劉 娜，劉青濤，李 銀，楊 婧，李祥瑞

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)屬于腺病毒科禽腺病毒屬禽腺病毒C種[1]。FAdV-C血清4型強(qiáng)毒株對(duì)雛雞的致病能力較強(qiáng)，可以垂直傳播和水平傳播。FAdV-4可致雞發(fā)生心包積水綜合征(Hydro pericardium syndrome，HPS)，該病在全世界分布廣泛，以心包囊中積聚透明或淡黃的液體為主要特征，發(fā)病雞常表現(xiàn)為食欲不振、貧血、羽毛粗亂、雞冠顏色變淺、嗜睡等，死亡率高達(dá)30%～90%。心包積液綜合征最早發(fā)生在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)，因此，也叫“安卡拉”病，隨后墨西哥、加拿大、日本、澳大利亞等國(guó)家相繼暴發(fā)了該病。1976年，我國(guó)臺(tái)灣報(bào)道了該病，隨后在遼寧、吉林、湖南、江蘇和河南等省也相繼發(fā)生該病[1-5]。目前，該病已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的傳染病。

FAdV是無(wú)囊膜的雙股DNA病毒，呈二十面體對(duì)稱(chēng)，由蛋白衣殼、核心蛋白和DNA組成。蛋白衣殼由五鄰體(Peton)、六鄰體(Hexon)和纖突(Fiber)3種主要的蛋白構(gòu)成。六鄰體含量最高，是病毒粒子中最大的蛋白，在各種腺病毒具有很高的同源性。六鄰體具有群、亞群、型特異抗原決定簇，是中和抗體的靶標(biāo)。因此，研究六鄰體蛋白的特性和功能，將為腺病毒引起疾病的診斷與防治提供重要的理論依據(jù)[3-8]。

本研究克隆并表達(dá)了FAdV-4的六鄰體蛋白，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組蛋白的大量表達(dá)，通過(guò)Western Blot對(duì)其反應(yīng)原性進(jìn)行鑒定，旨在為進(jìn)一步研究血清4型禽腺病毒和心包積水綜合征的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌BL21、質(zhì)粒pET-32a、FAdV-4肝毒，為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院禽病與生物制藥研究室保存；PMD18-T、Ex-Taq聚合酶、SolutionⅠ快速連接酶、大腸桿菌DH5α、DNA限制性核酸內(nèi)切酶、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；引物片段由南京金斯瑞生物科技公司合成；DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；HIS標(biāo)簽抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上序列號(hào)為NC-015323的腺病毒hexon基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)2段引物，引入酶切位點(diǎn)，上游引物(5′-TCGCGAATTCATGGCGGCCCTCACG-3′，引入EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基)、下游引物(5′-CTCTAAGCTTTTACACGGCGTTGCCTG-3′，引入Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基)，由金斯瑞生物科技公司合成。

1.3 hexon基因的擴(kuò)增與克隆

以FAdV-4肝毒提取的cDNA為模板，用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸2 min 30 s， 30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。PCR回收產(chǎn)物克隆至pMD-18T，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)，經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序分析獲得pMD-18T-hexon重組質(zhì)粒。

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將構(gòu)建的pMD-18T-hexon質(zhì)粒和pET-32a載體同時(shí)用EcoRⅠ和Hind Ⅲ 雙酶切。雙酶切后的hexon基因片段和pET-32a載體分別純化回收，經(jīng)SolutionⅠ快速連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)，經(jīng)氨芐抗性培養(yǎng)基篩選，挑取陽(yáng)性克隆振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，測(cè)序分析獲得pET-32a-hexon重組質(zhì)粒。

1.5 pET-32a-hexon融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定

將重組質(zhì)粒pET-32a-hexon轉(zhuǎn)化至E.coliBL21，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至OD600nm約為0.7 h，加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，采用不同誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，比較不同誘導(dǎo)條件的表達(dá)量，確定最佳誘導(dǎo)條件，同時(shí)設(shè)立pET-32a空載體的表達(dá)菌作為空白對(duì)照。最后將各時(shí)間段菌液收集離心，用PBS重懸沉淀，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，離心上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.6 pET-32a-hexon融合蛋白的可溶性分析

