牟雪姣，張 強(qiáng)，吳 燕，王雪娟，張遠(yuǎn)兵

(安徽科技學(xué)院 建筑學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

干旱是世界性的自然災(zāi)害之一，干旱會(huì)導(dǎo)致糧食作物和蔬菜減產(chǎn)，甚至絕收，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，提高農(nóng)作物抗旱性是國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者一直在研究的重要課題[1]。黃瓜(CucumissativusL.)作為一種日常食用的蔬菜作物，每年的消費(fèi)量很大，但由于黃瓜根系淺(多分布在30 cm以內(nèi)的土層中)、喜濕、抗旱能力較差，提高黃瓜對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性已成為蔬菜栽培領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題之一[2]。

一氧化碳(Carbon monoxide，CO)是繼一氧化氮之后被發(fā)現(xiàn)的又一氣體信號(hào)分子，它參與種子萌發(fā)、休眠、氣孔關(guān)閉等多種植物生理生化過(guò)程[3]，是植物應(yīng)對(duì)各種非生物脅迫的有效抗氧化劑，能夠有效緩解脅迫條件下自由基對(duì)植株造成的氧化損傷[4]。有研究表明，CO能夠提高黃連幼苗對(duì)鹽脅迫的抗性[5]，參與干旱脅迫下苜蓿種子萌發(fā)的調(diào)控[6]，還能夠與氫氣共同調(diào)節(jié)干旱脅迫下黃瓜不定根的發(fā)育[1]。此外，CO還可以與NO、H2O2等信號(hào)分子協(xié)同作用，通過(guò)共同介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，應(yīng)對(duì)各種脅迫對(duì)植物造成的傷害[3]。但外源CO對(duì)干旱脅迫條件下黃瓜萌發(fā)生長(zhǎng)緩解效應(yīng)的研究迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以萌發(fā)的黃瓜種子為試驗(yàn)材料，從養(yǎng)分吸收能力、質(zhì)膜穩(wěn)定性、滲透調(diào)節(jié)能力和水解酶的活性及其同工酶表達(dá)水平等角度，探討外源CO抵抗黃瓜干旱脅迫的作用效果與機(jī)理，以期為CO作為抗旱誘導(dǎo)劑在黃瓜優(yōu)質(zhì)、高效栽培中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)

新津研四號(hào)黃瓜種子購(gòu)于天津市中天種業(yè)有限公司。將種子用0.1%的氯化汞浸泡消毒10 min，然后用蒸餾水漂洗6次，晾干。把晾干后種子分成2份，一份用蒸餾水，另一份用0.01 μmol/L高鐵血紅素溶液(CO的供體)在25 ℃下浸泡8 h，然后將種子轉(zhuǎn)移到墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿放20粒種子，分別向皿中加入蒸餾水或質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% 的PEG6000溶液，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)更換相應(yīng)的處理液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，所有處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)5皿。各處理分別為：對(duì)照組(CK).蒸餾水浸種，蒸餾水培養(yǎng)；PEG.蒸餾水浸種，10%PEG培養(yǎng)；CO.高鐵血紅素浸種，蒸餾水培養(yǎng)；PEG+ CO.高鐵血紅素浸種，10% PEG培養(yǎng)。在種子處理的第2天測(cè)定發(fā)芽勢(shì)，第3天測(cè)定發(fā)芽率，第4天測(cè)定生理、生化指標(biāo)，第6天測(cè)量根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)及鮮質(zhì)量。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 以露白長(zhǎng)度≥1 /2 種子長(zhǎng)度作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算黃瓜種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。

每皿隨機(jī)選取10株，用直尺測(cè)量根長(zhǎng)和胚軸長(zhǎng)；用蒸餾水沖洗3遍，濾紙吸干表面水分，用電子天平精確稱量鮮質(zhì)量。

發(fā)芽勢(shì)=第2天發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；發(fā)芽率=第3天發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%。

