李林杰，常秋燕，馬 鵬，王悅縈， 馬曉霞，柏家林

(1.西北民族大學 甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030； 2.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)主要感染小反芻動物，山羊和綿羊易感，也稱羊瘟。野生的小反芻獸也具有易感性。其潛伏期是2～7 d。 動物感染后的主要癥狀是發(fā)熱、流涕、腹瀉、白細胞減少、呼吸困難、鼻及口腔黏膜潰爛，進而化膿并伴有惡臭氣味，懷孕動物會出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象[1-3]。其感染率、死亡率高，被世界動物衛(wèi)生組織(World Organisation for Animal Health，OIE)定為必須上報A類疫病。該病造成了巨大的經(jīng)濟損失，尤其對發(fā)展中國家的養(yǎng)羊業(yè)[4]。引起PPR的病原為小反芻獸疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)。其屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)，為單股負鏈RNA病毒，病毒粒子呈多形性。基因組全長15 948 bp，共有N-P(C、V)-M-F-H-L 6個基因，可編碼8種蛋白，6種結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白C、V。病毒復制時利用宿主內(nèi)膜形成囊膜蛋白H、F，并由基質(zhì)蛋白M將H、F與核蛋白相連。病毒入侵宿主細胞時，H與宿主表面受體結(jié)合后F改變構(gòu)型，發(fā)生膜融合，核酸注入細胞質(zhì)中。裝配完全的病毒顆粒通過出芽生殖釋放出來。另外，F(xiàn)和H蛋白，可誘導宿主的免疫保護，形成針對H蛋白的中和抗體，參與體液免疫[5-6]。高度的免疫壓力使 F蛋白易變異、保守性差[7]。

本研究結(jié)合同源模建及多種預測蛋白抗原表位的算法，預測PPRV H 蛋白3D結(jié)構(gòu)及表面特性，分析了PPRV H蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關系，旨在為研究和開發(fā)PPRVH基因工程疫苗提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種和毒株 試驗所用E.coli為JM109和Rosetta。所用原核表達載體為pET32a。 所用毒株為PPRV Nigeria75/1 株，由甘肅省動物細胞工程中心保存。

1.1.2 主要試劑、工具酶及引物 試驗所用T4DNA 連接酶、ExTaqDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶為BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，購自大連寶生物公司。RNA提取試劑盒購自北京博凌科為生物科技有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自蘭州美博生物有限公司。一抗為鼠抗His， 二抗為山羊抗鼠，均購自Sigma公司。His 標簽鎳離子蛋白純化柱購自GE 公司。參考PPRV Nigeria75/1毒株H基因序列設計一對PCR引物。上游引物F1：5′-TCCGCACAAAGGGAAAG-3′；下游引物F2：5′-TCAGACTGGATTACATGTTACC-3′。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因擴增 提取病毒基因總RNA，反轉(zhuǎn)錄，PCR 擴增。反應體系：ExTaqDNA 聚合酶0.25 μL，dNTP Mixture 4 μL，10 ×Ex Taq Buffer 5 μL，上、下游引物各 1 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 500 ng，補加 ddH2O 至 50 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min， 35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定所得產(chǎn)物后回收目的片段。

1.2.2 克隆目的基因、測序 回收后的H基因與 pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài) JM109細胞，涂布Amp 抗性的平板上(所用抗生素濃度為 1‰)，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取單克隆菌落，1∶100比例接種Amp 抗性的 LB 液體培養(yǎng)基中(所用抗生素濃度為 1‰)，37 ℃搖菌12 h，提取重組質(zhì)粒，BamHⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定，命名陽性質(zhì)粒pMD18-T-H，測序。

1.2.3 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒 原核表達載體 pET-32a、陽性重組質(zhì)粒 pMD18-T-H分別用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，回收片斷，16 ℃過夜連接，總體系(10 μL)：10×緩沖液 1 μL，T4DNA 連接酶0.5 μL，達到H2O 2.5 μL目的片段5 μL，載體1 μL,H2O 2.5 μL；轉(zhuǎn)化 JM109 ，雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒 pET-32a-H。

1.2.4 誘導表達目的蛋白、可溶性分析 轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET-32a-H，所用大腸桿菌為Rosetta，取轉(zhuǎn)化菌接種至 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min 過夜；1∶100 比例接種至3 mL新鮮 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min 振蕩培養(yǎng) 1.5 h 至 A600約為0.6時，取1 mL菌液作為對照，加入 IPTG 至終濃度為1 mmol/L，于 37 ℃誘導培養(yǎng) 6 h，取1 mL 菌液，離心收集菌體進行Lysis Buffer冰上裂解30 min，12 000 r/min離心 10 min，分離上清及沉淀。分別加入 2× SDS 上樣緩沖液沸水浴10 min，進行 10% SDS-PAGE 分析。對照組為重組菌誘導前的誘導表達產(chǎn)物及誘導前后pEG32a空質(zhì)粒。

