李 瑞，徐海霞,2，吳 偉，王素瑩，任夢(mèng)可，張朋朋,2，徐永杰,2

(1. 信陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000； 2. 信陽(yáng)師范學(xué)院 大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院，河南 信陽(yáng) 464000)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)是MEK(MAPK/ERK激酶)激酶家族成員之一，是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路上游重要的調(diào)節(jié)蛋白[1]。TAK1可被細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素、UV等刺激信號(hào)所激活，通過(guò)活化 JNK、p38 和 NF-κB 信號(hào)通路來(lái)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的自我更新、分化、存活和炎癥反應(yīng)等重要生物學(xué)過(guò)程[2-5]。小鼠中敲除TAK1基因會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡，表明TAK1在小鼠正常發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[6-7]；組織特異敲除TAK1基因小鼠模型的研究，進(jìn)一步揭示TAK1可以參與血管發(fā)育、角質(zhì)細(xì)胞分化、造血細(xì)胞和肝細(xì)胞的存活、軟骨和免疫器官的發(fā)育等多個(gè)發(fā)育過(guò)程[3，8-11]。在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育中TAK1也起著重要的調(diào)控作用， 其在小鼠骨骼肌發(fā)育早期被激活并呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)，主要通過(guò)活化p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的增殖與分化[12-15]。而TAK1缺失的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染導(dǎo)入MyoD基因也不能誘導(dǎo)分化為成肌細(xì)胞，進(jìn)一步表明TAK1為成肌分化所必需[12]。此外，Ogura等[2]報(bào)道，TAK1對(duì)維持肌肉衛(wèi)星干細(xì)胞池和肌肉再生也發(fā)揮重要作用。TAK1是肌衛(wèi)星細(xì)胞的存活和增殖所必需的調(diào)控因子，它可以在肌衛(wèi)星細(xì)胞中激活JNK和 NF-κB信號(hào)通路， TAK1的缺失或失活會(huì)誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞的氧化應(yīng)激并通過(guò)壞死性凋亡引起自發(fā)的細(xì)胞死亡。因此，TAK1是一個(gè)影響動(dòng)物骨骼肌成肌分化和肌肉再生的重要基因，把其作為豬肌肉生長(zhǎng)和肌肉品質(zhì)相關(guān)的候選基因進(jìn)行研究，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。目前，有關(guān)豬TAK1基因的序列、表達(dá)模式以及結(jié)構(gòu)功能等方面的研究還較少，本研究利用PCR和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends，cDNA末端快速克隆)技術(shù)克隆獲得了豬TAK1基因的cDNA序列全長(zhǎng)，并對(duì)TAK1基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)了TAK1基因在中外不同豬種(梅山豬與大白豬)背最長(zhǎng)肌不同發(fā)育時(shí)期以及大白豬不同組織中的表達(dá)情況；利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)將豬TAK1基因與GFP融合表達(dá)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡分析其亞細(xì)胞定位情況，旨在探討豬TAK1基因的結(jié)構(gòu)與功能，同時(shí)也為下一步細(xì)胞水平的功能研究以及揭示其在豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 試驗(yàn)豬為來(lái)自于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)精品豬場(chǎng)的純種大白豬和梅山豬，在相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)，采集7個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的背最長(zhǎng)肌(胚胎期65 d及出生后3，21，60，90，120，180 d，每個(gè)時(shí)期3頭母豬)，另外采集出生后120 d大白豬的大腦、心、肝、脾、肺、腎、胰腺、脂肪、骨骼肌、胃、小腸、卵巢、輸卵管、皮14個(gè)組織，各樣品采集后置于液氮中速凍，最后統(tǒng)一轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、TRIzol、RNA酶抑制劑、pMD19-T載體、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP、DNA Marker、膠回收試劑盒、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶、SYBR Green Master Mix等分子生物學(xué)試劑均購(gòu)自TaKaRa公司；SMARTerTMRACE cDNA kit、Advantage 2×PCR kit均購(gòu)自Clontech公司；胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司；Fugene?HD轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Promega公司；DAPI購(gòu)自碧云天公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 質(zhì)粒菌株 pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-EGFP表達(dá)質(zhì)粒由信陽(yáng)師范學(xué)院動(dòng)物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏，感受態(tài)細(xì)胞JM109購(gòu)自Promega公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

以人TAK1基因的cDNA(NM_145333.2 )為信息探針，利用NCBI網(wǎng)站Blast(BlastN)工具搜索獲取豬的TAK1基因EST 序列，然后用DNAStar軟件構(gòu)建豬EST-重疊群 ，再以此序列為基礎(chǔ)利用Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)分離豬TAK1基因cDNA全長(zhǎng)的5′RACE、3′RACE、CDS區(qū)以及時(shí)空表達(dá)分析的引物(表1)，引物在南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 豬TAK1全長(zhǎng)cDNA序列克隆和qRT-PCR分析的引物信息Tab.1 The PCR Primers used for full-length cDNA cloning and qRT-PCR analysis of porcine TAK1

注：下劃線表示添加的限制性酶切位點(diǎn)。

Note：The underlines are the sites of restriction enzyme digestion.

