趙 彬， 武 峰， 白瑩瑩， 方 敏， 王 璐

(1. 山西醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2. 山西醫(yī)科大學(xué) 汾陽(yáng)學(xué)院，山西 汾陽(yáng) 032200)

1 前言

牙齒缺損的修復(fù)是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前，種植修復(fù)牙列缺損或缺失是口腔修復(fù)領(lǐng)域的主流技術(shù)。然而，由于患者長(zhǎng)期缺牙或因外傷、腫瘤等導(dǎo)致的種植位點(diǎn)骨缺損或骨量不足是種植修復(fù)技術(shù)面臨的一大難題。針對(duì)種植位點(diǎn)骨量的嚴(yán)重缺損和不足，需要在種植前期或同期對(duì)牙槽骨缺損進(jìn)行修復(fù)，以提高種植的成活率和修復(fù)效果。

引導(dǎo)性骨再生技術(shù)(GBR)是解決三維骨量不足的有效方法，其原理是在使用骨替代材料充填骨缺損區(qū)域的同時(shí)，將具有生物安全性的屏障膜植入，一方面阻隔成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入骨創(chuàng)，同時(shí)提供空間、有效的保證骨細(xì)胞優(yōu)先充滿膜下方的骨缺損間隙，促進(jìn)新骨生成、重塑和改建[1]。屏障膜是引導(dǎo)性骨再生技術(shù)中的關(guān)鍵問(wèn)題，其性能的優(yōu)劣直接決定著骨組織再生的效果。目前臨床最常用的屏障膜為膠原膜，但存在降解速率較快并且力學(xué)性能不足的缺陷[2]，直接影響骨組織再生及修復(fù)的效果。因此，探索和改進(jìn)能夠提供良好機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，與骨缺損修復(fù)時(shí)間相適應(yīng)的屏障膜，可以使膜引導(dǎo)骨再生技術(shù)的臨床應(yīng)用更加廣泛。

絲素蛋白(SF)是一種源于蠶絲、性能優(yōu)良的生物材料，可作為生物醫(yī)用材料用于皮膚、骨、神經(jīng)等組織的修復(fù)及再生[3-5]。蠶絲經(jīng)提純后可被制成各種形態(tài)的生物材料，包括膜、多孔支架、凝膠以及無(wú)紡網(wǎng)等，其中SF膜就被廣泛應(yīng)用于引導(dǎo)性骨再生的研究。Song等[6]將SF膜覆蓋于新西蘭白兔的頭骨缺損處，結(jié)果顯示，SF膜的使用能夠顯著的促進(jìn)新骨的生成。Kim等[7]將SF膜與Bio-Gide膠原膜進(jìn)行對(duì)比，術(shù)后8周的結(jié)果顯示SF膜組和膠原膜組新骨生成量較為接近，考慮到膠原的免疫原性和昂貴的價(jià)格，他們認(rèn)為SF膜是除膠原膜以外的另一選擇。Ha等[8]對(duì)比了SF膜、膠原膜以及聚四氟乙烯(PTFE)膜對(duì)骨組織再生的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SF膜表現(xiàn)出最佳的骨誘導(dǎo)性。

石墨烯類材料是一種新興的納米碳質(zhì)材料，具有獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)、優(yōu)良的力學(xué)、熱學(xué)[9]以及生物學(xué)性能，現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用于藥物載體、組織工程、細(xì)胞成像等生物醫(yī)用領(lǐng)域的研究[10-12]。國(guó)內(nèi)外研究表明，氧化石墨烯(GO)具有豐富的含氧官能團(tuán)，可以均勻的分散在高分子溶液中制備成不同種類的生物材料，GO的引入會(huì)明顯改善復(fù)合材料的理化性能甚至生物學(xué)性能[13-15]。體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果也顯示，低濃度的石墨烯在細(xì)胞水平上是一種安全的新型材料。值得注意的是，經(jīng)高分子修飾后的石墨烯類材料在誘導(dǎo)HAp 礦化以及骨修復(fù)領(lǐng)域中的相關(guān)研究揭示了其具有一定的骨誘導(dǎo)能力[16-18]。

