田 翠 來 松 徐多嬌 侯翠柳 劉 洋 王紅霞 楊 慧

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷是在缺血的基礎(chǔ)上恢復血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象[1]，其發(fā)生機制復雜，尚未完全明了。心肌梗死面積是評價心肌缺血/再灌注損傷的重要指標[2]。目前國內(nèi)外研究中用于評價心肌梗死面積的染色方法主要是TTC染色(triphenyltetrazolium chloride，2，3，5-氯化三苯基四氮唑)[3-4]和TTC-Evans blue 雙染方法。TTC-Evans blue雙染的方法優(yōu)點是能夠確定梗死面積，危險區(qū)面積和非缺血區(qū)面積[5]，但其操作困難，失敗率較高，并沒有廣泛使用。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system, UPS)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與細胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)的降解，其在心血管疾病中具有重要的病理生理學意義，本實驗室前期研究結(jié)果提示泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與了缺血/再灌注損傷過程[6]，但其作用仍需進一步探討。本研究旨在優(yōu)化目前的TTC-Evans blue雙染方法，并探討蛋白酶體各個亞基在I/R損傷中的作用。

材料與方法

1.實驗材料 SPF，雄性，C57BL/6J(野生型, WT)小鼠，8周，16只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(動物許可證號SCXK(京) 20120001)，隨機分為兩組：①假手術(shù)組(Sham組)；②心肌缺血/再灌注組(I/R組)。

2.主要試劑 TTC和Evens blue染料均購自美國Sigma 公司；抗β1單抗、抗β2單抗、抗β5單抗、抗β1i單抗、抗β2i單抗和抗β5i單抗均購自abcam 公司；羊抗鼠IgG 抗體-辣根過氧化物酶標記購自美國Santa Cruz 公司；Tween-20 等購自美國Sigma 公司；蛋白酶體活性檢測試劑盒購自美國的Promage公司；Caspase 3 活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，TUNEL染色試劑盒購自Roche公司。

3.小鼠心肌缺血再灌注模型建立 小鼠經(jīng)三溴乙醇麻醉，固定，從左側(cè)胸壁第4、5肋間打開胸腔，暴露心臟，在左冠狀動脈前降支位置處結(jié)扎，使其缺血45min，后松開再灌注2h，復制I/R模型，Sham組小鼠僅將線穿過前降支，不結(jié)扎[7]。

4.TTC-Evans blue雙染方法 重新結(jié)扎前降支，再迅速分離出主動脈弓，剪斷主動脈放血，主動脈逆向注入1% Evans blue；快速剪取心臟，置放在冰0.9%氧化納氫中，解開結(jié)扎的前降支，用平頭帶有凹槽的7號注射器針頭逆行主動脈插管并固定；緩慢將37℃溫浴的1%TTC溶液注入心臟，在37℃孵育3～4min；之后剪去心耳，向心腔內(nèi)注入15%的藻酸鹽糊劑固形，等干燥后，置于4%多聚甲醛中固定12～24h；將心臟置于切片模具中，澆以10%瓊脂糖，待冷卻后用薄刀片將其均勻切成5～6片(約1 mm)；按順序正反面照相，用Image J軟件計算梗死區(qū)、危險區(qū)、遠端區(qū)及總面積。

5.組織總泛素化蛋白的表達檢測 取心肌組織勻漿上清，SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫封閉60 min，孵育抗β1，β2，β5，β1i，β2i，β5i一抗(1∶1 000)，4℃過夜。TBST洗膜后，室溫孵育羊抗鼠IgG 抗體-辣根過氧化物酶標記二抗60min，通過凝膠成像系統(tǒng)成像。

6.蛋白酶體活性及Caspase 3活性檢測 取心肌組織勻漿上清，用專用黑色96 熒光檢測板檢測泛素26 S 蛋白酶體活性。糜蛋白酶、半胱天冬酶、胰蛋白酶活性檢測時分別加入的特異抑制劑為：10nmol/L bortezomib、25μmol/L Ac- APnLD- al、20 mol/L leu-peptin。37℃，避光孵育2h，Tecan 光譜儀檢測熒光，激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是360nm和465nm，檢測蛋白酶體各亞基活性；另取 50～200μg 組織勻漿上清，加入50μL 的2×Reaction Buffer，加入5μL Caspase-3 Substrate 并于37℃ ，避光孵育4h，酶標儀檢測405nm吸光值測定Caspase-3 活性。

