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        利用同源重組技術(shù)構(gòu)建DKK1、BMP4 真核表達載體及共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞表達的研究

        2018-11-01 08:30:48張夢瑤劉開東劉積鳳賀建寧
        華北農(nóng)學(xué)報 2018年5期
        關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染毛囊條帶

        張夢瑤,楊 峰,劉開東,劉積鳳,賀建寧,柳 楠

        (1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院,山東 青島 266109; 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018; 3.青島畜牧獸醫(yī)研究所,山東 青島 266121)

        敖漢細(xì)毛羊論羊毛的品質(zhì)比其他羊毛的品質(zhì)要高,是我國最具有代表性的細(xì)毛羊之一[1]。羊的被毛是由毛囊來產(chǎn)生,同時羊毛產(chǎn)量是由毛囊的組織結(jié)構(gòu)和性狀共同決定[2]。探究毛囊發(fā)育的規(guī)律和結(jié)構(gòu)特征,是研究毛囊生長發(fā)育調(diào)控機制的基礎(chǔ),同時對羊毛性狀發(fā)育有重要影響[3]。目前,許多毛囊的研究主要集中在出生后以及成年綿羊身上,Stenn等[4]的研究就是針對成年綿羊毛囊的周期性生長變化過程。近年來,柳楠等[5]在分子水平上對敖漢細(xì)毛羊羊毛性狀的形成機理進行了研究。前人對毛囊的研究大多集中在分子水平上,因此,在細(xì)胞水平上探究毛囊生長發(fā)育調(diào)控的基因已顯得非常重要。

        在DKK家族中,有一種分泌型的糖蛋白含有2個半胱氨酸[6],且保守區(qū)域Cys1和Cys2并肩相存,此蛋白則是DKK1(Dickkopf-1)。它是Wnt信號通路的拮抗物[7],通過抑制LRP5/6與Wnt形成一個三元復(fù)雜的跨膜蛋白來對抗Wnt信號,此復(fù)雜跨膜蛋白促進LRP5/6的內(nèi)化,從而抑制 Wnt 信號通路的激活[8]。先前的研究顯示[9],毛囊間的距離是由DKK和Wnt信號通過反應(yīng)-擴散機制(Reaction-dufusion)決定的。DKK1則表達于毛囊發(fā)育的起始期,與Wnt信號通過反應(yīng)擴散機制決定毛囊之間的距離[10]。DKK1在生長期中期表達較弱,在生長期末期開始表達增強[11],DKK1的表達受Wnts的直接控制[12-13]。有轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果表明,DKK1的啟動子受經(jīng)典WNT信號通路調(diào)控[14-15]。BMPs也是一種具有分泌功能的蛋白,能使軟骨和骨形態(tài)發(fā)生變化,其成員有很多種[16-17]。有研究表明,BMPs在毛囊發(fā)育過程中起到了重要作用,主要表現(xiàn)出對毛囊的抑制作用[18],而它的受體BMPRs類主要表現(xiàn)出對毛囊存在著促進的作用[19-20]。 毛青青等[14]通過對小鼠的研究結(jié)果表明,BMP4基因是影響皮膚和毛囊發(fā)育的一個關(guān)鍵性基因。BMP4也是TGF-β超家族中的一員[21],在TGF通路中扮演著重要的角色,BMP4的表達不僅對BMP通路中受體進行了控制,也對TGF通路中一些控制生殖發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化的基因進行了控制[10-15]?,F(xiàn)單個基因作用的研究已經(jīng)明確,且與家畜皮膚毛囊關(guān)系的研究主要集中在分子水平上,DKK和BMP在毛囊的發(fā)育過程中均起到了抑制毛囊發(fā)育的作用,若二者同時的表達,表現(xiàn)出相互促進還是拮抗作用有待進一步研究。

        本試驗通過在細(xì)胞水平上研究兩基因的相互作用關(guān)系,對其做了補充同時可為此基因在個體層次上的研究提供堅實的基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 試驗材料

        選取健康40日齡的胎羊(由青島畜牧所奧特種羊場提供)。

        1.2 主要試劑及儀器

        SoSo試劑盒購自青島擎科,pcDNA3.1質(zhì)粒、NdeⅠ、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、DPBS等均購自青島賽尚科貿(mào)有限公司。Leica DMIRB 型倒置顯微鏡購于上海始恒儀器設(shè)備有限公司,Redbio CFX ConnectTM熒光定量PCR系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