辛伐他汀(SIM)是一種臨床常用的降脂藥物，20世紀(jì)末Mundy等[19]發(fā)現(xiàn)SIM能促進(jìn)BMP-2的表達(dá)，促進(jìn)新骨生成。Maeda等[20]發(fā)現(xiàn)SIM作用于MC3T3-E1細(xì)胞可上調(diào)VEGF基因的表達(dá)，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化。Liu等[21]證實(shí)在Wistar大鼠拔牙窩內(nèi)局部應(yīng)用SIM可顯著上調(diào)TGF-β1、VEGF、BMP-2 mRNA基因表達(dá)水平。

理想的屏障膜應(yīng)具備足夠的機(jī)械性能、與骨組織新生速率相匹配的降解速率、良好的生物學(xué)性能并能誘導(dǎo)骨再生。在此之前，本課題組從材料的成分及結(jié)構(gòu)出發(fā)，設(shè)計(jì)并制備了GO/SF多孔支架[22]，利用GO的引入，實(shí)現(xiàn)了對(duì)材料理化性能、釋藥性能、生物降解性能的改進(jìn)。GO改進(jìn)后的復(fù)合材料，其各方面性能都得到了提升，如果將其制備成具有雙層結(jié)構(gòu)的膜材料，可能會(huì)在引導(dǎo)性骨再生領(lǐng)域取得一定成果。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，將GO/SF基生物材料以屏障膜的形式用于引導(dǎo)性骨再生領(lǐng)域，研究屏障膜的體外、體內(nèi)生物學(xué)性能，探討其在引導(dǎo)性骨再生領(lǐng)域的可應(yīng)用性及發(fā)展前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要試劑

氧化石墨烯，南京先豐納米材料科技有限公司；家蠶生絲，江蘇省鼎盛絲綢有限公司；辛伐他汀，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；MC3T3-E1細(xì)胞，通派(上海)生物科技有限公司；SD大鼠，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清，Gibco，美國(guó)；CM-DiI熒光蛋白，Invitrogen，美國(guó)；Cell Counting Kit-8，南京建成生物制劑有限公司；茜素紅 S、鈣黃綠素，Sigma，美國(guó)；其他試劑和溶劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水和蒸餾水。

2.2 溶液的制備

精確稱取20 mg GO，用功率為300 W的超聲波清洗器將其分散于10 mL去離子水中，配制成濃度為2 mg/mL的GO水溶液。取50 g家蠶生絲，在煮沸的、濃度為0.05%的Na2CO3水溶液中重復(fù)處理3次，每次30 min，去離子水洗滌后于60 ℃ 烘干得到精煉蠶絲。72 ℃下將脫膠絲溶于三元溶液(氯化鈣∶乙醇∶水=1∶8∶2 摩爾比例)中1 h，去離子水透析4天，得到濃度為3.5 wt%的再生SF蛋白水溶液。

2.3 屏障膜的制備

SF膜：用去離子水將濃度為3.5 wt%的SF溶液稀釋至2 wt%，然后加入占SF質(zhì)量30%的甘油，充分?jǐn)嚢瑁婵彰撆荨?/p>

GO/SF膜：將濃度為3.5 wt%的SF溶液與GO溶液混合，其中GO的質(zhì)量占SF質(zhì)量的0.5 wt%，用去離子水將溶液的總濃度稀釋至2 wt%，然后加入占SF質(zhì)量30%的甘油，充分?jǐn)嚢瑁婵彰撆荨?/p>

GO/SF/SIM膜：精確稱取一定質(zhì)量的SIM，超聲分散于去離子水中，配制成10 mg/mL的分散液。將配制好的GO/SF混合溶液與SIM分散液共混，其中SIM添加量分別占SF質(zhì)量的2.5 wt%和5 wt%，充分?jǐn)嚢?，真空脫泡?/p>