1.3 豬TAK1基因的cDNA克隆

1.3.1 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄將凍存的樣品在液氮中迅速研磨成粉末，取100 mg組織樣用TRIzol法提取總RNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。以提取的總RNA為模板，用PrimeScript TR Master Mix試劑盒以O(shè)ligo(dT18)為引物合成cDNA第一鏈，同時(shí)利用SMARTerTMRACE cDNA kit構(gòu)建豬肌肉組織RACE cDNA文庫(kù)，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行 。

1.3.2 豬TAK1基因cDNA的克隆及測(cè)序 利用設(shè)計(jì)的豬TAK1基因CDS區(qū)引物，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL： cDNA 2 μL，rTaqDNA聚合酶0.1 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+) 2 μL，dNTP Mix(2 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 12.7 μL。PCR程序設(shè)置：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，36 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。以構(gòu)建得到的RACE cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行豬TAK1基因5′RACE、3′RACE擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 17.3 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mix(10 mmol/L) 0.5 μL，50×Advantage 2 ploymerase Mix 0.5 μL，RACE Ready cDNA 1.2 μL，通用引物UPM(10×)2.5 μL，3′RACE/5′RACE 引物0.5 μL。RACE PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個(gè)循環(huán)。PCR目的產(chǎn)物回收后純化、克隆至pDM18-T載體，然后由測(cè)序公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)完成序列測(cè)定。

1.3.3 豬TAK1基因的序列分析 分析方法參照文獻(xiàn)[16]。首先，利用DNAStar軟件將克隆得到的豬TAK1基因CDS區(qū)序列及完整5′和3′序列拼接成全長(zhǎng)cDNA；然后利用GENSCAN 在線軟件(http：//genes.mit.edu/GENSCAN. htmL)分析豬TAK1基因的開放閱讀框(ORF)和poly A位點(diǎn)，并利用EBI 的ProtParam 在線軟件(http：//www.expasy.org/cgi-bin/protparam)和NCBI在線工具CDD(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)對(duì)編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；最后，應(yīng)用DNAMAN軟件，對(duì)豬、牛、綿羊、人、恒河猴、大鼠、小鼠、兔、斑馬魚、爪蟾、火雞11個(gè)物種TAK1基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析，并通過(guò)分子進(jìn)化樹軟件MEGA 7.0，基于NJ(Neighbour-joining)法構(gòu)建11個(gè)物種的TAK1蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap設(shè)置為1 000)。

1.4 熒光定量PCR分析

根據(jù)豬TAK1基因的CDS序列設(shè)計(jì)特異引物(表1)，以GAPDH為內(nèi)參，采用SYBR Green法對(duì)豬TAK1基因在豬骨骼肌發(fā)育不同時(shí)期以及不同組織的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板0.5 μL ，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，ddH2O 8.3 μL。反應(yīng)在ABI 7300熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線，65 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃。2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量， SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，One-way ANOVA法分析豬骨骼肌不同發(fā)育時(shí)期間的差異表達(dá)，t-test法分析不同豬品種間及不同組織間的差異表達(dá)。

1.5 真核表達(dá)載體pcDNA3.1-EGFP-TAK1 的構(gòu)建、鑒定及轉(zhuǎn)染

用分別添加EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的上、下游引物擴(kuò)增完整的豬TAK1基因CDS序列，然后將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切后回收目的片段，并添加真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-EGFP與T4連接酶，于16 ℃連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞(JM109)，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序結(jié)果正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取pcDNA3.1(+)-EGFP-TAK1質(zhì)粒。

將C2C12細(xì)胞接種至6孔板中，每孔加入2 mL無(wú)抗培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到30%～40%時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；向滅菌的1.5 mL離心管中加入200 μL Opti-MEM，再向其中加入6 μL Fugene?HD轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫孵育5 min；然后向混合液中加入1 μg pcDNA3.1(+)-EGFP-TAK1質(zhì)粒，輕輕混勻，室溫孵育15 min；孵育結(jié)束后，將復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，收集細(xì)胞并提取RNA。同時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)4% 多聚甲醛固定后，用細(xì)胞通透液室溫通透細(xì)胞，再用DAPI染色，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP-TAK1在C2C12細(xì)胞中亞細(xì)胞定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬TAK1基因的克隆及序列分析