7.TUNEL染色 心臟在4%多聚甲醛中固定，然后用石蠟包埋、切片(厚度5μm)，按照羅氏試劑盒說明書進行TUNEL染色。采用Nikon Labophot2顯微鏡進行采圖(×200)。選擇6～8個視野，應(yīng)用Image J軟件統(tǒng)計每個視野中的細胞核數(shù)目及凋亡細胞數(shù)，計算凋亡細胞與總細胞的比值即為陽性凋亡百分數(shù)。

8.統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS16.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，各組間計量資料的比較采用單因素方差(one way ANOVA)分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.改良的TTC-Evans blue雙染法可以明確顯示心肌I/R損傷時的形態(tài)學變化 在I/R模型上，采用改良的TTC-Evans blue雙染方法可以明確顯示梗死區(qū)(infarct area，呈白色)、危險區(qū)(area at risk, AAR，呈紅色)和遠端區(qū)(呈藍色)面積。與sham組相比，I/R組梗死面積/危險區(qū)面積明顯增加(32.6%，n=8，P<0.01)，sham組與I/R組危險區(qū)面積/總面積無顯著差異，與文獻報道一致[7](圖1)。

圖1 I/R損傷引起心肌細胞死亡心肌組織TTC染色結(jié)果，梗死區(qū)(Infarct Area)呈黃白色，危險區(qū)(AAR) 呈紅色，遠端區(qū)呈藍色(n=8，* P <0.01)

2.I/R損傷后心肌細胞凋亡明顯增多 TUNEL染色結(jié)果顯示，I/R損傷引起心肌細胞凋亡數(shù)明顯增加，是假手術(shù)組的5.47倍(n=8，P<0.01)；I/R損傷造成心肌組織中Caspase-3 的活性明顯增高，為Sham組的2.8倍 (n=8，P<0.05,圖2)。

圖2 I/R損傷加重心肌細胞凋亡A：心肌組織TUNEL染色結(jié)果：α-actinin顯示心肌細胞呈紅色熒光；TUNEL染色顯示凋亡的細胞呈綠色熒光；DAPI染色顯示細胞核呈藍色B：心肌組織Caspase-3活性測定結(jié)果(n=8，*P <0.05，**P<0.01)

3.I/R損傷后心肌細胞內(nèi)蛋白酶體活性被抑制 為了探索心肌I/R損傷的發(fā)病機制，檢測了I/R模型中危險區(qū)蛋白酶體肽酶活性變化。與Sham組相比，I/R組心肌組織蛋白酶體活性均降低，其中胰蛋白酶(β1)降低16%、半胱天冬酶(β2)降低6%、糜蛋白酶(β5) 降低32%，糜蛋白酶的變化有顯著性差異(n=8，P<0.05,圖3)。

圖3 I/R損傷時心肌組織中蛋白酶體的活 性受到抑制(n=8，*P<0.05)

圖4 I/R損傷時心肌組織中蛋白酶體及免疫蛋白酶體各亞基的表達降低(n=8，*P<0.05)

4.I/R損傷時心肌組織中蛋白酶體及免疫蛋白酶體各亞基的表達降低 進一步檢測蛋白酶體亞基β1、β2、β5和免疫蛋白酶體β1i、β2i、β5i蛋白含量表達。I/R組組成型蛋白酶體亞基β1、β2、β5蛋白表達呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，分別比sham組下降3%、6%和16%；而免疫蛋白酶體β1i、β2i、β5i蛋白表達顯著降低，分別比sham組下降49%、48%和54%(n=8，P<0.05，圖4)。

