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(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬蚌埠市第三人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,安徽 蚌埠 233000;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,安徽 蚌埠 233004;3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診外科,安徽 蚌埠 233004;4.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科,安徽 蚌埠 233004;5.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,安徽 蚌埠 233004;6.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,安徽 蚌埠 233004)
直腸癌是高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,一經(jīng)診斷,手術(shù)是目前唯一有望獲得根治的治療方法,但術(shù)后仍然有一定比例的患者發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[1-2]。迄今為止,直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確,這是限制直腸癌診療水平提高的根本因素。對(duì)直腸癌病理組織學(xué)的研究有望為探索直腸癌的發(fā)生與發(fā)展提供線索,為臨床診療提供參考。DEPTOR是新近發(fā)現(xiàn)的一種可與雷帕霉素靶蛋白(mechanistic TOR/mammalian, mTOR)結(jié)合的富含DEP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),為一種內(nèi)源性mTOR抑制劑,主要功能是在體外及細(xì)胞試驗(yàn)中抑制mTOR的活性[3-5]?,F(xiàn)有研究證實(shí),DEPTOR在多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、肝癌等組織中高表達(dá),且提示預(yù)后不良[6-7]。但DEPTOR在直腸癌中的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系尚未充分研究。本研究嘗試以直腸癌患者及手術(shù)標(biāo)本為研究對(duì)象,采用免疫組化檢測(cè)DEPTOR在直腸癌組織中的表達(dá),并進(jìn)一步分析其與臨床、病理組織學(xué)及預(yù)后的關(guān)系,以期為臨床診療提供參考,為探索直腸癌的發(fā)病提供線索。
2011年1月至2013年1月在我院接受直腸癌根治術(shù)的102例患者,采用免疫組化法檢測(cè)癌組織及癌旁組織中DEPTOR水平,并計(jì)算光密度值(integrated option density,IOD)。以患者癌組織中DEPTOR-IOD中位數(shù)為界將患者分為DEPTOR高表達(dá)組及低表達(dá)組。納入標(biāo)準(zhǔn):①均經(jīng)病理檢查明確診斷為直腸腺癌;②未接受過術(shù)前化療及放射治療;③無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并成功實(shí)施直腸癌R0切除;④術(shù)后5年生存資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他組織起源的惡性腫瘤;②臨床資料缺失;③手術(shù)標(biāo)本蠟塊遺失。
通過電子病歷系統(tǒng)回顧分析患者的臨床資料,包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)、病理診斷結(jié)果、術(shù)前癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)及糖類抗原199(carbohydrate antigen 199,CA199)。DEPTOR的檢測(cè)采用免疫組化法,收集直腸癌術(shù)后癌組織及癌旁組織標(biāo)本,予10%甲醛固定,經(jīng)脫水處理后再予石蠟包埋。連續(xù)切厚度為4 μm的切片,在60 ℃的環(huán)境下烘干及脫蠟后分別滴加兔抗人多克隆抗體過夜,予以蘇木素染色及脫水后經(jīng)透明樹膠封片。每張切片在200倍光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)不同視野觀察免疫組化染色結(jié)果,通過軟件(Image-Pro Plus 6.0)計(jì)算目標(biāo)蛋白DEPTOR的IOD值,取平均值作為單張切片的最終結(jié)果,并以癌旁組織IOD值為基線分別計(jì)算癌組織和癌旁組織的相對(duì)IOD值作為后期統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)值。采用Western blot法評(píng)估癌組織及癌旁組織DEPTOR表達(dá)水平,取癌組織和癌旁組織充分研磨,提取蛋白,Bradford定量,100 ℃煮沸變性,每孔加入35 μg提取蛋白,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入DEPTOR和β-actin(1∶1 000,Abcam公司)一抗稀釋液,4 ℃搖床12 h后滴加二抗,洗膜,滴加ECL顯影液,使用通過軟件(Image-Pro Plus6.0)定量分析條帶灰度值。