1.2.5 鑒定表達產(chǎn)物 誘導表達的重組 H 蛋白進行 Western Blot 鑒定。一抗為鼠抗His 標簽(1∶3 000 稀釋)，二抗為山羊抗小鼠 IgG(1∶10 000 稀釋)。

1.2.6 純化目的蛋白 將誘導培養(yǎng)的 2 L 重組菌以8 000 r/min 離心 30 min，加入Lysis Buffer重懸菌體，超聲裂解至澄清后，收集上清，將其加入Ni柱中4 ℃孵育2 h。分別用含50，300，500 mmol/L咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液 ，加入 2 × SDS 上樣緩沖液沸水浴 10 min 后，進行Western Blot 分析。

1.3 搜索PDB數(shù)據(jù)庫及PPRV Nigeria75/1 H蛋白3D模型的模擬

利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast功能分析PPRV Nigeria75/1 H蛋白。并于ExPAEy 網(wǎng)站SWIAA-MODLE模塊尋找同源蛋白，在線建立蛋白3D模型。于NCBI數(shù)據(jù)庫Structure功能查找蛋白表面模型。

1.4 PPRV Nigeria75/1 H蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

利用DNAStar軟件提供的Protean模塊，采用chou-Fasman算法和Garnier-Robson算法綜合分析。

1.5 PPRV Nigeria75/1 H蛋白親水性預測

通過DNAStar軟件Protean模塊，采用Kyte-Poolittle預測。

1.6 PPRV Nigeria75/1 H蛋白可塑性預測[8]

通過DNAStar軟件Protean模塊，采用Karplus-Schultz預測。

1.7 PPRV Nigeria75/1H蛋白表面可及性預測

通過DNAStar軟件Protean模塊進行Emini預測。

1.8 PPRV Nigeria75/1 H蛋白抗原性指數(shù)預測

通過DNAStar軟件Protean模塊進行Jameson-Wolf預測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPRV Nigeria75/1 H 基因PCR產(chǎn)物鑒定

PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電壓150 V經(jīng)15 min，得到圖1所示結(jié)果，目的條帶大小1 830 bp，與預期相符。

M.DNA Marker DL2000；1.Nigeria75/1 株病毒H基因擴增產(chǎn)物。 M.DNA Marker DL2000；1.H gene product from Nigeria75/1 PPRV.

2.2 PPRV Nigeria75/1 H 基因克隆質(zhì)粒的鑒定及測序

質(zhì)粒 pMD18-T-H經(jīng)BamHⅠ、Hind Ⅲ雙酶切，產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到圖2所示結(jié)果，載體2 692 bp、目的基因1 830 bp ，大小符合預期；PCR所得H基因測序結(jié)果與 GenBank 上參考序列相似度為100%。

M.DNA Marker DL2000；1.質(zhì)粒pMD18-T-H雙酶切產(chǎn)物 (BamH Ⅰand Hind Ⅲ)。 M.DNA Marker DL2000；1.Products of plasmid pMD18-T-H digested by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ.

2.3 重組表達質(zhì)粒的鑒定

采用BamHⅠ、Hind Ⅲ對重組質(zhì)粒pET-32a-H 雙酶切，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可得圖3所示結(jié)果1 830 bp 的目的基因片段和5 900 bp 的載體片段，表明質(zhì)粒 pET-32a-H構(gòu)建正確。

M.DNA Maker DL10000；1.質(zhì)粒 pET-32a-H的雙酶切產(chǎn)物。 M.DNA Marker DL10000；1.The electrophoresis of plasmid pET-32a-H.

2.4 目的蛋白表達的鑒定

2.4.1 SDS-PAGE 分析 誘導表達重組菌，SDS-PAGE鑒定可得圖4結(jié)果：蛋白相對分子質(zhì)量約67 ku，對照均無目的蛋白帶。H蛋白以包涵體形式表達。

2.4.2 Western Blot 分析 通過抗 His 標簽抗體的識別，在67 ku處有目的蛋白條帶，結(jié)果與預測一致，且在上清中發(fā)現(xiàn)有少量可溶性表達(圖5)。表明 H 蛋白獲得正確表達，且具有良好的反應原性。

M.蛋白質(zhì) Marker；1.未誘導的空載體宿主菌；2.空載體宿主菌誘導 6 h；3.IPTG 誘導前重組表達菌；4.pET32a-HIPTG 誘導6 h后的重組表達菌。

M.Standard protein Marker；1.No induced vector host bacteria；2.Vector induced 6 h；3.pET32a-Hhost bacteria before IPTG induction； 4.pET32a-Hhost bacteria induced 6 h by IPTG.