取菌液以1∶100的體積比擴(kuò)大培養(yǎng)，采用優(yōu)化的表達(dá)條件(37 ℃，3 h)進(jìn)行大量表達(dá)，表達(dá)完畢后收集菌體，用PBS重懸菌體沉淀并超聲破碎，破碎完畢后，4 ℃ 12 000 r/min，離心10 min，分別收集上清和沉淀，加入上樣緩沖明液，煮沸5 min，離心進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.7 pET-32a-hexon融合蛋白的Western Blot鑒定

融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，采用濕法將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜(NC膜)上，然后70 V電壓作用40 min； 5%BSA，4 ℃封閉過(guò)夜，經(jīng)PBST(0.05%Tween-20)洗滌后分別加入HIS標(biāo)簽抗體和hexon陽(yáng)性血清，37 ℃孵育1 h；再以PBST(0.05%Tween-20)洗滌，加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBST(0.05% Tween-20)洗滌，按照BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行顯色處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-hexon雙酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果

提取重組質(zhì)粒pET-32a-hexon，以EcoRⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到與預(yù)期大小相符的2個(gè)片段(圖1)，其中小片段為2 800 bp左右；南京金斯瑞生物公司測(cè)序結(jié)果顯示，插入片段hexon基因大小為2 814 bp，且序列正確，表明目的片段已連接到載體pET-32a上，并成功篩選出陽(yáng)性菌落。

M.DL2000 DNA Marker；1.EcoRⅠ+Hind Ⅲ雙酶切。 M.DL2000 DNA Marker；1. EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ double enzyme digestion.

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE分析結(jié)果

從SDS-PAGE分析結(jié)果可看出，重組菌BL21(pET-32a-hexon)在1 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，重組蛋白表達(dá)量先增加后減少，誘導(dǎo)時(shí)間為3 h時(shí)，蛋白表達(dá)量最高(圖2)。重組菌得到了表達(dá)，分子量大小在118 ku左右，與預(yù)期結(jié)果相符。

M.蛋白分子量Marker；1.pET-32a空載體；2-8.分別為誘導(dǎo) 后0，1，2，3，4，5，6 h表達(dá)的蛋白。 M.Protein Marker；1.Control of vector pET-32a；2-8.Induced pET-32a-hexon for 0，1，2，3，4，5，6 h.

2.3 重組蛋白在菌體中的表達(dá)形式

重組菌經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，37 ℃誘導(dǎo)3 h后，收集菌體，以PBS重懸，超聲裂解，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明，沉淀包涵體在118 ku處條帶單一且明顯，說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物主要是以包涵體形式存在于沉淀中(圖3)。

M.蛋白分子量Marker；1.pET-32a空載體；2.誘導(dǎo)后3 h表達(dá)的全菌蛋白；3.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)后的上清產(chǎn)物；4.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)后的包涵體產(chǎn)物。

M. Protein Marker；1.Control of vector pET-32a；2.Induced pET-32a-hexon for 3 h;3.The inclusion bodiesinduced by recombinant plasmid；4.The supernatant product induced by recombinant plasmid.

圖3pET-32a-hexon重組蛋白的可溶性分析SDS-PAGE檢測(cè)
Fig.3SolubleanalysisofpET-32a-hexonfusionproteinbySDS-PAGE

2.4 重組蛋白的Western Blot鑒定

誘導(dǎo)表達(dá)的重組pET-32a-hexon蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)至NC膜上，用HIS標(biāo)簽抗體蛋白、抗FAdV陽(yáng)性血清和抗FAdV陰性血清分別反應(yīng)，HIS標(biāo)簽抗體蛋白和抗FAdV陽(yáng)性血清在100～130 ku處出現(xiàn)特異性印跡條帶，抗FAdV陰性血清對(duì)照組無(wú)特異性條帶(圖4)。結(jié)果表明，重組蛋白pET-32a-hexon得到表達(dá)，且能夠被HIS標(biāo)簽抗體和抗FAdV陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。

M.蛋白分子量Marker；1.HIS標(biāo)簽抗體； 2.抗FAdV陽(yáng)性血清；3.抗FAdV陰性血清。 M. Protein Marker；1.HIS tag antibody； 2.Anti-FAdV positive serum； 3.Anti-FAdV negative serum.