        1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

        1.3.1 引物設(shè)計 選取綿羊DKK1基因組(GenBank登錄號為XM-012102454.2)CDS區(qū) 和BMP4基因組序(GenBank登錄號為XM-012180609.2)CDS區(qū),在CDS區(qū)外側(cè)通過Primer 5.0設(shè)計引物在DKK1基因上下游引物5′端加入同源臂,完成后的引物序列為:

        上游引物:5′-TTTAAACTTAAGCTTGGTACCATG

        ACGGCTCTGGGCACAGCG-3′;

        下游引物:5′-TGGATCCGAGCTCGGTACCTTAGTG

        TCTCTGACAGGTGTGAAGCCTG-3′。

        在BMP4基因上下游引物5′端加入同源臂,完成后的引物序列為:

        上游引物:5′-TTTAAACTTAAGCTTGGTACCAT

        GATTCCTGGTAACCGAATGCTG-3′;

        下游引物5′-TGGATCCGAGCTCGGTACCTCAG

        CGGCACCCACATCCCTCCACTA-3′。

        并進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增體系:cDNA 2 μL,上下游引物各1 μL,Gree Mix 21 μL。

        1.3.2DKK1、BMP4基因與pcDNA3.1同源重組 pcDNA3.1質(zhì)粒分別進行KpnⅠ、NdeⅠ單酶切,酶切體系:KpnⅠ1 μL;pcDNA3.1 5 μL;Buffer 5 μL ddH2O 39 μL;NdeⅠ1 μL;pcDNA3.1 5 μL;Buffer 5 μL ddH2O 39 μL;37 ℃ 2 h,對DKK1、BMP4基因及切開的pcDNA3.1質(zhì)粒進行膠回收。SoSo連接體系:BMP4、DKK1基因各1 μL,pcDNA3.1 1 μL ,SoSo 5 μL,ddH2O 3 μL,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài),搖菌,將陽性組送往公司測序,并通過ONZA質(zhì)粒提取試劑盒獲得陽性質(zhì)粒。

        1.4 敖漢細(xì)毛羊成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

        取40日齡胎羊用75%酒精和PBS清洗,去除頭部和四肢,剩余軀干將其剪成1.0~2.0 mm3大小的組織塊,滴加37.0 ℃預(yù)熱的胎牛血清,放置到CO2培養(yǎng)箱(37 ℃,5.0% CO2)培養(yǎng)4 h,4 h后加入培養(yǎng)液。24 h換新鮮培養(yǎng)液,每天定時在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),當(dāng)細(xì)胞密度達到約95%時進行傳代。用0.25%的胰蛋白酶37.0 ℃消化,當(dāng)細(xì)胞變圓,加入DMEM終止消化。按1∶3傳代,待細(xì)胞密度達95%后,再次傳代培養(yǎng)。

        1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

        傳代后細(xì)胞密度達到95%用Lipofectamine2000進行瞬時轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染組和單轉(zhuǎn)染組孵育體系:脂質(zhì)體20 μL,培養(yǎng)液(不含雙抗)480 μL,混勻,靜置5 min。轉(zhuǎn)染體系:共轉(zhuǎn)染組DKK1、BMP4質(zhì)粒各20 μL,培養(yǎng)液(不含雙抗)460 μL;單轉(zhuǎn)染組DKK1質(zhì)粒40 μL,培養(yǎng)液460 μL;BMP4質(zhì)粒40 μL,培養(yǎng)液460 μL,具體步驟參照Lipofectamine 2000說明書。

        1.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的定量檢測

        挑取轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進行培養(yǎng),待細(xì)胞密度達90%時用TRIzol(Roche)試劑裂解細(xì)胞提取RNA。后使用核酸測定儀測定濃度和純度,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)綿羊DKK1、BMP4基因的全序列和GAPDH的全序列,使用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計DKK1、BMP4和GAPDH基因的引物序列如表1所示。

        表1 引物信息Tab.1 Primers information

        實時熒光定量PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性7 min;95 ℃變性40 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,共45個循環(huán)。試驗組和對照組樣品各進行3次重復(fù),采用Ct(2-ΔΔCt)值法計算BMP4 、DKK1相對于內(nèi)參基因GAPDH的表達量。利用SPSS 19.0軟件中t檢驗對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,以P<0.01作為差異極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