圖4重組表達H蛋白的SDS-PAGE分析
Fig.4TheelectrophoresisofrecombinantHproteinanalyzedbySDS-PAGE

M.蛋白質(zhì)Marker；1.重組表達菌誘導6 h：2.重組表達菌誘導6 h上清；3.重組表達菌未誘導。

M.Standard protein Marker；1.pET32a-H host bacteria induced 6 h by IPTG； 2.Supernatant of pET32a-H host bacteria induced 6 h by IPTG；3.No induced pET32a-H host bacteria.

圖5重組表達H蛋白的WesternBlot分析
Fig.5WesternBlotofexpressedrecombinantHprotein

2.5 純化產(chǎn)物的鑒定

經(jīng)鎳柱純化后，Western Blot 分析，得到圖6結(jié)果：

在約67 ku處有單一蛋白條帶，表明純化效果良好。

M.蛋白質(zhì) Marker；1.純化的重組 PPRV H 蛋白。 M.Standard protein Marker；1.Purified recombinant H protein of PPRV.

2.6 PPRV Nigeria75/1 H 蛋白3D模型和蛋白表面

通過ExPAEy 網(wǎng)站SWIAA-MODLE功能在線建立同源蛋白3D模型(圖7-A)。所得模型序列一致性為39.26%，H蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、β折疊片及α螺旋組成。 β-折疊桶由β折疊片構(gòu)成，其外部有大量親水性側(cè)鏈集團，豐富的非極性氨基酸殘基側(cè)鏈聚集其內(nèi)部，疏水側(cè)鏈構(gòu)成一個封閉的疏水核心區(qū)域，使H 蛋白高級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲組成松散的結(jié)構(gòu)，更好接觸周圍極性環(huán)境，這些都使其更有可能成為抗原表位。并以同源蛋白為模型于NCBI數(shù)據(jù)庫Structure查詢相關蛋白表面模型(圖7-B)。

圖7 PPRV Nigeria75/1 H蛋白3D模型(A)和表面模型(B)Fig.7 The 3D model(A) and surface representation(B) of H protein from PPRV Nigeria 75/1

2.7 PPRV Nigeria75/1 H蛋白理化性質(zhì)

經(jīng)DNAStar軟件Protean模塊采用Chou-Fasman和Garnier-Robson算法綜合分析可知，PPRV Nigeria75/1 H蛋白等電點為4.95，α螺旋占29.6%，β折疊片占47.9%，轉(zhuǎn)角占12.5%，無規(guī)則卷曲占10.3%。

2.8 PPRV Nigeria75/1 H蛋白親水性

如圖8所示，PPRV Nigeria75/1 H蛋白親水性區(qū)域分散分布。親水性較高區(qū)域：1-12，13-27，29-34，69-80，81-92，123-150，151-156，168-178，193-197，210-216，232-247，278-287，311-317，356-366，370-379，386-395，399-408，440-450，487-496，501-511，520-527，530-535，543-553，556-566，571-580，589-598。

2.9 PPRV Nigeria75/1 H蛋白可塑性

PPRV Nigeria75/1 H可塑性較高區(qū)域(圖9)：5-8，14-16，18-21，26-31，32-35，66-78，80-85，86-95，107-114，119-124，126-131，142-148，168-177，183-188，190-196，224-228，236-248，281-286，301-307，308-319，328-335，340-348，353-356，359-364，368-381，387-393，395-408，421-424，445-450，457-463，473-476，484-494，500-513，518-522，532-536，544-551，560-565，588-602這些區(qū)段的柔韌性較高，發(fā)生扭曲、折疊的可能性較大。能形成豐富的二級結(jié)構(gòu)。

圖8 Nigeria75/1 H蛋白親水性分析Fig.8 Analysis of hydrophilicity of Nigeria75/1 H

2.10 PPRV Nigeria75/1 H蛋白表面可及性分析

應用DNAStar軟件，采用Emini方法分析H蛋白表面可及性結(jié)果如圖10所示。其表面可及性較高的區(qū)段為：2-8，11-21，26-32，73-75，83-90，125-135，142-147，170-177，192-195，211-214，235-245，281-285，303-305，312-318，341-346，360-363，370-379，388-391，443-445，446-449，457-461，474-476，486-489，503-505，519-523，530-535，544-552，588-591，592-595。