1.3.2 種子吸脹的測(cè)定 種子吸脹的測(cè)定采用碘-碘化鉀法[7]。向每個(gè)處理加入處理液總體積2%的碘/碘化鉀溶液(0.6% 碘和6%碘化鉀)，培養(yǎng)24 h，拍照記錄種子顏色與體積大小。由于種子吸脹，碘試劑會(huì)進(jìn)入種子內(nèi)部，與淀粉發(fā)生顯色反應(yīng)，因此，種子的體積大小與顏色深淺代表種子的吸脹程度。

1.3.3 根質(zhì)膜透性測(cè)定 根質(zhì)膜透性的測(cè)定采用伊文思藍(lán)染色法[8]。先用0.5 mmol/L的氯化鈣溶液將各處理的根洗凈，用濾紙吸干表面水分，置于伊文思藍(lán)染液(pH值5.6，含0.025%的伊文思藍(lán)，0.5 mmol/L的氯化鈣)中浸泡，10 min后取出，用0.5 mmol/L的氯化鈣溶液漂洗多次，再次用濾紙吸干表面水分，用相機(jī)拍照記錄結(jié)果。

1.3.4 水解酶活性測(cè)定 淀粉酶活性和酯酶活性的測(cè)定分別采用3，5-二硝基水楊酸顯色法[9]和固蘭B鹽顯色法[10]。

1.3.5 水解酶同工酶電泳 稱取不同處理的黃瓜種子各1.0 g，置于預(yù)冷的研缽中，加入5 mL 50 mmol/L pH值7.8的磷酸鹽緩沖液(含5 mmol/L的β-巰基乙醇和2%聚乙烯吡咯烷酮)和少量的石英砂于冰浴研磨， 4 ℃條件下離心(10 000 r/min)30 min，上清液即為水解酶提取液。

水解酶的同工酶電泳參照Z(yǔ)hang等[11]的方法進(jìn)行。分離膠濃度10%，濃縮膠濃度4%。其中，淀粉酶同工酶電泳用碘-碘化鉀溶液染色，酯酶同工酶電泳用醋酸萘脂-固藍(lán)B鹽染色。

1.3.6 其他生理指標(biāo)的測(cè)定 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定參照Hannachi等[12]的方法進(jìn)行；根系活力及可溶性糖和可溶性蛋白含量的測(cè)定分別采用氯化三苯基四氮唑( TTC )法、蒽酮比色法和考馬斯亮藍(lán)G-250染色法，具體參照李合生等[13]的方法。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 19.0和Origin 8.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖；用Tukey法判斷試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源CO對(duì)黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響

發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽后的根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)及鮮質(zhì)量是反映黃瓜生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)。從表1 可以看出，與對(duì)照組CK相比，PEG脅迫組的5個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)均顯著降低(P<0.05)，表明干旱脅迫嚴(yán)重抑制了黃瓜種子的萌發(fā)生長(zhǎng)；CO處理組與CK間無(wú)明顯差異，PEG+CO處理組的5個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)雖顯著低于CK(P<0.05)，但顯著高于PEG脅迫組(P<0.05)，表明外源CO對(duì)干旱脅迫下黃瓜種子的萌發(fā)生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用。

表1 外源CO對(duì)干旱脅迫下黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effects of CO on the germination and growth of cucumber seeds under drought stress

注： 數(shù)據(jù)為3次測(cè)量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note：Data are shown as means ±standard deviation (n=3)； Different lowercase letters in the same column indicate significantly Different (P<0.05).