以梅山豬骨骼肌5′RACE cDNA文庫(kù)和3′RACE cDNA文庫(kù)為模板，利用豬TAK1基因5′RACE特異引物和3′RACE特異引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，結(jié)果顯示，TAK1基因5′RACE有5條大于1 200 bp的條帶，3′RACE有1條較清晰的800 bp左右的條帶，將這6條帶純化回收后經(jīng)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，5′RACE中1 249 bp的帶(圖1箭頭標(biāo)示)為目的序列； 3′RACE的條帶大小為812 bp(圖1箭頭標(biāo)示)，也與目的序列一致，并包含17 bp完整的poly A尾巴序列。以梅山豬骨骼肌cDNA為模板，用TAK1基因CDS區(qū)特異引物擴(kuò)增該基因CDS全長(zhǎng)，獲得了1 740 bp的CDS序列。然后利用序列重疊將1 249 bp 的5′RACE序列、812 bp的3′RACE序列以及1 740 bp的CDS序列拼接得到豬TAK1基因2 163 bp的cDNA全長(zhǎng)，該序列編碼579個(gè)氨基酸，起始密碼子“ATG”位于9-11 bp處，有脊椎動(dòng)物典型的“ANNATG” 起始序列，終止密碼子位于1 746-1 748 bp處，5′端非翻譯區(qū)較短只有8 bp，3′端非翻譯區(qū)有415 bp，末尾處有17 bp的 poly A尾巴序列，但目前未發(fā)現(xiàn)典型的“AATAAA”加尾信號(hào)(圖2)。將該序列提交到GenBank，登錄號(hào)為KU504629。

圖1 豬TAK1基因克隆的瓊脂糖凝膠電泳圖 Fig.1 The electrophoresis of porcine TAK1 cDNA clone

利用EBI 的ProtParam軟件和NCBI在線工具CDD對(duì)豬TAK1編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，豬TAK1蛋白是由579個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為64.1 ku，理論等電點(diǎn)為6.02，屬于酸性蛋白；脂肪系數(shù)為71.12，總親水性平均系數(shù)(Grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.540，屬于親水蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)為62.15，該蛋白不穩(wěn)定。對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白有人類的TAK1結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，具有催化絲氨酸/酪氨酸磷酸化的STKc_TAK1結(jié)構(gòu)域，另外還有多個(gè)保守的ATP結(jié)合位點(diǎn)、A-loop結(jié)構(gòu)域、TAB1(TGF-beta activated kinase 1)結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。

利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已有的TAK1的氨基酸序列：NP_766276.1(小鼠，Musmusculus)、NP_001075064.1(牛，Bostaurus)、XP_004011316.1(綿羊，Ovisaries)、XP_010705919.1(火雞，Meleagrisgallopavo)、XP_006238028.1(大鼠，Rattusnorvegicus)、NP_003179.1(人，Homosapiens)、AFI35255.1 (恒河猴，Macacamulatta)、AAC14008.1(爪蟾，Xenopuslaevis)、AAT07829.1(斑馬魚，Daniorerio)、XP_002714631.1(兔，Oryctolaguscuniculus)，構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果表明，豬TAK1的氨基酸序列同其他物種具有很高的同源性，與人、恒河猴、綿羊、牛、小鼠、大鼠、兔、火雞、爪蟾、斑馬魚TAK1的氨基酸序列同源性分別為98.8%，98.8%，98.8%，98.6%，98.4%，98.3%，97.9%，91.5%，90.0%，71.0%，表明TAK1蛋白在不同物種的進(jìn)化中非常保守?；诎被嵝蛄械倪z傳進(jìn)化樹分析可知，豬TAK1與人、恒河猴、綿羊、牛等哺乳動(dòng)物聚為一類，具有更近的親緣關(guān)系，與爪蟾、斑馬魚等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

方框?yàn)槠鹗济艽a子和終止密碼子；小寫字母為核酸序列，大寫字母為對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。 Framed letters indicate the initiation codon and termination codon; The lowercase and uppercase are nucleotide sequence and protein sequence respectively.