DEPTOR在直腸癌患者癌組織及癌旁組織中的表達(dá)差異;分析DEPTOR高表達(dá)組與低表達(dá)組在臨床及病理組織學(xué)上的差異;分析直腸癌患者DEPTOR的表達(dá)與外周血CEA及CA199水平的相關(guān)性;分析DEPTOR表達(dá)水平與患者手術(shù)預(yù)后的關(guān)系。
DEPTOR在癌組織中的相對(duì)IOD值為(2.73±0.21),高于其在癌旁組織中的相對(duì)IOD值(1.00) ;兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。Western blot證實(shí)DEPTOR在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。
a:癌組織蘇木素染色;b:癌旁組織蘇木素染色;c:癌組織與癌旁組織DEPTOR的IOD值; *:P<0.01
圖1直腸癌組織與癌旁組織DEPTOR表達(dá)水平比較(×200)
a:癌組織;b:癌旁組織
在直腸癌中,DEPTOR的高表達(dá)組與低表達(dá)組患者在性別、年齡、BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而在腫瘤直徑、T分期、N分期及分化程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。將單因素分析所得陽性結(jié)果納入Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析,結(jié)果顯示T分期、腫瘤直徑是影響DEPTOR表達(dá)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(P<0.05),見表2。
表1 2組患者臨床特征表達(dá)的差異(n=51,例)
表2 影響DEPTOR表達(dá)的多因素分析
DEPTOR高表達(dá)組患者外周血中CEA水平顯著高于低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DEPTOR高表達(dá)組患者外周血中CA199水平與低表達(dá)組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。
表3 2組患者外周血中CEA、CA199水平比較(n=51)
直腸癌患者DEPTOR表達(dá)水平與外周血CEA水平呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(r=0.509 ,P<0.01),見圖3。
圖3直腸癌患者癌組織中的DEPTOR的表達(dá)水平與外周血CEA水平的相關(guān)性
采用Kaplan-Meier生存曲線法對(duì)DEPTOR表達(dá)水平與患者手術(shù)預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析,組間比較通過Log-rankχ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),直腸癌DEPTOR高表達(dá)組患者術(shù)后5年累計(jì)復(fù)發(fā)率顯著高于DEPTOR低表達(dá)組,其5年累積死亡率顯著高于DEPTOR低表達(dá)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。
直腸癌是全球第三大高發(fā)惡性腫瘤,調(diào)查顯示每年約有130萬新增直腸癌病例,每年死于直腸癌患者人數(shù)達(dá)69萬[8]。我國(guó)是直腸癌高發(fā)國(guó)家,近年來隨著環(huán)境污染、食品安全及人口老齡化,直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[9-10]。直腸癌的發(fā)生伴隨一系列復(fù)雜而漸進(jìn)的病理生理過程,從腸黏膜損傷、炎癥、上皮內(nèi)瘤病變直至發(fā)展為原位癌,如未得到有效治療,則進(jìn)一步進(jìn)展至浸潤(rùn)癌[11-12]。直腸癌早期多無特異性臨床改變,這是導(dǎo)致直腸癌早期診斷較為困難的主要原因,相當(dāng)一部分患者就診時(shí)已錯(cuò)過最佳治療時(shí)期,也是部分患者預(yù)后不良的主要原因之一[13]。直腸癌一經(jīng)診斷,手術(shù)是有望根治的治療手段[14]。隨著以手術(shù)為主的腫瘤綜合治療水平提高,直腸癌術(shù)后5年生存率得到了一定提高,但仍然有一部分患者因術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡[15]。臨床上對(duì)于判斷直腸癌手術(shù)后的預(yù)后并無可靠指標(biāo),此外從疾病的發(fā)生、進(jìn)展及治療等角度分析,深入對(duì)直腸癌病理組織學(xué)的認(rèn)識(shí)是提供其診療水平的關(guān)鍵點(diǎn)[16]。