2.2 外源CO對(duì)黃瓜種子養(yǎng)分吸收能力的影響

通常情況下，吸脹是植物種子萌發(fā)的前提，干旱脅迫會(huì)限制種子吸脹，從而阻礙種子萌發(fā)[14]。從圖1-A的黃瓜種子吸脹試驗(yàn)結(jié)果可以看出，PEG處理組的黃瓜種子體積明顯小于CK，顏色也較CK淺，說(shuō)明干旱脅迫抑制了種子的吸脹；CO處理組的黃瓜種子體積及顏色深淺與CK相似，無(wú)明顯差異；而PEG+CO處理組的黃瓜種子的體積與著色程度均明顯優(yōu)于PEG處理，表明外源CO有利于干旱脅迫下黃瓜種子的吸水膨脹，促進(jìn)黃瓜種子對(duì)水分的吸收與利用。

根系活力泛指根系的吸收、合成和氧化還原能力等，是反映根系生命力的綜合生理指標(biāo)[15]。從圖1-B可以看出：與CK相比，PEG脅迫組黃瓜種子的根系活力(以鮮質(zhì)量計(jì))顯著下降(P<0.05)，單獨(dú)CO處理組的根系活力較CK顯著提高(P<0.05)，而PEG+CO處理組的根系活力盡管也顯著下降，但比PEG脅迫組提高了12.57%，表明外源CO處理可以緩解干旱脅迫對(duì)黃瓜根系的傷害，提高黃瓜根系對(duì)養(yǎng)分的吸收能力。

圖1 外源CO對(duì)干旱脅迫下黃瓜種子吸脹(A)和根系活力(B)的影響Fig.1 Effect of exogenous CO on the cucumber seeds imbibition (A) and root activity (B) under drought stress

2.3 外源CO 對(duì)黃瓜種子質(zhì)膜穩(wěn)定性的影響

大量研究表明，干旱脅迫可破壞質(zhì)膜的完整性，導(dǎo)致質(zhì)膜的透性增大，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時(shí)干旱誘導(dǎo)的膜脂過(guò)氧化也是造成植物細(xì)胞膜受到損傷的關(guān)鍵因素之一[16-18]。利用伊文思藍(lán)對(duì)黃瓜的根系進(jìn)行染色可以反映黃瓜根系的質(zhì)膜完整性，因?yàn)楦档娜玖现潭扰c質(zhì)膜透性呈正相關(guān)[19]。而MDA含量則是反映植物膜脂過(guò)氧化的水平和細(xì)胞膜損傷程度的重要指標(biāo)。

從圖2-A可以看出，與對(duì)照組CK相比，PEG處理的根尖顏色明顯加深，說(shuō)明干旱脅迫明顯增加了黃瓜根尖的質(zhì)膜透性；CO處理的根尖著色與CK差別不明顯，而PEG+CO處理的根尖著色略深于對(duì)照組，但明顯淺于PEG脅迫組，說(shuō)明外源CO處理可抑制干旱脅迫導(dǎo)致的根質(zhì)膜損傷。從圖2-B可以看出，PEG處理組的MDA(以鮮質(zhì)量計(jì))含量最高，而PEG+CO處理組MDA含量雖顯著高于對(duì)照組，但遠(yuǎn)低于PEG處理組，比PEG脅迫組降低了25.81%。這表明，外源CO處理能夠有效地降低細(xì)胞膜脂過(guò)氧化水平，減輕干旱脅迫對(duì)黃瓜根系造成的氧化損傷。

圖2 外源CO對(duì)干旱脅迫下黃瓜種子質(zhì)膜透性(A)和MDA含量(B)的影響Fig.2 Effects of exogenous CO on the plasma membrane permeability (A) and MDA content (B) of cucumber seeds under drought stress

2.4 外源CO 對(duì)黃瓜種子滲透調(diào)節(jié)能力的影響

滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)滲透脅迫傷害的一種應(yīng)急反應(yīng)，通過(guò)主動(dòng)增加細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)，降低滲透勢(shì)以促進(jìn)細(xì)胞吸水從而維持細(xì)胞膨壓[20]?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍资侵参锛?xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它們可以緩解滲透脅迫對(duì)植株造成的損傷。從圖3可以看出，PEG脅迫組的可溶性糖和可溶性蛋白含量(以鮮質(zhì)量計(jì))均比對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，表明黃瓜種子自身對(duì)干旱脅迫傷害做出了響應(yīng)；CO處理組的可溶性糖和可溶性蛋白含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，PEG+CO處理組的可溶性糖和可溶性蛋白含量分別比PEG脅迫組提高了32.56%和5.84%，表明施用外源CO可以改善黃瓜種子的滲透調(diào)節(jié)，提高黃瓜種子對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性。

