方劍玉，朱文豪，李海利，郭小參，白獻曉，王克領(lǐng)

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095； 3.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000)

先天性免疫作為機體抗感染免疫的第一道防線，在機體的抗病毒過程中發(fā)揮了重要的作用。機體通過細胞的模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)識別病毒的遺傳物質(zhì)病原體相關(guān)分子模式(Pattern associated molecular patterns，PAMPs)[1]，進一步激活NF-κB、IRF-3、IRF-7等誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，Ⅰ型干擾素通過識別細胞干擾素受體激活JAK/STAT信號通路，誘導(dǎo)數(shù)百種干擾素下游基因的表達，從而發(fā)揮抗病毒作用。其中，Viperin作為干擾素激活信號通路下游基因，具有廣譜的抗病毒作用。Viperin(Virus inhibitory protein，Endoplasmic reticulum-associated，Interferon-inducible)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的干擾素誘導(dǎo)的病毒抑制蛋白，被干擾素刺激基因RSAD2(Radical SAM domain-containing 2)所編碼[2]。該蛋白存在于機體多種組織細胞內(nèi)，病毒感染后可通過IFN依賴途徑和非依賴途徑誘導(dǎo)Viperin的大量表達。研究證明，該蛋白對多種病毒具有抵抗作用。其中，包括腫大細胞病毒[3]、皰疹病毒[4]、森林腦炎病毒[5]、人免疫缺陷病毒(HIV)[6]、狂犬病毒[7]、丙型肝炎病毒(HCV)[8]、西尼羅病毒(WNV)[9]、登革熱病毒(DENV)[10-11]、基孔肯雅病毒(CHIKV)[12]、甲型流感病毒(InfluenceAvirus)[13]、人巨細胞病毒(HCMV)[14-15]、呼吸道合胞病毒[16]、馬傳染性貧血病毒(EIAV)[17]等。該蛋白抑制了病毒的入胞、復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、出芽等各個過程。前期相關(guān)猴源Viperin在MARC-145細胞內(nèi)的抗病毒作用的研究[18]證明，其對PRRSV復(fù)制具有顯著的抗病毒作用。

為了進一步研究豬源Viperin蛋白在豬體內(nèi)對各種病毒的抵抗作用與相關(guān)抗病毒機制，并為開發(fā)新的抗病毒藥物提供思路。本試驗成功克隆了豬源Viperin基因，選取抗原性較好的蛋白區(qū)段進行表達，制備了鼠抗豬Viperin蛋白的多克隆抗體，旨在為后續(xù)試驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細胞與載體

MARC-145細胞(非洲綠猴腎細胞系)、PK-15細胞(豬腎傳代細胞系)、大腸桿菌DH5α、BL21、pET-28a+原核表達載體、表達猴源和豬源Viperin蛋白的真核表達載體pVAX-mVIP和pCI-sVIP，均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室制備保存。9日齡的BABL/c小鼠購自南通大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑

DMEM細胞培養(yǎng)液、新生小牛血清購自GibcoTMA公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司，RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，pEASY-Blunt Simple Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Prime STAR SH高保真預(yù)混酶、T4連接酶購自南京諾唯贊生物技術(shù)公司，羊抗鼠HRP-lgG二抗、IFIT標記的羊抗鼠熒光二抗購自上海碧云天生物公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Pierce公司，HindⅢ、XhoⅠ、DNA Marker、瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物等購自大連TaKaRa生物有限公司。其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 干擾素處理PK-15細胞

將PK-15細胞接種至24孔板，平均每孔5×105個細胞，次日待細胞融合度達到100%時，更換新鮮的含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液；每孔加入終濃度為3 000 U/mL的IFN-α-2b，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)12 h后用PBS緩沖液清洗3次；每孔加入100 μL預(yù)冷的裂解液，冰上裂解10 min后收集液體，提取細胞總RNA。

