張夢瑤，楊 峰，劉開東，劉積鳳，賀建寧，柳 楠

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山東 青島 266109； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018； 3.青島畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266121)

敖漢細(xì)毛羊論羊毛的品質(zhì)比其他羊毛的品質(zhì)要高，是我國最具有代表性的細(xì)毛羊之一[1]。羊的被毛是由毛囊來產(chǎn)生，同時羊毛產(chǎn)量是由毛囊的組織結(jié)構(gòu)和性狀共同決定[2]。探究毛囊發(fā)育的規(guī)律和結(jié)構(gòu)特征，是研究毛囊生長發(fā)育調(diào)控機制的基礎(chǔ)，同時對羊毛性狀發(fā)育有重要影響[3]。目前，許多毛囊的研究主要集中在出生后以及成年綿羊身上，Stenn等[4]的研究就是針對成年綿羊毛囊的周期性生長變化過程。近年來，柳楠等[5]在分子水平上對敖漢細(xì)毛羊羊毛性狀的形成機理進行了研究。前人對毛囊的研究大多集中在分子水平上，因此，在細(xì)胞水平上探究毛囊生長發(fā)育調(diào)控的基因已顯得非常重要。

在DKK家族中，有一種分泌型的糖蛋白含有2個半胱氨酸[6]，且保守區(qū)域Cys1和Cys2并肩相存，此蛋白則是DKK1(Dickkopf-1)。它是Wnt信號通路的拮抗物[7]，通過抑制LRP5/6與Wnt形成一個三元復(fù)雜的跨膜蛋白來對抗Wnt信號，此復(fù)雜跨膜蛋白促進LRP5/6的內(nèi)化，從而抑制 Wnt 信號通路的激活[8]。先前的研究顯示[9]，毛囊間的距離是由DKK和Wnt信號通過反應(yīng)-擴散機制(Reaction-dufusion)決定的。DKK1則表達于毛囊發(fā)育的起始期，與Wnt信號通過反應(yīng)擴散機制決定毛囊之間的距離[10]。DKK1在生長期中期表達較弱，在生長期末期開始表達增強[11]，DKK1的表達受Wnts的直接控制[12-13]。有轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果表明，DKK1的啟動子受經(jīng)典WNT信號通路調(diào)控[14-15]。BMPs也是一種具有分泌功能的蛋白，能使軟骨和骨形態(tài)發(fā)生變化，其成員有很多種[16-17]。有研究表明，BMPs在毛囊發(fā)育過程中起到了重要作用，主要表現(xiàn)出對毛囊的抑制作用[18]，而它的受體BMPRs類主要表現(xiàn)出對毛囊存在著促進的作用[19-20]。 毛青青等[14]通過對小鼠的研究結(jié)果表明，BMP4基因是影響皮膚和毛囊發(fā)育的一個關(guān)鍵性基因。BMP4也是TGF-β超家族中的一員[21]，在TGF通路中扮演著重要的角色，BMP4的表達不僅對BMP通路中受體進行了控制，也對TGF通路中一些控制生殖發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化的基因進行了控制[10-15]?，F(xiàn)單個基因作用的研究已經(jīng)明確，且與家畜皮膚毛囊關(guān)系的研究主要集中在分子水平上，DKK和BMP在毛囊的發(fā)育過程中均起到了抑制毛囊發(fā)育的作用，若二者同時的表達，表現(xiàn)出相互促進還是拮抗作用有待進一步研究。

本試驗通過在細(xì)胞水平上研究兩基因的相互作用關(guān)系，對其做了補充同時可為此基因在個體層次上的研究提供堅實的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取健康40日齡的胎羊(由青島畜牧所奧特種羊場提供)。

1.2 主要試劑及儀器

SoSo試劑盒購自青島擎科，pcDNA3.1質(zhì)粒、NdeⅠ、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、DPBS等均購自青島賽尚科貿(mào)有限公司。Leica DMIRB 型倒置顯微鏡購于上海始恒儀器設(shè)備有限公司，Redbio CFX ConnectTM熒光定量PCR系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計 選取綿羊DKK1基因組(GenBank登錄號為XM-012102454.2)CDS區(qū) 和BMP4基因組序(GenBank登錄號為XM-012180609.2)CDS區(qū)，在CDS區(qū)外側(cè)通過Primer 5.0設(shè)計引物在DKK1基因上下游引物5′端加入同源臂，完成后的引物序列為：

