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(長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410219)

圍絕經(jīng)期綜合征是卵巢功能減退引起下丘腦-垂體-卵巢內(nèi)分泌軸(HPOA)的功能失調(diào)，從而出現(xiàn)以生殖系統(tǒng)改變、機(jī)體老化、神經(jīng)精神狀態(tài)異常等臨床表現(xiàn)的一組癥候群[1]。白芨多糖具有斂瘡止血、活血化瘀的功效且藥物不良反應(yīng)少。本研究通過建立圍絕經(jīng)期大鼠模型，采用免疫印跡法(Western blot，WB)、TBA法和HE 染色法，分別觀察白芨多糖對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢VEGF蛋白、血清MDA、子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)影響，探討白芨多糖改善圍絕經(jīng)期大鼠卵巢的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物健康雌性大鼠40只，6～8月齡，體質(zhì)量350～450 g；湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。

1.2 藥材與器材

主要的藥材包括白芨多糖提取物(西安四季生物科技有限公司，水提醇沉，純度90%)、HE染液(servicebio，產(chǎn)品批號(hào)：G1005)、蛋白Marker Therm(FERMENTAS 26616)、PVDF膜(MILLIPORE)、HRP標(biāo)記山羊抗大鼠(GB23302)、PMSF(100 mM，G2008)、RIPA裂解液(G2002)、5×蛋白上樣緩沖液(G2013)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(G2003)武漢賽維爾生物科技有限公司提供。主要的器材包括冷凍離心機(jī)(HEAL FORCE NEOFUGE，13R型)、酶標(biāo)檢測儀(RAYTO，RT2100C型)、電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-6C型)、丙二醛試劑盒(南京建成生物工程研究所)、病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：RM2016)。

1.3 模型建立、分組及給藥

40只6～8月齡雌性大鼠無菌條件下飼養(yǎng)6個(gè)月，對12～14個(gè)月大鼠進(jìn)行每日1次、連續(xù)15 d陰道涂片觀察，經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片鏡下檢查，大鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂、動(dòng)情間期延長為圍絕經(jīng)期大鼠模型。將40只圍絕經(jīng)期大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別是中藥低、中、高劑量、老年對照組。用白芨多糖溶劑按等效劑量分為低(0.5 g/kg)、中(1 g/kg)、高(2 g/kg)劑量分別灌胃低、中、高劑量組，用生理鹽水2 mL灌胃老年對照組。每天給藥1次，持續(xù)8周。

1.4 取材及處理

大鼠末次給藥24 h后眼球取血4 mL，離心后取上清液，用于MDA檢測；迅速處死后，取出卵巢后于-80 ℃冰箱凍存，用于WB檢測；取出子宮組織用中性甲醛固定后制成石蠟切片，用于光鏡觀察。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測卵巢組織中VEGF蛋白表達(dá)

取適量卵巢組織，加入適量含PMSF及RIPA裂解液確保細(xì)胞完全裂解，離心后取上清液即為總蛋白溶液。加蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性15 min，配制所需濃度的分離膠，加入TEMED后進(jìn)行灌膠與上樣，SDS-PAGE電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。TBST溶解的5%脫脂牛奶封閉1 h，稀釋一抗4 ℃過夜，洗膜后加入二抗(TBST稀釋3 000倍)，室溫下孵育30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min。在暗室中將PVDF膜的蛋白進(jìn)行曝光。曝光后的膠片進(jìn)行顯影和定影。根據(jù)不同的發(fā)光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件，ALPHA軟件處理系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值反映目的蛋白表達(dá)半定量水平。

1.6 TBA法測定丙二醛

具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)采用HE染色法

切片脫蠟，蘇木素染胞核5 min,水洗，鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗10 min，1%伊紅染胞漿5 min，水洗，梯度酒精脫水(90%、95%、無水酒精)，二甲苯透明，中性樹膠封片、烤干，顯微鏡觀察并攝片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同劑量白芨多糖對各組圍絕經(jīng)期大鼠卵巢VEGF蛋白灰度值分析

用藥8周后，與老年對照組比較，VEGF蛋白表達(dá)在白芨多糖低、中、高劑量組中呈階梯性升高(P<0.01)，并存在一定劑量依賴性(圖1、表1)。

1:對照組；2:低劑量組；3:中劑量組；4:高劑量組

圖1Westernbolt檢測大鼠卵巢VEGF蛋白表達(dá)的電泳條帶

組別劑量(g·kg-1·d-1)VEGF蛋白老年對照組-0.075±0.005白芨多糖低劑量組0.50.153±0.083*白芨多糖中劑量組10.184±0.032*白芨多糖高劑量組20.255±0.079*#

