彭心怡 倪鍇文 丁陽陽 金紅婷 王 萍

川楝子是楝科植物川楝（Melia toosendan Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果實(shí)，有小毒，歸肝、小腸、膀胱經(jīng)。2010年版《中國藥典》中記載川楝子是一味廣泛應(yīng)用于肝郁化火，胸脅、脘腹脹痛，疝氣疼痛及蟲積疼痛的藥物，但因其毒性，尤其對肝、腎等器官影響較大[1-2]，故不可久用。絞股藍(lán)，葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán) （Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）的干燥根莖或全草，其有效成分絞股藍(lán)皂苷多作為護(hù)肝藥物用于降低血脂[3]、治療脂肪肝[4]。目前對于川楝子肝毒性的研究較多集中于急性損傷[5-8]。有研究[6-10]表明，通過白芍、小茴香、延胡索等中藥配伍后可減少川楝子肝毒性。而關(guān)于川楝子長期用藥，長期與其他中藥配伍對肝臟損傷的研究報道則較少[8，10]。同時絞股藍(lán)對川楝子肝毒性的減毒作用及其機(jī)制的研究未見報道[11]。本文探討單用川楝子與川楝子、絞股藍(lán)合用18天對小鼠肝臟的影響及作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級，ICR小鼠28只，雌雄各半，體質(zhì)量15～20g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心。

1.2 試劑與儀器 川楝子（批號170603）、絞股藍(lán)（批號170601），購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)名中醫(yī)館。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（批號 07495/00003783）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（批號 07481/00003747），購于德賽（Diasys Diagnotics Systems GmbH）公司。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號20170519）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號20170418）、考馬斯亮蘭試劑盒（批號20171228），均購于南京建成生物工程研究所。HITACHI7020自動生化分析儀，日立株式會社；Varioskan Flash酶標(biāo)分析儀，賽默飛世爾科技有限公司。

2 方法

2.1 藥物制備方法 川楝子水提醇沉液：將川楝子粉碎至顆粒狀，以1:10比例加入超純水，煮沸后以文火煮30min，水煎2次，合并過濾液，3000r離心，加入分析級無水乙醇，配制至乙醇濃度為70%，4°C冰箱放置過夜，濾去絮狀沉淀，回收乙醇，將上述水提醇沉液濃縮至生藥含量10g/mL，置4°C冰箱避光保存?zhèn)溆?。川楝子絞股藍(lán)水提醇沉液（以下簡稱川絞水提醇沉液）中川楝子與絞股藍(lán)配比為8：2，其余均同前。臨用前，用蒸餾水分別配置成所需濃度的溶液。

2.2 分組及給藥方法 28只ICR小鼠隨機(jī)分為正常組8只，川楝子組10只，川楝子絞股藍(lán)組（川絞組）10只，每組雌雄各半。小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，開始給藥，川楝子組予川楝子（生藥）100g/kg；川絞組予125g/kg，其中川楝子含量100g/kg、絞股藍(lán)含量25g/kg灌胃。各組按0.2mL/10g灌胃給藥。正常組給予等容積的蒸餾水。

2.3 指標(biāo)取材及檢測方法 給藥18天后，禁食不禁水24h，第19天，稱取體質(zhì)量，眼球靜脈叢取血，采用全自動生化分析儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）；頸椎脫臼法處死小鼠，摘除肝臟計(jì)算肝臟指數(shù)（肝臟重/體質(zhì)量×100%），取部分肝組織用0.9%NaCl溶液制成10%肝勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測試超氧化物歧化酶（SOD）活力、采用TBA法測量丙二醛（MDA）含量。

2.4 慢性肝損傷模型 目前臨床上川楝子致急性肝損傷實(shí)驗(yàn)多用灌胃給藥2h后進(jìn)行取血、摘除肝臟檢測的方法[8]，而給小鼠灌胃并于24h后進(jìn)行肝功能等檢測[9]觀察長期肝毒性和慢性肝損傷[7，12-13]。故本實(shí)驗(yàn)按川楝子（生藥）100g/kg劑量灌胃18天，制造慢性肝損傷小鼠模型。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)第9天，因灌胃失誤，川絞組小鼠死亡1只。

3.1 各組小鼠血清ALT、AST及肝臟指數(shù)比較 與正常組比較，川楝子組小鼠血清ALT值無明顯變化，AST值上升（P＜0.05），肝臟指數(shù)增高不明顯。與川楝子組比較，川絞組ALT值、肝指數(shù)無明差異，AST有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。故在連續(xù)給藥18天后，川楝子組存在一定肝毒性，川絞組顯示有降低該毒性的趨勢。見表1。

3.2 各組小鼠肝組織SOD活性、MDA含量比較 與正常組比較，川楝子組小鼠肝組織MDA含量明顯下降（P＜0.01），SOD 活性變化不明顯，SOD/MDA 顯著

表1 各組小鼠血清ALT、AST及肝臟指數(shù)比較（±s）

表1 各組小鼠血清ALT、AST及肝臟指數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶

組別正常組川楝子組川絞組鼠數(shù)8 10 9 ALT（IU/L）40.60±10.16 42.26±11.07 44.13±6.71 AST（IU/L）120.00±35.05 169.78±55.65*155.17±33.97肝指數(shù)（%）4.87±0.46 4.89±0.53 4.93±0.29