上游引物：5′-TTTAAACTTAAGCTTGGTACCATG

ACGGCTCTGGGCACAGCG-3′；

下游引物：5′-TGGATCCGAGCTCGGTACCTTAGTG

TCTCTGACAGGTGTGAAGCCTG-3′。

在BMP4基因上下游引物5′端加入同源臂，完成后的引物序列為：

上游引物：5′-TTTAAACTTAAGCTTGGTACCAT

GATTCCTGGTAACCGAATGCTG-3′；

下游引物5′-TGGATCCGAGCTCGGTACCTCAG

CGGCACCCACATCCCTCCACTA-3′。

并進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增體系：cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Gree Mix 21 μL。

1.3.2DKK1、BMP4基因與pcDNA3.1同源重組 pcDNA3.1質(zhì)粒分別進行KpnⅠ、NdeⅠ單酶切，酶切體系：KpnⅠ1 μL；pcDNA3.1 5 μL；Buffer 5 μL ddH2O 39 μL；NdeⅠ1 μL；pcDNA3.1 5 μL；Buffer 5 μL ddH2O 39 μL；37 ℃ 2 h，對DKK1、BMP4基因及切開的pcDNA3.1質(zhì)粒進行膠回收。SoSo連接體系：BMP4、DKK1基因各1 μL，pcDNA3.1 1 μL ，SoSo 5 μL，ddH2O 3 μL，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，搖菌，將陽性組送往公司測序，并通過ONZA質(zhì)粒提取試劑盒獲得陽性質(zhì)粒。

1.4 敖漢細(xì)毛羊成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

取40日齡胎羊用75%酒精和PBS清洗，去除頭部和四肢，剩余軀干將其剪成1.0～2.0 mm3大小的組織塊，滴加37.0 ℃預(yù)熱的胎牛血清，放置到CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5.0% CO2)培養(yǎng)4 h，4 h后加入培養(yǎng)液。24 h換新鮮培養(yǎng)液，每天定時在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達到約95%時進行傳代。用0.25%的胰蛋白酶37.0 ℃消化，當(dāng)細(xì)胞變圓，加入DMEM終止消化。按1∶3傳代，待細(xì)胞密度達95%后，再次傳代培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

傳代后細(xì)胞密度達到95%用Lipofectamine2000進行瞬時轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染組和單轉(zhuǎn)染組孵育體系：脂質(zhì)體20 μL，培養(yǎng)液(不含雙抗)480 μL，混勻，靜置5 min。轉(zhuǎn)染體系：共轉(zhuǎn)染組DKK1、BMP4質(zhì)粒各20 μL，培養(yǎng)液(不含雙抗)460 μL；單轉(zhuǎn)染組DKK1質(zhì)粒40 μL，培養(yǎng)液460 μL；BMP4質(zhì)粒40 μL，培養(yǎng)液460 μL，具體步驟參照Lipofectamine 2000說明書。

1.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的定量檢測

挑取轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達90%時用TRIzol(Roche)試劑裂解細(xì)胞提取RNA。后使用核酸測定儀測定濃度和純度，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)綿羊DKK1、BMP4基因的全序列和GAPDH的全序列，使用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計DKK1、BMP4和GAPDH基因的引物序列如表1所示。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

實時熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)。試驗組和對照組樣品各進行3次重復(fù)，采用Ct(2-ΔΔCt)值法計算BMP4 、DKK1相對于內(nèi)參基因GAPDH的表達量。利用SPSS 19.0軟件中t檢驗對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.01作為差異極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 Western Blotting檢測DKK1、BMP4基因蛋白表達