*:與老年對照組比較，P<0.01;#：與中劑量組比較，P<0.05

2.2 不同劑量白芨多糖對各組圍絕經(jīng)期大鼠血清MDA含量分析

與老年對照組比較，血清MDA含量在白芨多糖低、中、高劑量組中表達(dá)呈階梯性降低(P<0.01)，并存在劑量依賴性(表2)。

表2 白芨多糖對大鼠血清中MDA含量的影響)

*:與老年對照組比較，P<0.01；#：與低劑量組比較，P<0.01；△：與中劑量組比較，P<0.01

2.3 圍絕經(jīng)期大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)觀察

隨著劑量增加子宮內(nèi)膜單層柱狀上皮排列更為緊密整齊，固有層的基質(zhì)細(xì)胞、血管逐漸增多,腺體增生、活躍，說明白芨多糖對子宮有營養(yǎng)作用,并能刺激子宮內(nèi)膜的增生(圖2)。

3 討論

圍絕經(jīng)期綜合征是指由于卵巢血管結(jié)構(gòu)及微循環(huán)血流的改變導(dǎo)致卵巢功能減退，引起下丘腦-垂體-卵巢內(nèi)分泌軸(HPOA)的功能失調(diào)，而表現(xiàn)出以自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主的臨床癥狀。據(jù)估計(jì)，到2030年世界上的圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期婦女將達(dá)到12億人口?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明白芨多糖具有活血化瘀、調(diào)節(jié)血液系統(tǒng)、提高機(jī)體抗氧化能力及抗細(xì)胞衰老作用[2-6]。

基于以上理論基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對白芨多糖能否改善下丘腦-垂體-卵巢內(nèi)分泌軸(HPOA)的功能進(jìn)行研究，尋求其治療圍絕經(jīng)期的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中采用生殖功能衰退表現(xiàn)與圍絕經(jīng)期婦女相似的12～18月齡雌性大鼠建立圍絕經(jīng)期模型，因此得出的結(jié)果也更具現(xiàn)實(shí)參考價(jià)值及臨床指導(dǎo)意義，為中藥治療卵巢衰老提供一定的參考依據(jù)[7-8]。

卵巢的功能主要依靠卵泡的血管生成而產(chǎn)生。血管生成受多種血管生長因子(如TGFA、TGFB、VEGF等)的調(diào)控。VEGF是已知最重要的血管生長因子，能增加血管的通透性、有利于卵泡液的形成、促進(jìn)卵泡的成熟同時(shí)維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，進(jìn)一步調(diào)控血管生成和改善卵巢微循環(huán)[9-14]。Bruno等[15]證實(shí)VEGF在雌性哺乳動(dòng)物卵巢中有特異表達(dá)，VEGF蛋白表達(dá)豐度隨卵泡發(fā)育而逐漸增強(qiáng)。同時(shí)Zimmermann等[16]指出通過減弱VEGF信號(hào)的傳遞,會(huì)降低卵泡膜細(xì)胞層的血管生成而阻止卵泡、卵泡腔的發(fā)育與形成，抑制顆粒細(xì)胞增殖和雌激素的產(chǎn)生。

a：老年對照組(HE ×200)；b：白芨多糖低劑量組(HE ×200)；c：白芨多糖中劑量組(HE ×200);d:白芨多糖高劑量組(HE ×200);e:老年對照組( HE ×400);f:白芨多糖低劑量組(HE ×400);g:白芨多糖中劑量組(HE ×400);h:白芨多糖高劑量組(HE ×400)

圖2大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)觀察

女性月經(jīng)周期循環(huán)導(dǎo)致原始卵泡不斷消耗，顆粒細(xì)胞需氧量提高，使卵泡處于缺氧狀態(tài)導(dǎo)致卵泡質(zhì)量下降,同時(shí)體內(nèi)超氧化物歧化酶等抗氧化酶系的活性下降使得卵巢內(nèi)正常代謝產(chǎn)生的活性氧不斷累積進(jìn)而影響細(xì)胞正常功能[17-19]，本實(shí)驗(yàn)測定的MDA作為一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,既是評價(jià)衰老的重要指標(biāo)之一,又可反映組織氧化的程度[20]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中藥各劑量組和老年對照組比較，提示其作用機(jī)制。一方面降低血清中MDA的含量，阻止氧自由基的累積對衰老卵巢微循環(huán)的破壞，進(jìn)而改善其血供;另一方面提高衰老卵巢中VEGF蛋白的含量，可能通過旁分泌的形式刺激卵泡膜內(nèi)皮細(xì)胞增生，調(diào)控血管生成和改善卵巢微循環(huán)從而延緩卵巢衰老過程。白芨多糖以其局部滯留性、無刺激性、無毒副作用等特點(diǎn)，能夠有效避免激素替代療法(hormone replacement therapy,HRT)產(chǎn)生的副作用。但是，白芨多糖中何種類成分使VEGF含量發(fā)生改變及其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。