將以上配置好的溶液倒入直徑為9 cm的表面皿中，于-20 ℃冷凍2 h后，真空減壓干燥約36 h得到SF膜、GO/SF膜以及GO/SF/SIM膜。

2.4 屏障膜的形貌、聚集態(tài)結(jié)構(gòu)及釋藥性能測(cè)試

將GO/SF屏障膜抽真空后噴金，用JSM-7001F 型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察其表面和橫截面。將凍干后的膜剪碎成粉末狀，使用日本Rigaku公司生產(chǎn)的Miniflex II衍射儀，CuKα射線，記錄樣品在2θ=5°～40°之間的衍射強(qiáng)度曲線。將載有SIM的屏障膜制成3 cm×3 cm的小方塊，置于50 mL PBS中，在37 ℃的恒溫振蕩水槽中進(jìn)行釋放，每組重復(fù)3次。在15天的釋放周期內(nèi)，每隔一天取出3 mL溶液，同時(shí)補(bǔ)充3 mL新鮮的PBS，直至釋藥實(shí)驗(yàn)完成。用紫外分光光度計(jì)(日立 UV-2800)測(cè)定取自不同時(shí)間點(diǎn)的溶液在238.5 nm處的吸光度，得到不同材料的體外釋藥曲線。

2.5 屏障膜的體外細(xì)胞相容性

將每組屏障膜裁剪成直徑約為10 mm的圓形，Co60輻照滅菌，無(wú)菌PBS沖洗3遍備用。選用第三代MC3T3-E1細(xì)胞，采用熒光染料CM-DiI進(jìn)行標(biāo)記后，以1×105/孔接種于24孔板中，每隔兩天換液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于接種后7天在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞與材料的結(jié)合情況以及細(xì)胞的增殖狀態(tài)。細(xì)胞增殖與活力通過(guò)CCK-8測(cè)定，分別在細(xì)胞培養(yǎng)的1、3、5、7天，將24孔板中培養(yǎng)基吸出，材料-細(xì)胞復(fù)合物經(jīng)PBS漂洗3遍之后，每孔加入50 μL CCK-8試劑，然后加入450 μL DMEM并搖勻，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，每孔吸出100 μL至96孔板，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下的吸光度，以6個(gè)平行樣的結(jié)果求平均值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.6 屏障膜用于引導(dǎo)性骨再生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.6.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

清潔級(jí)8周齡雄性SD大鼠24只，體重為180～200 g(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。屏障膜材料：GO/SF/SIM膜、GO/SF膜、SF/SIM膜、SF膜。

2.6.2 動(dòng)物模型的建立及分組

大鼠稱重，巴比妥麻醉，俯臥位將其固定于手術(shù)臺(tái)上。頭部備皮，碘伏消毒。沿頭蓋骨正中線縱向切開皮膚約3 cm，鈍性分離皮下組織，剝離骨膜，暴露頂骨。用低速鉆在生理鹽水的降溫下制備骨缺損模型，造成兩個(gè)直徑為5 mm的骨缺損區(qū)域(圖1a、b)。24只大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只：實(shí)驗(yàn)A組植入GO/SF/SIM膜、實(shí)驗(yàn)B組植入GO/SF膜、實(shí)驗(yàn)C組植入SF/SIM膜、對(duì)照D組植入SF膜。植入后縫合皮下組織及皮膚創(chuàng)口，分籠飼養(yǎng)。

圖 1 植入屏障膜的表觀形貌和動(dòng)物模型的建立：(a,b)大鼠顱骨缺損的制備,(c,d)屏障膜植入

2.6.3 序列熒光標(biāo)記

為檢測(cè)術(shù)后不同時(shí)期新骨生成情況，采用序列熒光標(biāo)記新生骨組織[23,24]。乙醚輕度麻醉下，于術(shù)后6周時(shí)對(duì)各組大鼠皮下注射茜素紅S，9周時(shí)皮下注射鈣黃綠素，注射劑量見表1。為防止熒光標(biāo)記液流出，注射后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制動(dòng)1 min左右。茜素紅在紅外光激發(fā)下呈磚紅色熒光，鈣黃綠素在藍(lán)光激發(fā)下呈黃綠色熒光。

