周 凡 方 偉 祝光禮

心力衰竭是臨床極為常見(jiàn)的危重癥，是目前心血管領(lǐng)域非常重要的一項(xiàng)公共健康問(wèn)題。調(diào)查研究[1-2]表明，國(guó)外人群中心力衰竭的得病率約為1.5%～2%，65歲以上人群得病率達(dá)到6%-10%，我國(guó)的得病率相比國(guó)外稍低，但也達(dá)到0.9%。心衰時(shí)心肌能量代謝發(fā)生改變，葡萄糖代謝和脂質(zhì)異常，引起代謝循環(huán)代謝底物—游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）逐漸增多，加重能量代謝障礙，損傷線粒體功能，AMPKPGC-1α通路在心力衰竭能量代謝重構(gòu)中意義重大。本課題采用腹主動(dòng)脈縮窄法制做心衰大鼠模型，以曲美他嗪為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)對(duì)血清B型腦尿鈉肽（Brain natriuretic peptide，BNP）、FFA、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）及單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、磷酸化 AMPK（phosphorylation ofAMP-activated protein kinase，P-AMPKα）、過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（peroxisome pro-liferatorsactivated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α） 的檢測(cè)，觀察指標(biāo)進(jìn)一步明確參附強(qiáng)心合劑對(duì)心衰大鼠心肌能量代謝AMPK-PGC-1α通路的影響，以此闡明參附強(qiáng)心合劑對(duì)治療心衰的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 SD雄性大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量（140±10）g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK（浙）2013-0016。分籠飼養(yǎng)，保持室內(nèi)恒溫，溫度（24±1）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，通風(fēng) 8～15 次/h，標(biāo)準(zhǔn)飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要藥物 參附強(qiáng)心合劑（紅參3g，附子5g，葶藶子10g，玉竹15g，煎煮濃縮成2g/mL的生藥煎劑，由杭州市中醫(yī)院制劑室提供）；鹽酸曲美他嗪片（規(guī)格：30mg/片，批號(hào)2006150，施維雅制藥有限公司生產(chǎn)）。

1.3 主要試劑 戊巴比妥鈉（上海西堂生物科技有限公司，批號(hào)151121），BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊 GE公司，批號(hào) PLL-2016-11），PVDF膜（杭州達(dá)文生物有限公司，批號(hào)R8AA4656C）、Anti-AMPK alpha 1抗體（abcam）、Anti-PGC1 alpha抗體（abcam）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型及分組 選取雄性SD大鼠共60只，從中隨機(jī)取8只作為假手術(shù)組，余為手術(shù)組。稱重后根據(jù)每只大鼠的體質(zhì)量分別用配置好的3%戊巴比妥鈉（1mL/kg）麻醉。將麻醉后的大鼠固定于鼠板上，在腹部正中做一個(gè)約2cm的切口，鈍性分離腹主動(dòng)脈，沿腹主動(dòng)脈找腎動(dòng)脈分支，在該分支上方約2mm處將特殊處理的7號(hào)針頭與腹主動(dòng)脈用4號(hào)縫合線一起結(jié)扎，抽出探針，形成腹主動(dòng)脈大約50%狹窄，同時(shí)腹腔內(nèi)注射10萬(wàn)單位青霉素，關(guān)腹縫合。假手術(shù)組僅分離出腹主動(dòng)脈，不行縮窄術(shù)。所有大鼠均喂予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。造模4周后，分別隨機(jī)從假手術(shù)組與手術(shù)組中取6只大鼠共12只，采用眼眶采血法取血，檢測(cè)血清腦鈉肽水平以判定造模是否成功。

2.2 分組及給藥 將造模成功且存活的40只大鼠，隨機(jī)分為模型組（n=8），參附強(qiáng)心合劑高劑量組（n=8），參附強(qiáng)心合劑中劑量組（n=8），參附強(qiáng)心合劑低劑量組（n=8），曲美他嗪組（n=8）。于造模后第 5周開始藥物溶液灌胃，每日定時(shí)灌胃一次。假手術(shù)組與模型組則用等量生理鹽水灌胃；中藥組參照陳奇主編的《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[3]中關(guān)于動(dòng)物與人體體質(zhì)量折算表來(lái)計(jì)算，按60kg成人1天1帖參附強(qiáng)心合劑（共生藥量33g），低、中、高各劑量1:2:4的比例來(lái)算，參附低劑量組為3.45g/kg，參附中劑量組為6.88g/kg，參附高劑量組為13.75g/kg。西藥組參照陳淑云主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[4]中關(guān)于人與動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值表來(lái)計(jì)算，60kg成人1天服用曲美他嗪95mg，大鼠的等效劑量為曲美他嗪9.98mg/kg。給藥時(shí)間4周。