圖3 外源CO對(duì)干旱脅迫下黃瓜種子可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影響Fig.3 Effects of exogenous CO on the contents of soluble sugar (A) and soluble protein (B) in cucumber seeds under drought stress

2.5 外源CO 對(duì)黃瓜種子水解酶活性及其同工酶表達(dá)的影響

在黃瓜種子萌發(fā)的過(guò)程中，體內(nèi)積累的淀粉會(huì)在淀粉酶的作用下，被降解并以蔗糖的形式轉(zhuǎn)運(yùn)到胚芽和胚根中，為種子萌芽和生長(zhǎng)提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)[21]。因此，淀粉酶對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)起著非常重要的作用。從圖4-A可以看出，與CK相比，其他各處理均能顯著提高黃瓜種子的淀粉酶的活性(P<0.05)，但以PEG+ CO處理組增加幅度最大，比對(duì)照組提高了27.45%，比PEG組提高了9.87%。從圖4-B可以看出，對(duì)照組CK的淀粉酶同工酶有2條較弱的條帶，PEG脅迫組增加了1條條帶，且各條帶的亮度較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，CO處理組和PEG+CO處理組的淀粉酶同工酶條帶均比對(duì)照組增加了2條，但PEG+CO處理組條帶的寬度和亮度均高于其他處理組。這些結(jié)果表明，黃瓜種子自身可以通過(guò)增強(qiáng)淀粉酶活性，促進(jìn)淀粉酶同工酶的表達(dá)來(lái)對(duì)干旱脅迫做出響應(yīng)，而外源CO能夠在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高其淀粉酶的活性，誘導(dǎo)新的同工酶表達(dá)，以提升黃瓜種子對(duì)干旱脅迫的抗性。

酯酶作為一種水解酶，同淀粉酶一樣，在植物種子萌發(fā)過(guò)程中也發(fā)揮著非常重要的作用。由圖4-C可知，不同處理的酯酶活性變化趨勢(shì)與淀粉酶相似，即各處理均能顯著提高黃瓜種子的酯酶的活性(P<0.05)，但以PEG+CO處理活性最強(qiáng)，比對(duì)照組提高了58.91%，比PEG組提高了48.87%。從圖4-D的酯酶同工酶電泳檢測(cè)結(jié)果可以看出，不同處理的黃瓜種子的酯酶同工酶均有6條條帶，條帶顏色深度的大小排序?yàn)椋篜EG+CO>CO>PEG>CK。上述結(jié)果表明，單獨(dú)的PEG或CO處理均可誘導(dǎo)黃瓜酯酶活性的增強(qiáng)及酯酶同工酶的表達(dá)，但以PEG+CO的作用效果最佳。即外源CO能在黃瓜種子自身響應(yīng)干旱脅迫的基礎(chǔ)上通過(guò)進(jìn)一步提高酯酶活性，增強(qiáng)酯酶同工酶的表達(dá)，來(lái)緩解黃瓜種子在干旱脅迫下所受的傷害。

A.淀粉酶活性；B.淀粉酶同工酶譜；C.酯酶活性； D.酯酶同工酶譜。 A.Amylase activity；B.Amylase isoenzyme patterns；C.Esterase activity；D.Esterase isoenzyme patterns.