圖10 Nigeria75/1 H蛋白表面可及性分析Fig.10 Analysis of surface accessibility of Nigeria75/1 H

2.11 PPRV Nigeria75/1 H蛋白抗原表位預測

DNAStar軟件中Jameson-Wolf方案預測PPRV Nigeria75/1 H蛋白的抗原表位(圖11)。可預測PPRV Nigeria75/1 H蛋白抗原表位可能位于2-9，12-33，69-93，99-106，107-114，118-151，157-164，169-179，183-187，208-217，223-231，235-248，261-266，279-287，292-296，301-305，307-320，328-332，340-351，352-365，370-393，395-399，400-410，419-426，443-450，457-461，471-479，486-495，500-514，518-524，530-537，543-551，557-567，589-601。

圖11 Nigeria75/1 H蛋白抗原指數(shù)分析Fig.11 Analysis of the antigenic index of Nigeria75/1 H

2.12 PPRV Nigeria75/1 H蛋白B細胞表位綜合分析

綜合PPRV Nigeria75/1 H蛋白親水性、可塑性、表面可及性、抗原表位預測，以及二級結(jié)構(gòu)分析可知，在5-8，14-16，73-75，83-90，125-131，142-147，170-177，236-245，281-285，312-317，360-363，370-379，388-391，445-449，487-489，503-505，520-522，532-535，544-551，592-595這些區(qū)段中親水性、可塑性、表面可及性、抗原表位可能性均較高。且在這些區(qū)段均位于α折疊、β螺旋等二級結(jié)構(gòu)中。這使得所預測區(qū)段有更大幾率成為抗原表位。

3 討論

雖然用滅活苗免疫動物已可有效防治PPR，但是出于安全考慮，多年來人們致力于安全高效的小反芻獸疫亞單位疫苗[9]。PPRV H 蛋白誘發(fā)宿主體液免疫產(chǎn)生中和抗體，體外表達H蛋白及其抗原表位預測是為建立 PPRV 血清學檢測方法和制備亞單位疫苗及建立提供基礎[10]。

基于原核表達系統(tǒng)表達量高、簡便、方便純化等特點[11-15]。本試驗將PPRVH基因克隆于原核表達載體pEG-32a，在大腸桿菌中得到有效表達，主要以包涵體的形式存在，有部分可溶性表達。本研究中表達載體 pET-32a帶有His 標簽，對目的蛋白免疫原性及功能無影響。

目前，筆者主要通過多維核磁共振技術(shù)與X射線晶體學技術(shù)研究蛋白高級結(jié)構(gòu)。但現(xiàn)有技術(shù)遠不能追上探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的步伐。前者不能檢測分子量大于30 ku的蛋白質(zhì)，后者要求得到高標準的蛋白晶體。因此，理論模擬和結(jié)構(gòu)預測十分重要。

隨著生物信息學的發(fā)展，分析蛋白質(zhì)的軟件多種多樣。Hopp等[16]在20世紀80年代首次提出親水性參數(shù)對抗原表位預測的方法?，F(xiàn)被廣泛認可的方法主要是：二級結(jié)構(gòu)分析、親水性方案、可塑性方案、可及性方案、抗原性方案[17-18]。B細胞抗原表位的預測需要綜合上述5種方案，這是因為蛋白抗原氨基酸殘基可分為親水殘基和疏水殘基。親水殘基位于蛋白表面，與抗原位點緊密相關[19]。但疏水殘基與抗原表位的形成也有聯(lián)系。蛋白抗原構(gòu)象不是剛性不變的，其多肽骨架有一定的活動性[20]，活動性強的氨基酸殘基形成抗原表位的可能性較大。另外，在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊片位于蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域或蛋白質(zhì)內(nèi)部，化學鍵能較高、結(jié)構(gòu)規(guī)則；而β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，結(jié)構(gòu)突出，親水性強，處于蛋白質(zhì)的表面與抗原表位聯(lián)系緊密[21]。每種方法具有其優(yōu)勢的同時也存在缺陷。總之，B細胞表位需與B細胞抗原受體(bcr)和抗體結(jié)合，故要位于蛋白表面。約由4～6個氨基酸殘基或者糖基組成。具有柔韌性，構(gòu)象可發(fā)生變化。

綜上所述，本試驗成功表達了PPRV H蛋白，得到可溶性表達并純化。采用同源模建的方法來分析PPRV Nigeria75/1 H的高級結(jié)構(gòu)，提供PPRV Nigeria75/1 H蛋白的直觀分子模型，使H蛋白抗原表位預測更準確。結(jié)果可為建立針對PPRV的檢測方法和疫苗的研制提供依據(jù)。