3 討論與結(jié)論

由FAdV-4引起的肉雞心包積水綜合征是一種高度的傳染性疾病，主要發(fā)生于3～5周齡的肉雞，病死率高達(dá)80%，感染初期，臨床癥狀不明顯，很難進(jìn)行診斷，發(fā)病7 d后，死亡率突然上升，7～14 d后死亡率逐漸下降[9-14]，容易與禽類(lèi)其他疾病比如傳染性法氏囊病、新城疫、馬立克等病發(fā)生混合性感染[15-19]，已經(jīng)嚴(yán)重危害了養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，給包括我國(guó)在內(nèi)的世界養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

六鄰體(Hexon)蛋白是FAdV-4的主要抗原蛋白，含有大量的抗原決定簇，包括型特異性、型間特異性及中和表位等，與FAdV-4的致病性密切相關(guān)[1-3]。六鄰體蛋白是禽腺病毒被研究最廣泛的結(jié)構(gòu)蛋白之一，F(xiàn)AdV共有252個(gè)殼粒，其中六鄰體就有240個(gè)，占90% 以上。hexon基因編碼942個(gè)氨基酸，大小為109 ku，是主要的保護(hù)性抗原基因[20]，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，進(jìn)而中和病毒體[21-23]。

本試驗(yàn)采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)FAdV-4主要結(jié)構(gòu)蛋白六鄰體進(jìn)行表達(dá)，首先用PCR方法擴(kuò)增得到hexon基因的全序列，將其克隆至表達(dá)載體pET-32a上，在原核表達(dá)系統(tǒng)中在1 mmol/L IPTG，37 ℃條件下誘導(dǎo)3 h，表達(dá)量最高，表達(dá)出大小約118 ku的六鄰體重組蛋白。試驗(yàn)中所用的pET-32a為含氨芐抗性基因的原核高效表達(dá)載體，表達(dá)產(chǎn)物帶有HIS標(biāo)簽，方便其使用商品化鎳柱進(jìn)行純化。試驗(yàn)中選擇的表達(dá)菌株為BL21(DE3)，是一個(gè)廣泛用于表達(dá)外源蛋白的宿主菌，尤其適合重組融合蛋白的表達(dá)。該細(xì)菌缺少細(xì)胞膜外的蛋白酶ompT基因和其他多種蛋白酶，降低了重組產(chǎn)物表達(dá)后被細(xì)胞降解或剪切的概率[15，24-26]。本試驗(yàn)所表達(dá)的六鄰體重組蛋白，由SDS-PAGE結(jié)果分析可得，主要以包涵體形式存在于沉淀中，通過(guò)簡(jiǎn)單的變復(fù)性處理之后可得到高表達(dá)量、單一的目的蛋白。且通過(guò)Western Blot分析可得出，該重組融合蛋白可與HIS標(biāo)簽抗體蛋白和抗FAdV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性結(jié)合，在100 ku附近出現(xiàn)特異性印跡條帶，說(shuō)明表達(dá)的融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

本研究成功獲得了FAdV-4的主要結(jié)構(gòu)蛋白六鄰體(hexon)蛋白，為進(jìn)一步研究血清4型禽腺病毒提供了參考資料，也為今后制備抗六鄰體蛋白單克隆抗體、建立FAdV-4檢測(cè)方法、以及其引起的心包積水綜合征(HPS)的防治奠定了良好的基礎(chǔ)。