3 討論

CO作為重要的氣體信號(hào)分子，在植物生命活動(dòng)中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn) CO在多種非生物脅迫條件下均能發(fā)揮重要作用，能夠緩解逆境對(duì)植物體的傷害，提高植物對(duì)逆境的抗性[3]。本試驗(yàn)研究了CO對(duì)干旱脅迫下黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，干旱脅迫下，外源CO處理對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，這與Chen等[1]的研究結(jié)果一致。

自然界大多數(shù)植物的種子，不吸水膨脹就不能萌發(fā)，種子的吸脹是萌發(fā)的前提。本試驗(yàn)中，PEG脅迫處理對(duì)黃瓜種子吸脹表現(xiàn)出明顯的抑制作用，而PEG+CO處理較PEG脅迫處理表現(xiàn)出顯著的緩解效應(yīng)，說(shuō)明外源CO有助于干旱脅迫條件下黃瓜種子對(duì)水分的吸收利用。根系活力是植物對(duì)養(yǎng)分吸收能力的一個(gè)重要指標(biāo)，根系活力的大小直接影響植物地上部分的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況[22]。本研究中，外源CO處理對(duì)黃瓜正常生理及PEG脅迫下的根系活力的提高均有顯著的促進(jìn)作用，表明外源CO可以提高黃瓜種子對(duì)養(yǎng)分的吸收能力，這可能是外源CO提高黃瓜種子對(duì)干旱脅迫適應(yīng)性的一個(gè)關(guān)鍵因素。

在干旱脅迫條件下，植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，一方面，會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，造成膜脂過(guò)氧化損傷，產(chǎn)生丙二醛，使植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受到破壞；另一方面，細(xì)胞滲透勢(shì)增加，膨壓加大，細(xì)胞會(huì)發(fā)生被動(dòng)脫水。與此同時(shí)，植物自身也會(huì)對(duì)逆境條件做出積極響應(yīng)，以應(yīng)對(duì)干旱脅迫[23]。本研究中，PEG脅迫處理，導(dǎo)致了黃瓜種子質(zhì)膜透性增大，MDA大量積累，說(shuō)明脅迫對(duì)黃瓜的細(xì)胞膜系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的損傷。PEG脅迫處理的黃瓜種子中的可溶性糖和可溶性蛋白的含量均較對(duì)照組顯著提高，這是黃瓜種子對(duì)干旱逆境的響應(yīng)。與PEG脅迫處理相比，PEG+CO處理的根質(zhì)膜透性和MDA含量均明顯降低，可溶性糖和可溶性蛋白的含量均顯著升高，表明外源CO可以抑制膜質(zhì)過(guò)氧化損傷，維持逆境下細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，并改善滲透調(diào)節(jié)能力，這可能是外源CO增加黃瓜抗旱能力的重要環(huán)節(jié)。

植物種子萌發(fā)的初始階段所需要的能量主要來(lái)源于貯存物質(zhì)(淀粉、脂類等) 的氧化分解，而這一代謝過(guò)程主要由淀粉酶和酯酶來(lái)催化完成。本研究中，PEG脅迫組的淀粉酶和酯酶的活性及其同工酶表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高，這是黃瓜種子對(duì)干旱脅迫應(yīng)激反應(yīng)的表現(xiàn)；CO處理的淀粉酶和酯酶的活性及其同工酶表達(dá)水平顯著優(yōu)于對(duì)照組，PEG+CO處理組的淀粉酶和酯酶的活性及其同工酶表達(dá)水平顯著優(yōu)于PEG脅迫組，表明外源CO能夠通過(guò)提升黃瓜種子水解酶的活性，增強(qiáng)水解酶同工酶的表達(dá)水平，來(lái)有效保證黃瓜種子萌發(fā)期間的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，這可能是外源CO緩解黃瓜干旱脅迫的又一重要機(jī)制。

綜上所述，外源CO 可以通過(guò)提高干旱脅迫下黃瓜種子對(duì)養(yǎng)分的吸收能力、維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性、改善滲透調(diào)節(jié)能力、提升淀粉酶和酯酶的活性及其同工酶的表達(dá)水平來(lái)增強(qiáng)其對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性，進(jìn)而促進(jìn)了脅迫條件下黃瓜種子的萌發(fā)生長(zhǎng)。