樣品分對照組和試驗組。每個樣品3個平行。首先用細(xì)胞裂解液RIPA提取細(xì)胞中的蛋白，β-actin作為內(nèi)參。對提取的蛋白進行轉(zhuǎn)膜，用5 % BSA對蛋白封閉2 h；將一抗用1∶2 000比例進行稀釋，孵育PDF膜4 ℃ 12 h；山羊抗兔的二抗用以1∶2 000的比例稀釋，孵育PDF膜1.5 h；曝光液1∶1的比例配置，在暗室中進行曝光拍照。所得結(jié)果用ImageJ 軟件分析灰度值，灰度值的比值用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 DKK1、BMP4基因PCR擴增

以cDNA為模板，應(yīng)用設(shè)計的上下游引物進行PCR 擴增DKK1、BMP4基因目的片段。2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，引物擴增的條帶明亮無雜帶，DKK1產(chǎn)物大小為753 bp，BMP4產(chǎn)物大小為1 230 bp，與已知的目的基因大小相同，可用于后期的試驗。

M.2000 Marker；1.BMP4基因擴增條帶(1 230 bp)； 2.DKK1基因擴增條帶(753 bp)。 M.2000 Marker；1.BMP4 product(1 230 bp)； 2.DKK1 Product(753 bp).

2.2 pcDNA3.1載體單酶切及純化

對pcDNA3.1載體分別進行KpnⅠ、NdeⅠ單酶切，單酶切之后的載體進行膠回收用于后續(xù)的連接，結(jié)果如圖2所示，1，4是對pcDNA3.1載體的KpnⅠ單酶切，2，3是對pcDNA3.1載體的NdeⅠ單酶切，pcDNA3.1載體5 428 bp，與圖中條帶所吻合。因此，1-4可進行目的基因與表達載體pcDNA3.1的連接。

M.10000 Marker；1，4.pcDNA3.1載體KpnⅠ單酶切； 2，3.pcDNA3.1載體NdeⅠ單酶切。 M.10000 Marker；1，4.pcDNA3.1 plasmid KpnⅠ digested； 2，3.pcDNA3.1 plasmid NdeⅠ digested.

2.3 表達載體pcDNA3.1與目的片段重組及鑒定

用SoSo試劑盒將目的片段和pcDNA3.1載體進行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，對菌液進行PCR電泳鑒定，如圖3所示，在753 bp處有單一明亮的條帶，為DKK1基因；在1 230 bp處有單一明亮的條帶，為BMP4基因。說明目的基因與pcDNA3.1載體連接成功。同時對重組的質(zhì)粒利用質(zhì)粒提取試劑盒進行提取，如圖4所示，1-2為pcDNA3.1-DKK1重組質(zhì)粒，大小為6 181 bp，3-4為pcDNA3.1-BMP4重組質(zhì)粒，大小為6 658 bp。

M.2000 Marker；1-2.BMP4菌液PCR； 3-4.DKK1菌液PCR。 M.2000 Marker；1-2.BMP4 microbial PCR； 3-4.DKK1 microbial PCR.

M.10000 Marker；1-2.pcDNA3.1-DKK1重組質(zhì)粒； 3-4.pcDNA3.1-BMP4重組質(zhì)粒。 M.10000 Marker；1-2.pcDNA3.1-DKK1 recombinant plasmid； 3-4.pcDNA3.1-BMP4 recombinant plasmid.

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

用電子倒置顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞的生長情況，記錄成纖維細(xì)胞原、傳代培養(yǎng)的形狀變化。細(xì)胞生長24 h可觀察到細(xì)胞慢慢貼壁，有圓形的，有梭形的，還有一些游離組織。培養(yǎng)至第5天，培養(yǎng)皿皿底基本長滿細(xì)胞，即可進行傳代培養(yǎng)。經(jīng)傳代后細(xì)胞開始生長速度稍慢，12 h后增殖迅速加快，細(xì)胞形態(tài)上仍然呈現(xiàn)梭形。如圖5，6所示。

圖5 成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)(×100) Fig.5 Primary culture of fibroblasts(×100)

圖6 成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)(×100)Fig.6 Fibroblasts were subcultured(×100)