升高（P＜0.01）；川絞組小鼠肝組織MDA含量較正常組明顯下降（P＜0.01），SOD活性變化不明顯，SOD/MDA 高于正常組（P＜0.05），低于川楝子組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肝組織SOD活性、MDA含量比較（x±s）

4 討論

單次灌服一定劑量川楝子對小鼠有急性肝毒性，且毒性有時效與量效關(guān)系[1，14]，目前發(fā)現(xiàn)該損傷機(jī)制主要與肝細(xì)胞損傷、脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)、線粒體功能等失常有關(guān)[5-6]，而通過與其他中藥配伍[10]后可減少肝毒性。絞股藍(lán)，主要有效成分為絞股藍(lán)皂苷、絞股藍(lán)多糖，在連續(xù)給藥后起一定保肝作用，有抑制氧化應(yīng)激，減少脂質(zhì)過氧化與自由基生成[15-16]、抑制炎癥反應(yīng)[17]、抑制線粒體通路介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡[11]等藥理活性。故根據(jù)川楝子損肝機(jī)制與絞股藍(lán)保肝機(jī)制，推測兩藥存在配伍解毒的可能性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，川絞組AST值與正常組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），并且較川楝子組結(jié)果有降低趨勢，故可能存在抗川楝子致肝損傷作用。川楝子組的AST值顯著上升，ALT值未上升，該結(jié)果與齊雙巖[13]長期用藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。但在毒性時效性研究中有報導(dǎo)稱，川楝子肝毒性出現(xiàn)早、持續(xù)時間短暫，給藥24h后ALT值可有恢復(fù)正常的情況[1]，也有給藥持續(xù)時間長，轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行性消耗，出現(xiàn)適應(yīng)性肝損傷現(xiàn)象的報導(dǎo)[7]。在利福平建立的慢性肝損傷模型中，用藥14天后ALT也未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[18]，故考慮ALT值未上升是川楝子久用發(fā)生了適應(yīng)性肝損傷的結(jié)果。由于川楝子造成的肝損傷屬于化學(xué)性肝損傷，所以本實(shí)驗(yàn)通過檢測SOD活性與MDA含量，了解長期用川楝子與川楝子絞股藍(lán)對肝臟在氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化方面的影響。SOD催化超氧陰離子自由基還原為過氧化氫，其活力越高，反映肝臟組織清除氧自由基的能力越強(qiáng)[19]，本實(shí)驗(yàn)中三組并無明顯差異（P＞0.05），提示川楝子組、川絞組并不影響肝細(xì)胞SOD活力。MDA作為膜脂過氧化重要產(chǎn)物，含量越高，則間接反映肝臟細(xì)胞受氧自由基攻擊的程度越嚴(yán)重；SOD與MDA的比值可用于反映肝組織脂質(zhì)過氧化的程度，比值越高氧化程度越小[8，20]。本研究結(jié)果顯示，川楝子組與川絞組MDA含量均下降（P＜0.01），SOD/MDA 比值上升（P＜0.05，P＜0.01），尤其是川楝子組結(jié)果與之前文獻(xiàn)報導(dǎo)結(jié)果相反，提示川楝子提取液可能影響肝細(xì)胞內(nèi)MDA的生成，或者川楝子不以氧化應(yīng)激途徑損傷肝細(xì)胞，或是連續(xù)給藥可抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化。在氯丙烯的毒理研究中也出現(xiàn)SOD活性下降然而MDA提示過氧化程度降低的結(jié)果[21]，故長期用川楝子可能并不能使MDA含量增多。近年研究[22]發(fā)現(xiàn)，MDA在體內(nèi)可能存在雙重角色，并非只提示過氧化程度，有實(shí)驗(yàn)[23]發(fā)現(xiàn)適當(dāng)高劑量MDA可促進(jìn)葡萄糖刺激胰島素分泌作用，升高ATP/ADP比率等，所以該組實(shí)驗(yàn)結(jié)果及意義仍需進(jìn)一步驗(yàn)證探討。本研究顯示，川絞組與正常組相比MDA含量下降顯著（P＜0.01），與川楝子組相比含量上升（P＜0.05），提示絞股藍(lán)與川楝子在脂質(zhì)過氧化中存在對抗作用，但仍可降低過氧化產(chǎn)物含量，且川絞組ALT值、AST值與正常組相比無差別（P＞0.05），所以認(rèn)為川楝子與絞股藍(lán)合用可緩解其對肝臟造成的損傷。

川楝子性苦味寒，有疏肝泄熱、行氣止痛、殺蟲的功效。絞股藍(lán)性涼味甘苦，具益氣健脾、化痰止咳、清熱解毒的功效。而兩藥性寒涼，味苦，性味上不存在陰陽明顯對立的情況，川楝子疏肝與絞股藍(lán)健脾配伍，即使長時間運(yùn)用川楝子疏肝泄熱也不至傷脾胃，故臨床存在配伍的可能性。