表 1 序列熒光標(biāo)記次序及劑量

2.6.4 取材及樣本處理

術(shù)后12周處死大鼠，取顱骨標(biāo)本行肉眼觀察，乙醇梯度脫水后，用硬組織切片機(jī)(EXAKT，德國(guó))沿標(biāo)本長(zhǎng)軸切割，逐級(jí)打磨拋光至50 μm。用激光共聚焦顯微鏡觀察，Image Pro PLUS(Media Cybernetics，美國(guó))圖像分析軟件測(cè)量每組標(biāo)本缺損邊緣向缺損中心方向、向顱外側(cè)方向紅色熒光標(biāo)記帶與黃綠色熒光標(biāo)記帶之間的最大垂直連線距離，即為3周時(shí)間內(nèi)該位點(diǎn)鈣鹽沉積的厚度，記錄并進(jìn)行組間對(duì)照統(tǒng)計(jì)。腦膜側(cè)方向因熒光標(biāo)記較少，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義，不作統(tǒng)計(jì)。取所有處死A、B組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝、脾、腎標(biāo)本觀察并進(jìn)行HE染色，對(duì)局部應(yīng)用GO進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。

2.6.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖 2 GO/SF屏障膜的掃描電鏡照片和X-射線衍射曲線：(a, b)縱截面,(c, d)橫截面,(e)X-射線衍射曲線

3 結(jié)果與討論

3.1 GO/SF屏障膜的形貌、聚集態(tài)結(jié)構(gòu)與釋藥性能

GO/SF屏障膜的形貌及其聚集態(tài)結(jié)構(gòu)如圖2所示。從圖2a, b可知，該屏障膜具有典型的雙層結(jié)構(gòu)，表面具有一層致密的薄膜，內(nèi)部則為疏松的多孔結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)既可以起到必要的屏障作用，又可為組織的修復(fù)提供支架支撐，為骨細(xì)胞的長(zhǎng)入提供合適的微環(huán)境。從材料的橫截面照片觀察(圖2c)，屏障膜表現(xiàn)為多孔結(jié)構(gòu)，孔壁上隨機(jī)分布著一些小孔，孔與孔之間連通性較好，這些特征有利于細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，毛細(xì)血管的長(zhǎng)入，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的輸送以及細(xì)胞代謝產(chǎn)物的排泄。此外，將膜的孔壁局部放大至10 000倍，在其內(nèi)部并未發(fā)現(xiàn)有團(tuán)聚的GO (圖2d)，說(shuō)明GO與SF具有較好的相容性，GO可以較為均勻的分散在SF基體中。圖2e所示為GO/SF屏障膜的X-射線衍射曲線。根據(jù)前人對(duì)家蠶絲素蛋白分子構(gòu)象的研究，Silk I的主要衍射峰出現(xiàn)在12.2°、19.7°、24.7°、28.2°附近，Silk II的主要衍射峰出現(xiàn)在9.1°、18.9°和20.7°附近[25,26]。

從圖2可以看出，SF膜、GO/SF復(fù)合膜均在9.1°、20.7°和24.7°附近出現(xiàn)了明顯的衍射峰，主要表現(xiàn)為Silk II結(jié)構(gòu)，內(nèi)含少量的Silk I結(jié)構(gòu)。甘油的強(qiáng)親水性可以誘導(dǎo)SF蛋白向更為規(guī)整的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，此時(shí)的屏障膜具有絲素蛋白最為穩(wěn)定的的Silk II結(jié)構(gòu)，對(duì)材料中藥物緩釋效果以及生物降解速率都會(huì)產(chǎn)生較好的協(xié)同效應(yīng)。圖中在10.6°出現(xiàn)明顯的特征峰歸屬于GO[27]，GO/SF膜內(nèi)部沒(méi)有出現(xiàn)10.6°附近的特征峰，說(shuō)明GO在SF蛋白中分散良好。此外，GO/SF膜的XRD曲線上未出現(xiàn)新的衍射峰，說(shuō)明沒(méi)有新的結(jié)晶形態(tài)產(chǎn)生。