2.3 標(biāo)本的收集與檢測(cè) 末次給藥24h后處死大鼠，并取腹主動(dòng)脈血、左心室組織等。采用ELISA法檢測(cè)血清BNP、FFA、LDH含量；用Western blot法檢測(cè)心肌組織AMPK、p-AMPK、PGC-1α蛋白含量，各蛋白至少重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，方差齊者，多組間采用one-way ANOVA，組間兩兩比較用配對(duì)零均值檢驗(yàn)法；方差不齊者，采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠BNP、LDH、FFA含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組BNP、LDH、FFA水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組 BNP、LDH、FFA水平均顯著降低（P＜0.05）；其中，中藥高劑量組 BNP、FFA水平與曲美他嗪組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；中藥高、中劑量組LDH水平與曲美他嗪組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 各組心衰大鼠血清BNP、LDH、FFA 含量（ng/mL，x±s）

3.2 各組大鼠AMPK、p-AMPK、PGC-1α表達(dá)比較

各組AMPK蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)顯著差異（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組p-AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，中藥高劑量組p-AMPK蛋白表達(dá)與曲美他嗪組均明顯增加（P＜0.01），中藥高劑量組與曲美他嗪組之間未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）；各用藥組 PGC-1α蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），且中藥各劑量組PGC-1α蛋白表達(dá)與曲美他嗪組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

4 討論

在中醫(yī)古籍中并無(wú)“心衰”病名的記載，但總結(jié)其病因病機(jī)、癥候，多歸于中醫(yī)“痰飲”、“心悸”、“喘癥”、“水腫”等的范疇。原明忠老教授[5]認(rèn)為，“心氣虛”是心衰的根本原因和病理基礎(chǔ)。馬金等[6]總結(jié)臨證經(jīng)驗(yàn)，指出氣虛進(jìn)一步導(dǎo)致“陽(yáng)虛”，終致心脈瘀阻，痰濁水濕內(nèi)停。而心陽(yáng)不能下溫腎陽(yáng)，心腎水火失濟(jì)，致使腎虛不化，腎脈瘀阻，最終陽(yáng)虛及陰，導(dǎo)致陰陽(yáng)俱虛，陰不斂陽(yáng)，陽(yáng)氣虛脫[7]。由此可見(jiàn)，益氣溫陽(yáng)之法在心衰治療中的地位。祝光禮教授在長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)中，結(jié)合中醫(yī)對(duì)心衰病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，以益氣溫陽(yáng)利水為立論，在歷史名方參附湯基礎(chǔ)上加入葶藶子與玉竹，立方參附強(qiáng)心合劑。原方參附湯源于《婦人良方》，功用回陽(yáng)救逆，益氣固脫；葶藶子可降氣平喘利水，使水道通調(diào)，肺氣清肅，玉竹滋陰養(yǎng)心，還可牽制附子，避免其助陽(yáng)太過(guò)?，F(xiàn)代研究[8]認(rèn)為，參附注射液能夠使心肌細(xì)胞的總腺苷酸池、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、腺苷二磷酸（ADP）、磷酸腺苷（AMP）含量明顯提高，具有保護(hù)心肌能量代謝的作用。另外，參附湯還能抑制參與心肌能量代謝的Ca-NFAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，改善心功能。

表2 各組心衰大鼠AMPK、p-AMPK、PGC-1α半定量比值（ng/mL，x±s）

BNP是判定心衰的重要生化指標(biāo)，LDH活性也是判斷細(xì)胞壞死程度的重要指標(biāo)之一。心衰時(shí)FFA利用減少造成心臟脂質(zhì)沉積，發(fā)生脂質(zhì)代謝異常，加重能量代謝障礙，損傷線粒體功能。在本次實(shí)驗(yàn)中，觀察用血清Elisa法測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，中藥各組能降低BNP、LDH、FFA水平，且劑量越高降低幅度越大，其中BNP水平提示中藥高劑量組與西藥組作用相似；LDH、FFA水平提示高劑量和中劑量組與西藥組作用相似。從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，參附強(qiáng)心合劑可能通過(guò)減少心肌細(xì)胞壞死，加強(qiáng)游離脂肪酸氧化供能，改善脂質(zhì)代謝，從而一定程度上改善心衰大鼠心肌能量代謝。

AMPK在機(jī)體內(nèi)是重要的調(diào)控因子，是細(xì)胞能量變化感受器，可調(diào)節(jié)下游多組通路，調(diào)控細(xì)胞凋亡、能量代謝等進(jìn)而影響機(jī)體各種疾病的發(fā)生與發(fā)展。在線粒體保護(hù)方面，AMPK可首先激活PGC-1α。PGC-1α是重要的促線粒體生物合成因子，能夠調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量和質(zhì)量，參與脂肪酸氧化過(guò)程[9]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，參附強(qiáng)心合劑可能通過(guò)激活A(yù)MPKPGC-1α作為參與線粒體生物合成及功能狀態(tài)有關(guān)的信號(hào)通路，提高p-AMPK、PGC-1α的表達(dá)，降低血清FFA水平以調(diào)節(jié)脂肪酸氧化代謝及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，改善心衰大鼠心肌能量代謝，減少FFA對(duì)內(nèi)皮損傷作用，并促進(jìn)線粒體生物合成。綜上所述，參附強(qiáng)心合劑在一定程度上能夠改善心衰大鼠的心肌能量代謝重構(gòu)，從而起到治療心衰的作用。