DEPTOR作為一種內(nèi)源性mTOR抑制劑,是來源于染色體8q24分子量為48 kDa的蛋白質(zhì)[17],并且在多種疾病(如肥胖、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌、甲狀腺癌等)中過表達(dá),主要功能是參與細(xì)胞增殖過程[18-20]。此外,有文獻(xiàn)報(bào)道DEPTOR與多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺腫瘤及肝惡性腫瘤的復(fù)發(fā)率也有相關(guān)聯(lián),且與患者的總體生存率呈負(fù)相關(guān),是腫瘤不良預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)[21-22]。但我們發(fā)現(xiàn)DEPTOR在直腸癌組織學(xué)領(lǐng)域的研究并不充分。DEPTOR是否在直腸癌組織中異常表達(dá),以及是否可用以判斷患者的手術(shù)預(yù)后等問題均需要進(jìn)一步探索。
a: 5年累積復(fù)發(fā)率;b:5年累積死亡率
因而我們?cè)O(shè)計(jì)此研究,以直腸癌患者及直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本為研究對(duì)象,分析DEPTOR在直腸癌組織中的表達(dá)改變,與臨床及其他病理組織學(xué)改變的關(guān)系,并進(jìn)一步分析其是否有望成為評(píng)估手術(shù)預(yù)后的指標(biāo)。
本研究首先通過免疫組化法評(píng)估癌組織及癌旁組織DEPTOR表達(dá)水平,結(jié)果顯示直腸癌組織中的DEPTOR表達(dá)水平高于癌旁組織,這提示DEPTOR可能參與到直腸癌的發(fā)生與發(fā)展,通過Western blot進(jìn)一步證實(shí)了DEPTOR在癌組織中高表達(dá)。同時(shí)我們對(duì)DEPTOR表達(dá)的高低與臨床特征的關(guān)系進(jìn)行了分析,數(shù)據(jù)顯示DEPTOR高表達(dá)組直腸癌患者腫瘤直徑、T分期、N分期及分化程度與低表達(dá)組患者比較有顯著差異,這提示DEPTOR與直腸癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及惡性程度有關(guān)。此項(xiàng)結(jié)論同樣在乳腺癌中得到了證實(shí),如Parvani等[23]的研究顯示,DEPTOR在乳腺癌中過表達(dá),并且與細(xì)胞增殖相關(guān)。本研究進(jìn)一步通過將影響DEPTOR在癌組織中表達(dá)的陽性單因素結(jié)果納入Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析,結(jié)果顯示T分期、腫瘤直徑是影響DEPTOR表達(dá)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素,提示DEPTOR的表達(dá)與直腸癌的侵襲、增殖等均密切相關(guān),但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。CEA是上皮源性腫瘤的標(biāo)志物,也是臨床用以判斷直腸癌進(jìn)展、預(yù)后及復(fù)發(fā)等的常用指標(biāo)[24-25]。我們分析了直腸癌組織內(nèi)DEPTOR的表達(dá)水平與外周血CEA的相關(guān)性,意外發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著正相關(guān)關(guān)系,提示DEPTOR可能在直腸癌的惡性行為中扮演重要角色。同時(shí),本研究通過Kaplan-Meier生存曲線法分析DEPTOR表達(dá)水平與患者手術(shù)預(yù)后的關(guān)系,采用Log-rankχ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),直腸癌DEPTOR高表達(dá)組患者5年累積復(fù)發(fā)率及5年累積死亡率均顯著高于DEPTOR蛋白低表達(dá)組。這一研究結(jié)果提示DEPTOR在直腸癌中的表達(dá)水平影響患者的預(yù)后,而DEPTOR的表達(dá)有望成為輔助判斷直腸癌患者手術(shù)預(yù)后的指標(biāo)。
本研究雖然取得一些發(fā)現(xiàn),但仍然存在以下不足:由于研究對(duì)于臨床、病理等資料的完整性要求較高,因而納入的樣本量有限,所得結(jié)果仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證;本研究屬于回顧性研究,仍然需要開展前瞻性研究以進(jìn)一步明確DEPTOR在直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及對(duì)預(yù)后的影響。
綜上所述,DEPTOR在直腸癌中高表達(dá),并與外周血CEA水平呈正相關(guān),DEPTOR的表達(dá)水平與腫瘤大小、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移相關(guān),且提示手術(shù)預(yù)后不良。