圖 3 GO/SF/SIM屏障膜的體外釋藥曲線

GO/SF屏障膜15天內(nèi)在37 ℃環(huán)境下的體外釋放曲線如圖3所示。各組材料內(nèi)SIM的釋放均分為兩個(gè)階段，即突釋階段和緩釋階段。前3天藥物突釋現(xiàn)象明顯，GO/SF/SIM 2.5%組累計(jì)釋放百分比為(17.88 ± 1.49)%，而GO/SF/SIM 5.0%組和SF/SIM 2.5%組的累計(jì)釋放率分別達(dá)到(34.59 ± 1.52)%、(32.97 ± 1.68)%。產(chǎn)生突釋現(xiàn)象的原因在于：存在于屏障膜表面以及與膜結(jié)合較弱的SIM分子會(huì)率先從材料中脫落。從第4天開始，三組材料的釋藥曲線逐步趨于平穩(wěn)，進(jìn)入緩釋階段，到達(dá)第13天時(shí)，3組材料的累計(jì)釋放率分別為(30.56 ± 1.92)%，(43.01 ± 2.42)%，(51.46 ± 1.75)%。值得注意的是，SIM的添加量對(duì)材料的釋藥性能會(huì)產(chǎn)生一定影響。在之前的研究中，筆者已經(jīng)證實(shí)，GO可使藥物釋放速率減緩，釋放時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)比GO/SF/SIM 2.5%組與SF/SIM 2.5%組的釋藥曲線，可以發(fā)現(xiàn)確實(shí)如此：添加GO后，不管在突釋還是緩釋階段，GO/SF/SIM 2.5%組都表現(xiàn)出較低的藥物累計(jì)釋放率，這是GO對(duì)SF理化性能以及孔結(jié)構(gòu)的改進(jìn)導(dǎo)致的。而當(dāng)進(jìn)一步提高SIM添加量時(shí)，材料在釋放初期就表現(xiàn)出較高的釋藥率，甚至掩蓋了GO可以延緩釋放這一作用，這可能是由于SIM的添加量過(guò)多，在材料中已屬于飽和狀態(tài)，當(dāng)遇到PBS溶液時(shí)，過(guò)飽和的SIM分子表現(xiàn)出快速而大量的釋放。對(duì)比3種材料，筆者發(fā)現(xiàn)它們?cè)?5天內(nèi)都具有緩慢釋放藥物的效果，但GO/SF/SIM 5.0%組和SF組的突釋性過(guò)大，故其長(zhǎng)期釋放能力不及GO/SF/SIM 2.5%組。這種持續(xù)、緩慢的藥物釋放特性可能會(huì)與生長(zhǎng)速率較為緩慢的骨組織具有較為匹配的促進(jìn)作用。

3.2 GO/SF屏障膜的體外細(xì)胞相容性

圖4為MC3T3-E1接種后7天的激光共聚焦照片以及7天培養(yǎng)周期內(nèi)MC3T3-E1細(xì)胞在屏障膜上的增長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，屏障膜在鏡下呈黑色，孔結(jié)構(gòu)清晰，經(jīng)CM-DiI標(biāo)記的細(xì)胞散發(fā)出明亮的紅色熒光。對(duì)比各組材料，可以發(fā)現(xiàn)添加GO的屏障膜，其內(nèi)部的紅色熒光亮點(diǎn)較多，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，細(xì)胞狀態(tài)良好，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，說(shuō)明在這些樣品中的活細(xì)胞數(shù)量較多，含有適量GO的屏障膜表現(xiàn)出較好的細(xì)胞相容性。

