN、IPM、SAM的耐藥性有關(guān)，adeABC外排泵的調(diào)控系統(tǒng)adeR、adeS基因未見突變或插入序列，其表達(dá)升高可能存在其他機(jī)制。