圖3 TAK1蛋白保守序列的生物功能預(yù)測(cè) Fig.3 Prediction of biological function of TAK1 conserved sequence

圖4 基于氨基酸序列的TAK1基因系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.4 The phylogenetic tree of TAK1 gene drawn with its amino acid sequence

2.2 豬TAK1基因的時(shí)空表達(dá)分析

利用qRT-PCR方法分析TAK1基因在大白豬(瘦肉型商品豬種)和梅山豬(脂肪型本地豬種)不同發(fā)育時(shí)期背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)情況(圖5)，結(jié)果表明，TAK1基因在2個(gè)品種豬背最長(zhǎng)肌發(fā)育過(guò)程中具有類似的表達(dá)趨勢(shì)，在胚胎期 65 d呈現(xiàn)最高的表達(dá)水平，隨著生長(zhǎng)發(fā)育而呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，并于出生后60 d表達(dá)量開始急劇減少，出生后180 d表達(dá)量達(dá)到最低；而同一時(shí)期品種間比較發(fā)現(xiàn)，TAK1基因在梅山豬各發(fā)育時(shí)期中的相對(duì)表達(dá)量均低于大白豬，其中出生后90 d，2個(gè)品種間差異不顯著，其他時(shí)期差異均達(dá)到顯著水平或極顯著水平。TAK1基因在不同品種豬不同發(fā)育時(shí)期的背最長(zhǎng)肌中的差異表達(dá)，表明在豬肌肉發(fā)育過(guò)程中，TAK1基因發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

65.胚胎期65 d；3～180.分別表示出生后3，21，69，90，120，180 d；圖中含有相異小寫字母和大寫分別代表大白豬與梅山豬品種間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P< 0.01)。

65.The 65 days of prenatal development stage; 3-180.The 3, 21, 69, 90, 120, 180 days of postnatal stage; Bar with Different lowercase letter and uppercase letters indicate significantly Different between Large White and Mashan pigs at the level of 0.05 and 0.01 respectively.

圖5TAK1基因在豬背最長(zhǎng)肌不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)
Fig.5ExpressionofporcineTAK1geneindifferentperiodoflongissimusdorsimuscledevelopment

此外，本研究還探究了TAK1基因在出生后120 d大白豬的大腦、心、肝、脂肪、背最長(zhǎng)肌、胃、小腸、肺、脾、腎、胰腺、卵巢、輸卵管、皮14個(gè)不同組織中的表達(dá)情況(圖6)，結(jié)果表明，TAK1基因在豬中具有組織特異性，其中脾臟中表達(dá)量最高，大腦和卵巢中表達(dá)量較高，心、肺、腎、脂肪、胃、小腸、輸卵管、皮中表達(dá)量次之，肝和背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量相對(duì)較低，胰腺中表達(dá)量最低。柱狀圖上方不同字母表示不同組織間差異顯著(P<0.05)。

柱形圖上方不同字母表示不同組織間差異顯著(P < 0.05)。 Different letters donate significant differences between Different tissues (P < 0.05).

2.3 豬TAK1 基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位分析

為確定相關(guān)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中發(fā)揮功能的具體位置，構(gòu)建綠色熒光蛋白(GFP)與豬TAK1基因的融合表達(dá)載體，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至小鼠C2C12成肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h時(shí)效率最高，在激光共聚焦電子顯微鏡下觀察TAK1和GFP融合蛋白的分布情況(圖7)，結(jié)果顯示，融合蛋白僅在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)(綠色熒光)，說(shuō)明TAK1基因所編碼的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)中。

淺色為融合蛋白，深色為DAPI；Bar = 25 μm。 Light colour is the fusion protein, deep colour is DAPI; Bar = 25 μm.

3 結(jié)論與討論

TAK1 作為MEK激酶家族的主要成員，在JNK、p38 和 NF-κB 等新報(bào)信號(hào)傳導(dǎo)通路上游發(fā)揮作用，可能對(duì)細(xì)胞的自我更新、分化、存活起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前，有關(guān)TAK1功能的研究主要是以人、小鼠、果蠅等為模型[2，16-17]，在豬中鮮有報(bào)道。本研究成功地克隆得到豬TAK1基因的cDNA全長(zhǎng)2 163 bp，編碼579個(gè)氨基酸，與人、小鼠等物種TAK1基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)，氨基酸同源性在98%以上，說(shuō)明該蛋白質(zhì)比較保守。經(jīng)NCBI在線工具CDD對(duì)豬TAK1 蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其在N端含有典型催化絲氨酸/酪氨酸磷酸化的STKc_TAK1結(jié)構(gòu)域，而在該結(jié)構(gòu)域內(nèi)部還有TAB1(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子活化蛋白激酶1 結(jié)合蛋白)結(jié)合位點(diǎn)和A-loop結(jié)構(gòu)域。先前的研究表明，TAB1可以與TAK1持續(xù)地結(jié)合并激活其激酶活性，進(jìn)而引起TAK1在A-loop上的絲氨酸自身磷酸化從而徹底激活TAK1的活性[18-20]，表明TAB1結(jié)合位點(diǎn)和A-loop結(jié)構(gòu)域是TAK1的激活所必需的。這些保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域揭示了TAK1 在不同物種間行使的功能可能是一樣的。