將SIM引入材料后，可以發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部的紅色熒光亮點(diǎn)較空白材料組有所增加，說(shuō)明從屏障膜中緩慢釋放出的SIM可以促進(jìn)細(xì)胞的粘附與生長(zhǎng)，細(xì)胞增殖較快、活力較好。當(dāng)多孔膜內(nèi)部的SIM含量不同時(shí)，細(xì)胞在材料上的增殖情況并未出現(xiàn)明顯差異，均表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，無(wú)大量細(xì)胞死亡，這說(shuō)明兩種藥物濃度對(duì)細(xì)胞都在有效范圍之內(nèi)，具有良好的體外細(xì)胞相容性。

從MC3T3-E1細(xì)胞在4種屏障膜上的CCK-8檢測(cè)結(jié)果可以看出，在7天的培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞在各組材料上都能生長(zhǎng)與增殖，屏障膜上的細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增長(zhǎng)而增大，表明材料無(wú)細(xì)胞毒性。具體而言，在培養(yǎng)初期，細(xì)胞在4種屏障膜上生長(zhǎng)情況相似；而從3天開始，添加SIM的材料上，細(xì)胞數(shù)量多于未添加藥物的材料，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至7天時(shí)，差異更加明顯，這說(shuō)明SIM的添加有利于MC3T3-E1細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖 4 MC3T3-E1細(xì)胞在GO/SF/SIM屏障膜上培養(yǎng)7天后的激光共聚焦照片及CCK-8 測(cè)試法獲得MC3T3-E1細(xì)胞在屏障膜上的增長(zhǎng)曲線

3.3 GO/SF屏障膜引導(dǎo)大鼠顱骨再生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

3.3.1 大體觀察

術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)取材前，大鼠活動(dòng)自如，傷口愈合良好，顱骨區(qū)域無(wú)感染或開裂。取材后可見各組中植入的屏障膜無(wú)脫落、紅腫、滲出、壞死發(fā)生，與周圍組織結(jié)合良好。

從取出的骨組織標(biāo)本觀察可見，骨缺損邊緣與屏障膜材料邊界不清，實(shí)驗(yàn)A組(GO/SF/SIM)缺損邊緣較B(GO/SF)、C(SF/SIM)、D(SF)組更為不規(guī)則，缺損范圍明顯減小，新生組織質(zhì)地較硬，其骨硬度觸感強(qiáng)于B、C、D組；實(shí)驗(yàn)B、C組之間大體觀察無(wú)明顯差異，實(shí)驗(yàn)A、B、C組的修復(fù)效果優(yōu)于對(duì)照D組。4組屏障膜在大鼠體內(nèi)均發(fā)生了不同程度的降解，對(duì)比C、D兩組材料，添加了GO的A、B兩組僅被小部分降解，仍能完整覆蓋缺損區(qū)，維持較好的屏障作用。

3.3.2 序列熒光標(biāo)記測(cè)定新生骨組織

茜素紅 S與鈣黃綠素對(duì)骨組織中的鈣具有較強(qiáng)的標(biāo)記能力。為了考察新生骨組織在不同時(shí)期的生長(zhǎng)情況，筆者分別將茜素紅 S和鈣黃綠素于術(shù)后6、9周經(jīng)腹腔注射至大鼠體內(nèi)，通過(guò)這兩種標(biāo)記物發(fā)出的熒光對(duì)不同時(shí)期新生的骨組織進(jìn)行動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)。