1.4 引物設(shè)計與合成

參考豬Viperin基因序列(GenBank登錄號分別為NM_213817)，根據(jù)基因閱讀框設(shè)計豬Viperin全基因組PCR擴增引物，引物序列如下。SV-Fwd：5′-ATGTGGACACTGGTACCTGTCACCTTTGCC-3′，SV-Red：5′-TCACCAGTCCAGCTTCAGGTCCGCCTTGCT-3′。將豬的Viperin基因采用DNAStar進行序列分析，選取免疫原性好的區(qū)段設(shè)計Viperin表達引物，引物序列而如下。SwineHind Ⅲ-Fwd：5′-CCGAAGCTTTGTGACAGCTTTGATGAGCAGGTCA-3′；SwineXhoⅠ-Red：5′-CCCCTCGAGTCACCAGTCCAGCTTCAGGTCCG-3′，將引物序列送上海Invitrogen公司合成。

1.5 豬Viperin基因的擴增

采用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，采用M-MLV(Promega)反轉(zhuǎn)錄酶，按說明書操作步驟進行。依次加入下游引物0.5 μL，5×M-MLV 反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，10 nmol/L dNTP 2 μL，加入RNA模板4 μL，70 ℃水浴10 min后，置于冰上放置2 min，加入M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 100 U，37 ℃水浴1 h，-70 ℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板，采用prime STAR SH高保真預(yù)混酶進行PCR擴增，具體反應(yīng)體系如下：prime STAR SH高保真酶12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板cDNA 2 μL，雙蒸水9.5 μL，總計25 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，共進行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察擴增結(jié)果。

1.6 豬Viperin基因的克隆與序列分析

將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切下目的條帶，并采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，具體步驟按照試劑盒說明書進行。將純化后的目的片段連接至pEASY-Blunt Simple 平末端克隆載體，連接體系為：pEASY-Blunt Simple載體預(yù)混酶1 μL，PCR片段4 μL，25 ℃作用20 min。

按照說明書要求轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素抗性Amp+(50 μg/mL)的LB平板。37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落接種3 mL Amp+液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，采用pEASY-Blunt Simple Cloning Kit通用鑒定引物進行PCR鑒定，將陽性克隆提取質(zhì)粒送公司進行測序后，采用DNAStar軟件進行同源性比較分析。

1.7 pET-sVIP表達載體的構(gòu)建

以pEASY-sVIP為模板，采用Prime STAR SH高保真預(yù)混酶進行豬Viperin基因片段的擴增，具體反應(yīng)體系如下：Prime STAR SH高保真酶12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，pEASY-sVIP2 μL，雙蒸水9.5 μL，總計25 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，共進行 35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察擴增結(jié)果。將PCR擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，并利用凝膠回收試劑盒進行純化回收后，連接pET-28a+大腸桿菌表達載體后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒后用HindⅢ、XhoⅠ進行酶切鑒定，將鑒定陽性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆菌提取質(zhì)粒，使用HindⅢ、XhoⅠ進行酶切鑒定，將鑒定結(jié)果正確的陽性質(zhì)粒命名為pET-sVIP。

1.8 豬Viperin主要抗原區(qū)段在大腸桿菌中的表達及抗體制備

1.8.1 豬Viperin蛋白在大腸桿菌中的表達 將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)表達菌，次日挑取單個菌落接種Amp+液體LB培養(yǎng)基，振蕩 12～16 h后，取40 μL菌液轉(zhuǎn)接Amp+液體LB培養(yǎng)基，待菌液濃度達到0.4～0.6 OD后，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并設(shè)置未加誘導(dǎo)劑的空白對照。于37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h，收集菌液于12 000 r/min離心1min，用無菌PBS洗滌沉淀3次，用500 μL PBS緩沖液重懸菌體，將菌體用超聲裂解儀進行破碎，破碎后菌液12 000 r/min離心1 min，分離上清與沉淀后，用200 μL PBS重懸沉淀，分別在上清和沉淀中按比例加入5×Loading Buffer，煮沸10 min，然后進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，檢測豬Viperin蛋白表達情況。

