史榮華，顏彩霞，張建軍，任 丹，高 巍

(1.國藥集團揚州威克生物工程有限公司，江蘇揚州 225127；2.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009)

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，F(xiàn)AV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，大多數(shù)能在健康雞、鴨、鵝等禽類體內(nèi)存在且復制，一般呈隱性感染[1]。禽腺病毒分為I 、II 和III 3個群，其中I 群禽腺病毒(FowlAdenovirus Group I，F(xiàn)AV-I)具有共同的群抗原，分為5個種、12個血清型[2]。世界各地均有報道，F(xiàn)AV急性感染主要表現(xiàn)為包涵體肝炎、心包積液以及肌胃糜爛等癥狀[3]。2018年4月山東某肉雞場發(fā)生的疑似禽腺病毒感染雞群，臨床表現(xiàn)為心包中有淡黃色清亮液體，肝臟腫大，表面有出血點，經(jīng)實驗室病毒分離與鑒定為血清4型禽腺病毒感染。

1 材料與方法

1.1病料采集病料來源于山東省某雞場，34日齡AA肉雞，剖檢疑似禽腺病毒感染，無菌采集具有典型病變的肝、脾、腎等病料組織用于病毒分離以及組織病理學觀察。

1.2試驗材料SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，由國藥集團揚州威克生物工程有限公司實驗室孵化及飼養(yǎng)。

DNA提取純化試劑盒購自上海凱杰公司，2×Easy TaqSuperMix，普通瓊脂糖凝膠購自北京金式金生物技術有限公司，DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司，根據(jù)GenBank中I群禽腺病毒的Hexom基因序列保守區(qū)，設計合成引物，F(xiàn)：5′-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3′；R：5′-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.3病毒分離采集病雞肝、脾、腎等病變組織，按1∶5 加入含適當濃度抗生素的滅菌PBS緩沖液，充分研磨，反復凍融3次后，離心取上清[4]，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，卵黃囊接種5個7日胚齡的SPF雞胚，置37 ℃溫箱孵育。每12 h照胚1次，將24 h內(nèi)死亡雞胚棄去，24 h后死亡雞胚收取尿囊液并觀察胚體是否病變，7 d后存活的雞胚，置4 ℃凍死，收取尿囊液并觀察胚體是否病變。

1.4血凝試驗取30 μL收集的尿囊液用生理鹽水在血凝板中先進行倍比稀釋211，隨后每孔加入30 μL 1%雞紅細胞；置37 ℃反應10 min。若樣品孔出現(xiàn)雞紅細胞凝集現(xiàn)象，則判定為有血凝性；反之則為血凝陰性。

1.5PCR檢測用DNA提取試劑盒抽提雞胚尿囊液中的DNA，置-20 ℃?zhèn)溆?。以提取的病毒DNA作為模板進行PCR擴增。反應體系為：DNA模板2.0 μL，2×Easy TaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳處理后，置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照鑒定，陽性樣品送南京金斯瑞物科技有限公司進行序列測定，并將測定序列與GenBank上已發(fā)表FAdV核苷酸序列進行同源性比對。

1.6病理組織學檢測取病死雞的肝臟等組織用福爾馬林固定，按文獻方法[5]制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，染色后進行組織病理學診斷。

2 結(jié)果與分析

2.1病雞剖檢癥狀對現(xiàn)場病死雞進行剖檢發(fā)現(xiàn)，主要表現(xiàn)為肝臟表面有大量出血點和出血斑(圖1A)，包心，內(nèi)含黃色積液(圖1B)。

圖1 病死雞組織病變Fig.1 Pathological changes of dead chicken

2.2病毒分離SPF雞胚在接種病料后，96 h內(nèi)死亡2個，120 h內(nèi)死亡2個，血凝試驗結(jié)果表明收獲的尿囊液沒有血凝性，排除了流感和新城疫病毒的感染。接種病料死亡的雞胚出現(xiàn)明顯的病變，主要表現(xiàn)為胚體出血，肝臟呈黃色，有明顯的出血點(圖2)。

圖2 接種雞胚病變Fig.2 Pathological changes of inoculated chicken embryo

2.3PCR鑒定和序列分析PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增出的目的條帶與預期設定的腺病毒陽性對照的條帶相符，大小約為500 bp(圖3)。測序結(jié)果表明，此病毒分離株的基因序列與Genbank已發(fā)表4型FAdV序列同源性達99%，從而確定為血清4型FAdV。

注：M.DL2000 DNA Marker；1.腺病毒陽性對照；2.病毒DNA的PCR擴增產(chǎn)物Note：M.DL2000 DNA Marker；1.Adenovirus positive control；2.PCR amplification products of virus DNA圖3 PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification results

2.4組織病理學檢測組織病理學顯示：肝細胞明顯減少，大量肝細胞變性、壞死(圖4A)；肝細胞內(nèi)可見嗜堿性包涵體(圖4B)。

圖4 肝臟病理變化Fig.4 Pathological changes of liver

3 結(jié)論與討論

FAdV-I 主要侵害3-8 周齡的肉雞，病死率最高可達80%。FAdV 既可通過種蛋垂直傳播又可通過病雞水平傳播[6]。I群禽腺病毒分為12個血清型，其中在白羽肉雞上4型和8b型禽腺病毒流行最為廣泛，4型主要表現(xiàn)為心包積水綜合征，而8b型則主要表現(xiàn)為包涵體肝炎[7]一些免疫抑制病，如傳染性法氏囊病和傳染性貧血病等混合感染會加劇家禽的發(fā)病和死亡[8]。2014—2016 年該病在我國發(fā)病范圍廣泛，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。

該試驗從山東省某肉雞場采集病料，根據(jù)臨床解剖病變，病毒分離、血凝試驗、PCR擴增及其產(chǎn)物序列分析、病理組織學分析，最終確診該病例為禽4型腺病毒感染。針對此種腺病毒感染一方面疫苗預防是有效的方法，另一方面做好環(huán)境的消毒工作，減少病原的傳播。一旦雞群發(fā)病無特效藥物，可增加營養(yǎng)和改善環(huán)境以增強體質(zhì)提高抗病能力，同時添加適量抗生素防止繼發(fā)感染。死亡率逐漸增大的雞群可以緊急注射特異性高免血清或卵黃抗體。因該病目前無明確的致病機理，建議使用疫苗進行防控，選擇合適血清型滅活疫苗給健康雞群進行免疫預防，能達到90% 以上的保護效果。其中在肉雞上，5～7 日齡和21 日齡左右進行滅活疫苗的接種，可很好控制該病的發(fā)生。該雞場發(fā)病后選擇緊急注射腺病毒卵黃抗體并適當添加抗生素進行治療，加強雞舍通風消毒，死亡率下降顯著，7 d后雞群穩(wěn)定，幾乎未見死亡病雞。