本研究通過(guò)qRT-PCR技術(shù)探討了TAK1 基因在出生后120 d(成年期)大白豬14個(gè)不同組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TAK1 基因在所檢測(cè)的組織中均表達(dá)，但表達(dá)量存在顯著差異，其在脾臟中表達(dá)量最高，在大腦和卵巢中也有較高表達(dá)，胰腺中表達(dá)量最低。豬TAK1的這種表達(dá)模式與人類、小鼠、比目魚等物種的類似[21-23]，即在脾臟、胸腺等免疫器官中高表達(dá)。先前的許多研究已證實(shí)TAK1 基因在免疫、炎癥反應(yīng)及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要功能[9-12]。TAK1 基因?qū)τ诓溉閯?dòng)物細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種外界刺激至關(guān)重要，它可通過(guò)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，從而對(duì)來(lái)自微生物病原體或細(xì)胞因子的刺激做出應(yīng)答與調(diào)節(jié)[1，6]。TAK1 基因還能通過(guò)TGF-β信號(hào)通路在大腦發(fā)育過(guò)程中調(diào)控軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元遷移[24-25]。TAK1 基因在不同組織中的差異表達(dá)，可能與其在不同組織中的功能不同密切相關(guān)。

TAK1 基因在豬背最長(zhǎng)肌不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)結(jié)果表明，TAK1 基因在胚胎期65 d時(shí)特異的高表達(dá)，而出生后隨著生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)量下調(diào)，與在小鼠骨骼肌中的表達(dá)情況是一致的[12]。胚胎期65 d是豬骨骼肌次級(jí)纖維形成的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，該階段骨骼肌主要圍繞初級(jí)肌纖維周圍分化發(fā)育，次級(jí)肌管快速增加，胚胎期90 d之后肌纖維數(shù)目基本固定[26-27]。TAK1作為p38 MAPK信號(hào)通路的上游激活因子在成肌分化過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，并且是IGF-1發(fā)揮肌源性作用所必需，沉默TAK1表達(dá)會(huì)抑制分化相關(guān)的p38 MAPK和Akt的激酶活性，進(jìn)而抑制成肌分化[12-13]，TAK1基因在豬胚胎期骨骼肌中高表達(dá)說(shuō)明TAK1在豬肌形成特別是次級(jí)肌纖維形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。此外，TAK1可以在肌衛(wèi)星細(xì)胞中激活體JNK和 NF-κB信號(hào)通路，對(duì)維持肌肉衛(wèi)星干細(xì)胞池和肌肉再生也起著重要作用[2]，TAK1 基因在豬出生后表達(dá)量下調(diào)，可能與豬肌衛(wèi)星細(xì)胞在出生后急劇減少有關(guān)。而不同時(shí)期(特別是在胚胎期和出生后3 d)2個(gè)豬品種間相比，TAK1 基因在大白豬中的表達(dá)量均高于梅山豬，這可能與TAK1參與調(diào)控成肌分化以及次級(jí)纖維形成有關(guān)，體型較大的大白豬次級(jí)肌纖維數(shù)目顯著高于小型豬[28-29]，而豬的產(chǎn)肉量主要由肌纖維數(shù)目和大小決定，因此，大白豬與梅山豬相比有較強(qiáng)的肌肉沉積能力。TAK1 基因可能與這2個(gè)豬品種肌肉沉積能力的差異有關(guān)，但具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入探討。

亞細(xì)胞定位是確定蛋白質(zhì)功能的重要方法，本研究將構(gòu)建pcDNA3.1(+)-EGFP-TAK1表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞后成功表達(dá)EGFP-TAK1融合蛋白，激光共聚焦結(jié)果顯示，TAK1蛋 白 主 要 在 細(xì) 胞 核 外 表 達(dá)，該 結(jié) 果 與TAK1 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮其在多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑充當(dāng)激活因子的功能相一致。

本研究通過(guò)同源克隆和RACE 技術(shù)克隆得到了豬TAK1基因的全長(zhǎng)，并且分析了該基因的序列特征、時(shí)空表達(dá)及亞細(xì)胞定位情況，為進(jìn)一步研究其在動(dòng)物肌肉發(fā)育中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。