討 論

TTC是一種脂溶性光敏感復合物，它是呼吸鏈中吡啶—核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，能與活細胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色化合物，從而使有活力的細胞呈現(xiàn)紅色。而死亡細胞由于脫氫酶活力已經(jīng)消失，TTC無法還原，因此梗死組織呈現(xiàn)白色[5-6]。TTC染色的優(yōu)點是操作簡單，容易實施；缺點是不能保證缺血面積的均一性，迄今為止一直沒有統(tǒng)一標準的實驗步驟。TTC- Evans blue雙染色的原理是在TTC染色的基礎(chǔ)上加上Evans blue染色。Evans blue 是一種藍色染料，主動脈逆行灌注染料能夠到達心臟除結(jié)扎的前降支以外的其他血管，滲入組織，從而使未結(jié)扎區(qū)呈現(xiàn)藍色。目前國內(nèi)外發(fā)表的文章中兩種方法均有應(yīng)該，既然TTC-Evans blue雙染明顯優(yōu)于TTC染色，為什么還沒有被普遍使用？究其原因主要有兩個：第一，通過主動脈逆行灌注Evans blue時，血管閉合或者壓力太大，導致藍色灌不進去，也容易導致用力過猛藍色過度著色；第二，TTC染色時由于需要反復多次通過主動脈灌注TTC溶液，難以固定主動脈插管。針對存在的這些問題，本實驗做了三點改進：首先，剪斷主動脈放血，減輕主動脈及冠狀動脈內(nèi)的壓力；其次，使用一種自制的頭部帶有橡膠圈的眼科鑷固定主動脈，防止滑脫，將平頭且?guī)в邪疾鄣?便于固定)5 mL注射器針頭逆行插入主動脈，并用打結(jié)固定，保證TTC溶液和Evans blue成功灌注；另外，心臟切片時使用一種小組織切片模具，以保證心臟切片平整，并且每個組織切片的厚度一致。改良的TTC-Evans blue雙染方法可以更好地顯示梗死區(qū)、危險區(qū)和遠端區(qū)面積，為I/R損傷引起的心肌梗死機制的研究提供了可靠形態(tài)學的支持。

I/R損傷過程伴有大量細胞凋亡及死亡，伴隨細胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)的降解。真核細胞內(nèi)80%的蛋白質(zhì)被UPS降解。UPS主要包括泛素激活酶(E1)、泛素轉(zhuǎn)運酶(E2)、泛素連接酶(E3)和26S蛋白酶體。其中26S蛋白酶體，由20S催化核心顆粒和19S調(diào)節(jié)顆粒組成[9]。20S核心顆粒含有3個具有酶活性的組成型催化亞基β1、β2、β5，分別具有類似半胱天冬酶(caspase-like)、胰蛋白酶(trypsin-like)和糜蛋白(chymotrypsin-like)三種肽酶的活性，它們在維持正常的細胞周期、細胞增殖、細胞生存等方面發(fā)揮著重要的作用[10-11]。在促炎癥因子如γ干擾素(INF-γ)等刺激下，β1、β2、β5亞基可被誘導型催化亞基β1i、β2i、β5i取代，形成免疫蛋白酶體[12]。目前的研究已證實蛋白酶體參與缺血再灌注的發(fā)生[6]，但是蛋白酶體如何調(diào)節(jié)I/R損傷的機制尚不清楚，本實驗初步探索了蛋白酶體功能與心肌I/R損傷的關(guān)系。改良的TTC-Evans blue雙染色方法可以很好的顯示心肌梗死區(qū)域(圖1)，基于此，本實驗還檢測了心肌細胞的凋亡及Caspase-3活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)I/R促進了心肌細胞凋亡及Caspase-3活性的增加(圖2)，與文獻報道一致。有趣的是，危險區(qū)心肌組織中糜蛋白酶樣活性顯著降低(圖3)，而且免疫蛋白酶亞基β1i、β2i、β5i蛋白表達顯著下降(圖4)。此結(jié)果提示，心肌I/R時細胞內(nèi)蛋白酶體尤其是免疫蛋白酶功能嚴重受損，加重了心肌細胞的凋亡及壞死。

本實驗改良了TTC-Evans blue雙染的方法，使其易于操作，提高了染色的成功率，為心肌缺血壞死性疾病研究提供可靠的形態(tài)學支持。另外發(fā)現(xiàn)免疫蛋白酶體的功能抑制可能加重了I/R損傷的過程，為臨床研究I/R損傷機制提供新的思路，為新藥物的開發(fā)提供了靶點。