2.5 TA克隆測序比對

利用同源重組技術(shù)將DKK1、BMP4基因各自連接到pcDNA3.1表達載體中，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，搖菌。將菌液送至生工公司進行測序，測序后的序列用Blast進行比對，比對結(jié)果如圖7所示，在重組的過程中堿基沒有發(fā)生突變，與已知目的基因完全一致。

圖7 DKK1(A)、BMP4(B)TA克隆測序比對Fig.7 DKK1(A)，BMP4(B) clone sequencing comparison

2.6 實時熒光qRT-PCR檢測DKK1、BMP4基因表達

以cDNA為模板，對目的基因DKK1、BMP4和內(nèi)參基因GAPDH進行PCR 擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖8所示，引物擴增的條帶明亮無雜帶，GAPDH產(chǎn)物大小為128 bp ，DKK1產(chǎn)物大小為126 bp，BMP4產(chǎn)物大小為112 bp，與已知的內(nèi)參、目的基因大小相同，可用于實時熒光定量PCR試驗。

由圖 9可知，目的基因BMP4、DKK1和內(nèi)參基因GAPDH的擴增曲線、熔解曲線清晰整齊，并且目的基因和內(nèi)參基因的溶解曲線上沒有雜亂的峰，表明在實時熒光定量PCR過程中引物特異性很高沒有產(chǎn)生二聚體，因此，設(shè)計的引物可以用來進行定量分析。采用SPSS軟件對單、共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞mRNA表達量進行分析，BMP4基因的表達量基本無變化，DKK1基因的表達量明顯下降，共轉(zhuǎn)染與單轉(zhuǎn)染之間差異極顯著(P<0.01)(圖10)。

2.7 DKK1、BMP4基因蛋白表達的檢測

以成纖維細(xì)胞的蛋白為模板進行Western Blot，試驗結(jié)果顯示，在DKK1、BMP4基因單、共轉(zhuǎn)染中比較，DKK1的條帶明顯暗于單轉(zhuǎn)染的對照組，BMP4的條帶與單轉(zhuǎn)染對照組比較亮度基本相同(圖11)。經(jīng)ImageJ和SPSS分析得共轉(zhuǎn)染DKK1基因蛋白的表達極顯著低于單轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，共轉(zhuǎn)染的BMP4基因蛋白的表達量與單轉(zhuǎn)染組相同(圖12)。

A：M.500 Marker；1-2.內(nèi)參基因GAPDH擴增條帶。B：M.500 Marker；1-2.目的基因DKK1擴增條帶；3-4.目的基因BMP4擴增條帶。

A：M.500 Marker；1-2. Internal reference geneGAPDHamplification products.B：M.500 Marker；1-2，3-4 .Objective geneDKK1，BMP4 amplification products.

圖8內(nèi)參基因GAPDH(A)目的基因DKK1、BMP4擴增產(chǎn)物(B)
Fig.8InternalreferencegeneGAPDHandobjectivegeneDKK1，BMP4amplificationproducts

圖9 BMP4、DKK1和GAPDH 熔解曲線峰值圖(A)和擴增曲線圖(B)Fig.9 BMP4，DKK1 and GAPDH peak curve of dissolution curve (A)and amplification curve(B)

相同小寫字母表示差異不顯著；不同大寫字母表示差異極顯著。圖12同。 The same small letters mean not significant;Different capital letters mean extremely significant difference.The same as Fig.12.