1.8.2 包涵體純化 將表達目的蛋白的陽性菌株轉(zhuǎn)接3 mL Amp+液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h，后用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。收集菌液并于5 000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS洗滌沉淀3次，后用10 mL PBS重懸沉淀，用超聲裂解儀進行破碎，收集沉淀，采用常規(guī)包涵體純化方法進行純化后取樣進行SDS-PAGE電泳分析。

1.9 豬Viperin多克隆抗體制備

將純化蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化后，背部皮下多點注射9日齡的BALB/c小鼠，首免每只小鼠50 μg；首免后14 d進行二次加強免疫，將純化蛋白與弗氏不完全佐劑充分混合乳化后，每只小鼠背部皮下多點注射50 μg。加強免疫后14 d將所有免疫小鼠摘除眼球采血，將血液置于37 ℃、1 h待血清充分析出后，5 000 r/min離心10 min，小心吸取上清進行免疫原性鑒定。

1.9.1 Western Blot檢測抗體特異性 將確定表達豬、猴源Viperin蛋白的真核表達質(zhì)粒pCI-sVIP、pVAX-mVIP轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，轉(zhuǎn)染后24 h，裂解細胞，進行SDS-PAGE電泳，采用Western Blot試驗檢測制備抗體特異性。

1.9.2 IFA檢測抗體特異性 將MARC-145細胞接種至24孔板，每孔5×105個細胞，待細胞融合度達到100%后，轉(zhuǎn)染表達Viperin蛋白的陽性質(zhì)粒pCI-sVIP。轉(zhuǎn)染36 h后細胞用PBS清洗3次。吸干孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL甲醇∶丙酮(1∶1)細胞固定液，固定后細胞用PBS洗滌3次。用PBS 1∶100稀釋制備陽性血清，每孔加入100 μL，37 ℃作用1 h后細胞用PBS洗滌3次。加入1∶200稀釋好的FITC標記的羊抗鼠二抗，37 ℃作用1h后用PBS洗滌3次。吸干孔內(nèi)液體，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，并通過熒光強度讀數(shù)儀讀取熒光強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬Viperin基因的擴增、克隆與序列分析

2.1.1 PCR擴增結(jié)果 從PK-15細胞中提取細胞總RNA后，經(jīng)RT-PCR擴增獲得豬Viperin基因，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察，在1 089 bp的位置獲得目的條帶，和預(yù)期大小一致(圖1)。

M.Marker 2000；1.sViperin 基因PCR擴增產(chǎn)物。 M.Marker 2000； 1.sViperin gene PCR product.

2.1.2 pEASY-SV重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定 將轉(zhuǎn)化的菌液，采用pEASY-Blunt Simple Cloning Kit通用鑒定引物對克隆載體pEASY-sVIP重組質(zhì)粒進行菌液PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察在預(yù)期位置出現(xiàn)目的條帶(圖2)。

2.1.3 豬Viperin基因的序列測定與分析 序列測定結(jié)果表明，豬Viperin序列與預(yù)測結(jié)果一致，核酸序列1 089 bp，豬核苷酸序列編碼362個氨基酸，采用Bioedit軟件于人、猴的Viperin蛋白氨基酸序列比較，其中猴和人的Viperin基因序列同源性為98.0%,而豬和猴Viperin的氨基酸同源性為81.2%(圖3)。

M.Marker 2000；1.sViperin 基因PCR鑒定結(jié)果。 M.Marker 2000； 1.Identification of insertion of sViperin gene.