        1.7 Western Blotting檢測DKK1、BMP4基因蛋白表達

        樣品分對照組和試驗組。每個樣品3個平行。首先用細(xì)胞裂解液RIPA提取細(xì)胞中的蛋白,β-actin作為內(nèi)參。對提取的蛋白進行轉(zhuǎn)膜,用5 % BSA對蛋白封閉2 h;將一抗用1∶2 000比例進行稀釋,孵育PDF膜4 ℃ 12 h;山羊抗兔的二抗用以1∶2 000的比例稀釋,孵育PDF膜1.5 h;曝光液1∶1的比例配置,在暗室中進行曝光拍照。所得結(jié)果用ImageJ 軟件分析灰度值,灰度值的比值用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行t檢驗。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 DKK1、BMP4基因PCR擴增

        以cDNA為模板,應(yīng)用設(shè)計的上下游引物進行PCR 擴增DKK1、BMP4基因目的片段。2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖1所示,結(jié)果表明,引物擴增的條帶明亮無雜帶,DKK1產(chǎn)物大小為753 bp,BMP4產(chǎn)物大小為1 230 bp,與已知的目的基因大小相同,可用于后期的試驗。

        M.2000 Marker;1.BMP4基因擴增條帶(1 230 bp); 2.DKK1基因擴增條帶(753 bp)。 M.2000 Marker;1.BMP4 product(1 230 bp); 2.DKK1 Product(753 bp).

        2.2 pcDNA3.1載體單酶切及純化

        對pcDNA3.1載體分別進行KpnⅠ、NdeⅠ單酶切,單酶切之后的載體進行膠回收用于后續(xù)的連接,結(jié)果如圖2所示,1,4是對pcDNA3.1載體的KpnⅠ單酶切,2,3是對pcDNA3.1載體的NdeⅠ單酶切,pcDNA3.1載體5 428 bp,與圖中條帶所吻合。因此,1-4可進行目的基因與表達載體pcDNA3.1的連接。

        M.10000 Marker;1,4.pcDNA3.1載體KpnⅠ單酶切; 2,3.pcDNA3.1載體NdeⅠ單酶切。 M.10000 Marker;1,4.pcDNA3.1 plasmid KpnⅠ digested; 2,3.pcDNA3.1 plasmid NdeⅠ digested.

        2.3 表達載體pcDNA3.1與目的片段重組及鑒定

        用SoSo試劑盒將目的片段和pcDNA3.1載體進行連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中,37 ℃過夜振蕩培養(yǎng),對菌液進行PCR電泳鑒定,如圖3所示,在753 bp處有單一明亮的條帶,為DKK1基因;在1 230 bp處有單一明亮的條帶,為BMP4基因。說明目的基因與pcDNA3.1載體連接成功。同時對重組的質(zhì)粒利用質(zhì)粒提取試劑盒進行提取,如圖4所示,1-2為pcDNA3.1-DKK1重組質(zhì)粒,大小為6 181 bp,3-4為pcDNA3.1-BMP4重組質(zhì)粒,大小為6 658 bp。

        M.2000 Marker;1-2.BMP4菌液PCR; 3-4.DKK1菌液PCR。 M.2000 Marker;1-2.BMP4 microbial PCR; 3-4.DKK1 microbial PCR.

        M.10000 Marker;1-2.pcDNA3.1-DKK1重組質(zhì)粒; 3-4.pcDNA3.1-BMP4重組質(zhì)粒。 M.10000 Marker;1-2.pcDNA3.1-DKK1 recombinant plasmid; 3-4.pcDNA3.1-BMP4 recombinant plasmid.