圖11 DKK1、BMP4基因表達蛋白條帶 Fig.11 DKK1，BMP4 gene expression protein product

圖12 DKK1、BMP4基因蛋白相對表達量Fig.12 DKK1，BMP4 gene protein relative expression

3 討論與結(jié)論

BMP4基因是BMPs中的一員，已有研究表明，BMP4基因是影響毛囊發(fā)育的一個關(guān)鍵性基因。有研究結(jié)果表明[14]，以小鼠為模型研究BMP4在胚胎期毛囊形成和出生后毛囊周期循環(huán)過程的毛球間質(zhì)細(xì)胞和表皮里廣泛表達[22]，說明BMP4基因在毛囊的生長過程中能正常表達。同時將Noggin轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，嚴(yán)重地抑制了BMP4基因的表達，毛發(fā)生長異常且形態(tài)發(fā)生改變。在皮膚組織中利用基因敲除技術(shù)特異性敲除BMP4的受體BMPR1A基因的小鼠，毛發(fā)的外部形態(tài)發(fā)生了改變進一步證明了BMP4在毛囊發(fā)育過程中的作用[23]。研究證實，Wnt信號通路對于毛囊生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。DKK1是Wnt信號通路的抑制劑，DKK1起作用是通過與Wnt信號通路的受體結(jié)合來抑制Wnt發(fā)揮作用[24]。而在毛囊生長期，過表達DKK1能抑制經(jīng)典Wnt信號通路，從而促進毛囊外根鞘細(xì)胞的凋亡而使毛囊提早進入退化期。之前的研究對DKK1 基因和BMP4基因分別進行單基因的功能鑒定，結(jié)果鑒定出DKK1基因?qū)γ业陌l(fā)育起到了一定的抑制作用，當(dāng)其表達量超過一定強度時會抑制羊毛生長發(fā)育，導(dǎo)致某些區(qū)域羊毛生長不旺盛。而BMP4基因?qū)γ业陌l(fā)育也起到了一定的抑制作用，它的過表達也不利于羊毛的生長。當(dāng)二者進行共轉(zhuǎn)染時，通過基因mRNA的表達量和蛋白表達量的變化來判斷二者的相互作用，DKK1的表達量相對于單轉(zhuǎn)染明顯下降，而BMP4 的表達量相比于單轉(zhuǎn)染沒有發(fā)生明顯的變化，因而簡單地得出，BMP4 基因?qū)KK1基因起到了一定的抑制作用，二者同時過表達有利于羊毛的生長，以后的羊毛生產(chǎn)過程中可以篩選抑制性基因的過表達。

40日齡的胎羊培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生長能力強，活力高，容易獲得，結(jié)果穩(wěn)定性更高，試驗周期短。因此，本研究選擇成纖維細(xì)胞作為研究工具，選取子二代來轉(zhuǎn)染，避免了原代細(xì)胞中純度不高，減少了試驗的誤差。本試驗創(chuàng)新點主要是利用同源重組技術(shù)構(gòu)建表達載體，相比TA克隆技術(shù)更為簡便快速，不會引入多余的堿基，目的基因可以更準(zhǔn)確地定位在靶位點上。目前，也尚未發(fā)現(xiàn)對DKK1、BMP4基因二者之間作用的研究，特別是在細(xì)胞水平上的研究報道，本試驗可對此起到補充作用。本研究通過同源重組技術(shù)，成功地構(gòu)建了DKK1、BMP4基因表達載體，將載體轉(zhuǎn)染到成纖維細(xì)胞中，采用實時熒光定量PCR、Western Blot來檢測基因的表達，從而進一步研究基因的作用。經(jīng)過單轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，DKK1、BMP4基因的mRNA和蛋白表達量明顯的升高，這從細(xì)胞層次上研究了與羊毛有關(guān)的基因。經(jīng)過共轉(zhuǎn)染二者，BMP4基因本身具有抑制毛囊發(fā)育的作用，BMP4基因過表達的同時也將影響相關(guān)信號通路中DKK1基因的表達。這為以后的個體水平上的基因研究提供了堅實的基礎(chǔ)，極大可能地解決了綿羊羊毛生長的問題。

本研究利用同源重組對DKK1、BMP4基因真核表達載體的構(gòu)建、載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后進行實時熒光定量PCR、Western Blot等，結(jié)果成功地構(gòu)建了pcDNA3.1-DKK1/BMP4表達載體并轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長良好，并且共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞DKK1基因的表達量明顯降低，共轉(zhuǎn)染組的表達量極顯著地高于單轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，BMP4基因共轉(zhuǎn)染的表達量等同于單轉(zhuǎn)染組，因此，BMP4基因抑制了DKK1基因的表達，DKK1基因?qū)MP4基因的表達幾乎沒影響，為進一步在個體水平上研究其功能奠定了基礎(chǔ)。