圖3 人、猴、豬Viperin蛋白氨基酸序列比較分析Fig.3 Analysis and alignment of amino acid sequence of human，monkey，swine Viperin

2.2 豬Viperin氨基酸的抗原性分析

用DNAStar軟件對豬Viperin蛋白進行免疫原性和疏水性分析，選取較保守、抗原性較好、親水性較強的區(qū)段設(shè)計引物，用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行表達，制備針對豬Viperin的多克隆抗體。結(jié)果顯示，191-362位氨基酸抗原性較好。

2.3 豬Viperin大腸桿菌表達載體pET-sVIP的構(gòu)建

2.3.1 RT-PCR結(jié)果 以pEASY-SV為模板，經(jīng)PCR擴增獲得目的片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察條帶大小為548 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(圖4)。

M.Marker 5000； 1.Partial sViperin gene 541～1 089 bp PCR product. M.Marker 5000；1.sViperin 541-1 089 bp基因PCR產(chǎn)物。

2.3.2 原核表達載體pET-sVIP酶切鑒定將重組原核表達載體 pET-sVIP用HindⅢ、XhoⅠ雙酶切后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，目的片段與預(yù)期大小相符(圖5)。

M.Marker 5000； 1.pET-sVIP were degested. M.Marker 5000；1.pET-sVIP質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。

2.4 豬Viperin基因主要抗原區(qū)段在大腸桿菌中的表達

2.4.1Viperin主要抗原區(qū)的表達 將重組原核表達質(zhì)粒pET-sVIP，轉(zhuǎn)化BL21，于37 ℃用IPTG誘導(dǎo)表達后，進行10%SDS-PAGE電泳，在24.0 ku處可見目的條帶，且蛋白以包涵體的形式存在，與預(yù)期大小一致，而未誘導(dǎo)蛋白在相應(yīng)位置無目的蛋白表達(圖6)。

2.4.2 蛋白純化 將蛋白大量表達后，用包涵體純化的方法進行純化，純化后蛋白純度可達到90%以上(圖7)。

2.5 豬Viperin蛋白抗體的制備與鑒定

2.5.1 間接免疫熒光試驗(IFA) 9日齡的BALB/c小鼠用純化后大腸桿菌表達的豬sViperin蛋白免疫2次，每只小鼠50 μg，二次免疫后14 d摘除眼球采血，將血清析出，用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室保存的表達豬Viperin蛋白的真核表達載體pCI-sVIP轉(zhuǎn)染Marc-145細胞后，用制備的小鼠多克隆抗體血清進行IFA試驗，檢測該血清的特異性。試驗證明，轉(zhuǎn)染pCI-sVIP質(zhì)粒的細胞在熒光顯微鏡下可見特異性綠色熒光，而轉(zhuǎn)染pCI-neo空載體的細胞卻沒有可見熒光，證明本試驗制備抗體特異性較好(圖8)。

M.蛋白Marker；1. 沉淀中未誘導(dǎo)的pET-sVIP；2.上清中未誘導(dǎo)的pET-sVIP；3.沉淀中IPTG誘導(dǎo)的pET-sVIP；4.上清中IPTG誘導(dǎo)的pET-sVIP。

M.Protein Marker； 1.pET-sVIPin the pellet before inducement； 2.pET-sVIPin the supernatant before inducement； 3.Induced pET-sVIPin the pellet with IPTG； 4.Induced pET-sVIPin the supernatant with IPTG.

圖6重組豬Viperin蛋白BL21表達產(chǎn)物
Fig.6ExpressionofrecombinantswineViperininBL21

M.蛋白Marker；1.純化后的重組豬Viperin 蛋白。 M.Protein Marker； 1.Purified recombinant swine Viperin protein.