        2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

        用電子倒置顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞的生長情況,記錄成纖維細(xì)胞原、傳代培養(yǎng)的形狀變化。細(xì)胞生長24 h可觀察到細(xì)胞慢慢貼壁,有圓形的,有梭形的,還有一些游離組織。培養(yǎng)至第5天,培養(yǎng)皿皿底基本長滿細(xì)胞,即可進行傳代培養(yǎng)。經(jīng)傳代后細(xì)胞開始生長速度稍慢,12 h后增殖迅速加快,細(xì)胞形態(tài)上仍然呈現(xiàn)梭形。如圖5,6所示。

        圖5 成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)(×100) Fig.5 Primary culture of fibroblasts(×100)

        圖6 成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)(×100)Fig.6 Fibroblasts were subcultured(×100)

        2.5 TA克隆測序比對

        利用同源重組技術(shù)將DKK1、BMP4基因各自連接到pcDNA3.1表達載體中,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中,搖菌。將菌液送至生工公司進行測序,測序后的序列用Blast進行比對,比對結(jié)果如圖7所示,在重組的過程中堿基沒有發(fā)生突變,與已知目的基因完全一致。

        圖7 DKK1(A)、BMP4(B)TA克隆測序比對Fig.7 DKK1(A),BMP4(B) clone sequencing comparison

        2.6 實時熒光qRT-PCR檢測DKK1、BMP4基因表達

        以cDNA為模板,對目的基因DKK1、BMP4和內(nèi)參基因GAPDH進行PCR 擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖8所示,引物擴增的條帶明亮無雜帶,GAPDH產(chǎn)物大小為128 bp ,DKK1產(chǎn)物大小為126 bp,BMP4產(chǎn)物大小為112 bp,與已知的內(nèi)參、目的基因大小相同,可用于實時熒光定量PCR試驗。

        由圖 9可知,目的基因BMP4、DKK1和內(nèi)參基因GAPDH的擴增曲線、熔解曲線清晰整齊,并且目的基因和內(nèi)參基因的溶解曲線上沒有雜亂的峰,表明在實時熒光定量PCR過程中引物特異性很高沒有產(chǎn)生二聚體,因此,設(shè)計的引物可以用來進行定量分析。采用SPSS軟件對單、共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞mRNA表達量進行分析,BMP4基因的表達量基本無變化,DKK1基因的表達量明顯下降,共轉(zhuǎn)染與單轉(zhuǎn)染之間差異極顯著(P<0.01)(圖10)。

        2.7 DKK1、BMP4基因蛋白表達的檢測

        以成纖維細(xì)胞的蛋白為模板進行Western Blot,試驗結(jié)果顯示,在DKK1、BMP4基因單、共轉(zhuǎn)染中比較,DKK1的條帶明顯暗于單轉(zhuǎn)染的對照組,BMP4的條帶與單轉(zhuǎn)染對照組比較亮度基本相同(圖11)。經(jīng)ImageJ和SPSS分析得共轉(zhuǎn)染DKK1基因蛋白的表達極顯著低于單轉(zhuǎn)染組(P<0.01),共轉(zhuǎn)染的BMP4基因蛋白的表達量與單轉(zhuǎn)染組相同(圖12)。

        A:M.500 Marker;1-2.內(nèi)參基因GAPDH擴增條帶。B:M.500 Marker;1-2.目的基因DKK1擴增條帶;3-4.目的基因BMP4擴增條帶。

        A:M.500 Marker;1-2. Internal reference geneGAPDHamplification products.B:M.500 Marker;1-2,3-4 .Objective geneDKK1,BMP4 amplification products.

        圖8內(nèi)參基因GAPDH(A)目的基因DKK1、BMP4擴增產(chǎn)物(B)
        Fig.8InternalreferencegeneGAPDHandobjectivegeneDKK1,BMP4amplificationproducts

        圖9 BMP4、DKK1和GAPDH 熔解曲線峰值圖(A)和擴增曲線圖(B)Fig.9 BMP4,DKK1 and GAPDH peak curve of dissolution curve (A)and amplification curve(B)

        相同小寫字母表示差異不顯著;不同大寫字母表示差異極顯著。圖12同。 The same small letters mean not significant;Different capital letters mean extremely significant difference.The same as Fig.12.