如圖5所示，分別測(cè)量了各組向缺損中心方向(V向)和向顱外側(cè)方向(H向)紅綠熒光標(biāo)記帶之間的最大垂直連線距離。具體而言，向缺損中心方向(V向)，各組材料植入后都有一定的新骨形成。實(shí)驗(yàn)A組的骨愈合量與其他三組具有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)B組及C組均與對(duì)照D組表現(xiàn)出顯著性差異。上述結(jié)果表明，在V向的新骨形成過(guò)程中，GO或SIM單獨(dú)使用均可促進(jìn)骨組織再生，而SIM與GO聯(lián)合使用時(shí)具有交互作用，會(huì)對(duì)骨缺損的愈合產(chǎn)生明顯的協(xié)同促進(jìn)效果。向顱外側(cè)方向(H向)的新骨生成不如V向表現(xiàn)得明顯，實(shí)驗(yàn)A、B、C三組的骨愈合量與對(duì)照D組具有顯著性差異，但A、B、C三組之間并無(wú)顯著性差異。這說(shuō)明，在H向的新骨形成過(guò)程中，單獨(dú)使用SIM或GO可以略微提高骨愈合量，但GO與SIM之間的交互作用不顯著，不能認(rèn)為同時(shí)使用GO與SIM對(duì)骨缺損有協(xié)同促進(jìn)作用。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與不規(guī)則顱骨形態(tài)有關(guān)系，在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下，顱骨向缺損中心方向的生長(zhǎng)量要遠(yuǎn)大于向顱內(nèi)外側(cè)方向的生長(zhǎng)量，藥物干預(yù)可能對(duì)改變顱骨固有生長(zhǎng)速度的規(guī)律并不顯著。

圖 5 Ⅰ：序列熒光標(biāo)記標(biāo)本切片的激光共聚焦照片(12周)：(a) GO/SF/SIM, (b) GO/SF, (c) SF/SIM及(d) SF

3.3.3 局部應(yīng)用GO在動(dòng)物體內(nèi)的生物安全性評(píng)價(jià)

GO的體內(nèi)外生物安全性一直是個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)取術(shù)后12周大鼠實(shí)質(zhì)器官肝、脾、腎進(jìn)行HE染色，以評(píng)價(jià)GO在動(dòng)物體內(nèi)的生物安全性。圖6為植入屏障膜12周時(shí)大鼠肝、脾、腎3個(gè)重要臟器的HE染色圖片，均未見明顯異常炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及異常組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時(shí)未發(fā)現(xiàn)有沉積的GO顆粒，證明局部應(yīng)用低濃度的GO復(fù)合材料對(duì)大鼠肝、脾、腎臟器短期(3個(gè)月)內(nèi)不會(huì)造成損害。

圖 6 植入GO/SF/SIM屏障膜12 w時(shí)大鼠(a)肝臟,(b)脾臟,(c)腎臟的HE染色照片(×100)

4 結(jié)論

以GO和SF為原材料，同時(shí)負(fù)載SIM，制備了具有雙層結(jié)構(gòu)的載藥屏障膜，并研究了屏障膜的體外細(xì)胞相容性及其作為引導(dǎo)性骨膜的修復(fù)效果。結(jié)果表明，GO/SF屏障膜具有表面致密、內(nèi)部疏松的形貌，同時(shí)聚集態(tài)結(jié)構(gòu)為穩(wěn)定的Silk II結(jié)構(gòu)，載有SIM的屏障膜在15天內(nèi)表現(xiàn)出緩釋特性。在體外，GO/SF屏障膜可以很好的支持MC3T3-E1細(xì)胞的粘附與增殖，GO與SIM的引入都可以促進(jìn)骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。植入大鼠體內(nèi)的屏障膜具有促進(jìn)骨缺損修復(fù)的能力，在向缺損中心方向的新骨形成過(guò)程中，SIM與GO的聯(lián)合使用對(duì)骨缺損的愈合產(chǎn)生了明顯的協(xié)同促進(jìn)作用。此外，在體內(nèi)局部應(yīng)用低濃度的GO復(fù)合材料是安全的，對(duì)大鼠重要臟器短期(3個(gè)月)內(nèi)不會(huì)造成損害。GO/SF/SIM復(fù)合屏障膜具有穩(wěn)定的理化性能、良好的體內(nèi)外生物相容性，并對(duì)骨缺損有較好的修復(fù)效果，同時(shí)制備技術(shù)簡(jiǎn)單，原材料成本較低，有望作為新型屏障膜材料應(yīng)用于GBR技術(shù)中。