圖8 IFA分析鑒定重組豬Viperin蛋白多克隆抗體Fig.8 Identification of polyclonal antibody of recombinant swine Viperin protein by IFA assay

2.5.2 Western Blot試驗 用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室保存表達豬Viperin蛋白的真核表達載體pCI-sVIP轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，24 h后收集細胞，用制備的小鼠多克隆抗體血清進行Western Blot試驗，檢測該血清的特異性，在預(yù)期位置出現(xiàn)目的條帶，且條帶單一，而轉(zhuǎn)染pCI-neo空載體的細胞卻未見目的蛋白條帶，說明本試驗制備血清具有良好的特異性(圖9)。用表達猴Viperin蛋白的pVAX-mVIP轉(zhuǎn)染細胞后，用本試驗制備的多克隆抗體進行Western Blot試驗，結(jié)果證明，無特異性條帶出現(xiàn)。

圖9 Western Blot分析鑒定重組豬 Viperin蛋白多克隆抗體Fig.9 Identification of polyclonal antibody of recombinant swine Viperin protein by Western Blot assay

3 結(jié)論與討論

Viperin由361個氨基酸組成，在各個物種中顯示出高度保守性，其分子質(zhì)量大約42 ku。該蛋白通過其N端α雙親性螺旋定位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或脂滴等細胞器膜表面。Viperin通過影響細胞脂質(zhì)代謝、脂筏形成和細胞免疫反應(yīng)影響病毒在細胞內(nèi)復(fù)制，但對各種病毒的抗病毒作用沒有統(tǒng)一的模式，對不同病毒復(fù)制的調(diào)控機制也有所不同。筆者前期研究了猴源Viperin蛋白在MARC-145細胞中對PRRSV的抗病毒作用[18]，但是目前該蛋白在豬體內(nèi)的抗病毒活性仍不明確。為進一步研究豬源Viperin蛋白在豬體內(nèi)的抗病毒作用，本試驗成功克隆了豬源Viperin蛋白，核酸全長1 089 bp，共362個氨基酸。采用bioediet軟件分析，其中人和猴源Viperin的氨基酸同源性達到98.0%，而猴和豬源Vipeirn的氨基酸序列同源性僅為81.2%。但其主要的功能位點(N端α-helix、中間CxxxCxxC模體、和C端區(qū)域)卻相對較保守，故進而驗證不同物種來源的Viperin蛋白的抗病毒活性具有重要意義。

此外，本研究將sViperin蛋白序列用DNAStar進行比較和免疫原性分析，選取其親水性較好、免疫原性較強的191-362位氨基酸區(qū)域克隆進入大腸桿菌pET-28a+表達載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌溶源菌，用IPTG誘導(dǎo)后獲得表達。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有成本低，蛋白表達量高，操作簡便，耗時短，易于純化等優(yōu)點[19]。表達目的蛋白以包涵體的形式存在，大約24.0 ku。采用包涵體方式純化后，免疫小鼠，二次免疫后收集血清。將南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室構(gòu)建的表達豬源Viperin蛋白的PCI-sVIP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，并將制備血清1∶1 000稀釋后進行Western Blot試驗，血清能較好地與重組sViperin蛋白反應(yīng)。結(jié)果證明，該多克隆抗體具有較好的反應(yīng)原性，且特異性較好，說明選取的蛋白區(qū)段免疫原性良好[20]。在MARC-145細胞轉(zhuǎn)染PCI-sVIP陽性質(zhì)粒后，將制備的多克隆抗體1∶200稀釋后進行IFA試驗，在顯微鏡下觀察可見特異性綠色熒光。證明該抗體不但反應(yīng)原性較好，且其血清效價較高。本試驗進一步利用Western Bolt的方法驗證了制備的鼠anti-sViperin抗體與MARC-145內(nèi)源性mViperin的反應(yīng)原性，結(jié)果顯示，鼠抗豬源Viperin蛋白的抗體不能與猴源的Viperin進行反應(yīng)，說明了盡管豬源和猴源的Viperin 191-362同源性較高，但不同來源的蛋白抗原表位卻不完全相同，故抗體不能進行種間交叉反應(yīng)。鼠豬源Viperin抗體的成功制備為下面研究豬Viperin蛋白的抗病毒活性和免疫學(xué)功能打下基礎(chǔ)。