        圖11 DKK1、BMP4基因表達蛋白條帶 Fig.11 DKK1,BMP4 gene expression protein product

        圖12 DKK1、BMP4基因蛋白相對表達量Fig.12 DKK1,BMP4 gene protein relative expression

        3 討論與結(jié)論

        BMP4基因是BMPs中的一員,已有研究表明,BMP4基因是影響毛囊發(fā)育的一個關(guān)鍵性基因。有研究結(jié)果表明[14],以小鼠為模型研究BMP4在胚胎期毛囊形成和出生后毛囊周期循環(huán)過程的毛球間質(zhì)細(xì)胞和表皮里廣泛表達[22],說明BMP4基因在毛囊的生長過程中能正常表達。同時將Noggin轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi),嚴(yán)重地抑制了BMP4基因的表達,毛發(fā)生長異常且形態(tài)發(fā)生改變。在皮膚組織中利用基因敲除技術(shù)特異性敲除BMP4的受體BMPR1A基因的小鼠,毛發(fā)的外部形態(tài)發(fā)生了改變進一步證明了BMP4在毛囊發(fā)育過程中的作用[23]。研究證實,Wnt信號通路對于毛囊生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。DKK1是Wnt信號通路的抑制劑,DKK1起作用是通過與Wnt信號通路的受體結(jié)合來抑制Wnt發(fā)揮作用[24]。而在毛囊生長期,過表達DKK1能抑制經(jīng)典Wnt信號通路,從而促進毛囊外根鞘細(xì)胞的凋亡而使毛囊提早進入退化期。之前的研究對DKK1 基因和BMP4基因分別進行單基因的功能鑒定,結(jié)果鑒定出DKK1基因?qū)γ业陌l(fā)育起到了一定的抑制作用,當(dāng)其表達量超過一定強度時會抑制羊毛生長發(fā)育,導(dǎo)致某些區(qū)域羊毛生長不旺盛。而BMP4基因?qū)γ业陌l(fā)育也起到了一定的抑制作用,它的過表達也不利于羊毛的生長。當(dāng)二者進行共轉(zhuǎn)染時,通過基因mRNA的表達量和蛋白表達量的變化來判斷二者的相互作用,DKK1的表達量相對于單轉(zhuǎn)染明顯下降,而BMP4 的表達量相比于單轉(zhuǎn)染沒有發(fā)生明顯的變化,因而簡單地得出,BMP4 基因?qū)KK1基因起到了一定的抑制作用,二者同時過表達有利于羊毛的生長,以后的羊毛生產(chǎn)過程中可以篩選抑制性基因的過表達。

        40日齡的胎羊培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生長能力強,活力高,容易獲得,結(jié)果穩(wěn)定性更高,試驗周期短。因此,本研究選擇成纖維細(xì)胞作為研究工具,選取子二代來轉(zhuǎn)染,避免了原代細(xì)胞中純度不高,減少了試驗的誤差。本試驗創(chuàng)新點主要是利用同源重組技術(shù)構(gòu)建表達載體,相比TA克隆技術(shù)更為簡便快速,不會引入多余的堿基,目的基因可以更準(zhǔn)確地定位在靶位點上。目前,也尚未發(fā)現(xiàn)對DKK1、BMP4基因二者之間作用的研究,特別是在細(xì)胞水平上的研究報道,本試驗可對此起到補充作用。本研究通過同源重組技術(shù),成功地構(gòu)建了DKK1、BMP4基因表達載體,將載體轉(zhuǎn)染到成纖維細(xì)胞中,采用實時熒光定量PCR、Western Blot來檢測基因的表達,從而進一步研究基因的作用。經(jīng)過單轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,DKK1、BMP4基因的mRNA和蛋白表達量明顯的升高,這從細(xì)胞層次上研究了與羊毛有關(guān)的基因。經(jīng)過共轉(zhuǎn)染二者,BMP4基因本身具有抑制毛囊發(fā)育的作用,BMP4基因過表達的同時也將影響相關(guān)信號通路中DKK1基因的表達。這為以后的個體水平上的基因研究提供了堅實的基礎(chǔ),極大可能地解決了綿羊羊毛生長的問題。

        本研究利用同源重組對DKK1、BMP4基因真核表達載體的構(gòu)建、載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后進行實時熒光定量PCR、Western Blot等,結(jié)果成功地構(gòu)建了pcDNA3.1-DKK1/BMP4表達載體并轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長良好,并且共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞DKK1基因的表達量明顯降低,共轉(zhuǎn)染組的表達量極顯著地高于單轉(zhuǎn)染組(P<0.01),BMP4基因共轉(zhuǎn)染的表達量等同于單轉(zhuǎn)染組,因此,BMP4基因抑制了DKK1基因的表達,DKK1基因?qū)MP4基因的表達幾乎沒影響,為進一步在個體水平上研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

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