張學(xué)軍 亓發(fā)芝

[摘要]目的：探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白ATF4在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和機制。方法：運用熒光定量PCR技術(shù)分析對比黑色素瘤細胞系和黑色素細胞系內(nèi)ATF4表達的差異，運用CCK-8染色以及BrdU染色檢測細胞生長及增殖能力，運用Tranwell技術(shù)檢測細胞轉(zhuǎn)移能力，運用免疫印跡技術(shù)檢測細胞內(nèi)STAT3磷酸化水平。結(jié)果：ATF4 mRNA在黑色素瘤細胞中的表達水平顯著高于黑色素細胞，顯示腫瘤細胞中含有更高水平的ATF4 mRNA；在A375細胞中過表達ATF4后，細胞生長增殖速率提高，轉(zhuǎn)移能力增強，而降低內(nèi)源ATF4后，MM200細胞的增殖速度和轉(zhuǎn)移能力都出現(xiàn)明顯降低。同時，A375細胞內(nèi)ATF4含量的增加也引起了細胞內(nèi)STAT3磷酸化水平以及細胞內(nèi)IL-6表達的顯著升高。結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白ATF4在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用，細胞內(nèi)ATF4可能是參與調(diào)控了IL-6-STAT3信號通路，從而促進黑色素瘤細胞增殖和遷移。

[關(guān)鍵字]黑色素瘤；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；ATF4；腫瘤細胞增殖；腫瘤細胞侵襲；STAT3

[中圖分類號]R739.5 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）07-0083-04

Abstract： Objective To explore the role of endoplasmic reticulum （ER） stress protein ATF4 in cell proliferation and metastasis of melanoma. Methods RT-qPCR was applied to investigate the levels of mRNA expression. CCK-8 staining and BrdU staining were introduced to determine the abilities of cell growth and proliferation. Transwell system was used to detect the metastasis ability of cells. Immunoblotting was conducted to determine the protein levels in cells. Results The levels of ATF4 mRNA significantly increased in melanoma cell lines when compared to melanocytes. Ectopic expression of ATF4 efficiently enhanced the proliferation and metastasis of A375 cells. Abrogation of ATF4 in MM200 impaired cell growth and metastasis. Furthermore， ATF4 overexpression upregulated the expression of IL-6 and subsequently activated STAT3 signaling. Conclusion In general， our results revealed that ATF4 regulated cell proliferation and metastasis via activating IL-6-STAT3 signaling in melanoma.

Key words： melanoma； endoplasmic reticulum stress； ATF4； tumor cell proliferation； tumor cell invasion； STAT3

黑色素瘤，通常又稱惡性黑色素瘤（malignant melanoma），是一種常見的惡性皮膚腫瘤，生長迅速。由于血管生成相對緩慢而容易造成營養(yǎng)和能量的供給不足，高速生長時期的黑色素瘤細胞內(nèi)可能會發(fā)生多種應(yīng)激狀態(tài)，為應(yīng)對這些生存環(huán)境的不利局面，細胞需要合成大量的蛋白（特別是分泌蛋白）去緩解外界生存環(huán)境的困局，而短時間內(nèi)大量蛋白的合成給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum， ER）帶來了翻譯和修飾的壓力，會造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)出現(xiàn)大量未折疊蛋白或者錯誤折疊蛋白的積累，從而產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress）[1]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會激活細胞內(nèi)未折疊蛋白信號通路（The unfolded protein response pathway， UPR pathway）[2-4]。

近年來，越來越多的研究報道揭示了在腫瘤的發(fā)病過程中，UPR信號通路的關(guān)鍵作用[5-6]。在多種腫瘤的生長以及轉(zhuǎn)移過程中，PERK-eIF2-ATF4信號突進都扮演著重要角色。腫瘤細胞中PERK-eIF2通路得不到有效激活，ATF4蛋白產(chǎn)生量過少時，腫瘤細胞在體外和體內(nèi)的生長都會受到抑制[7-9]；在腫瘤細胞中敲除或者降低內(nèi)源ATF4細胞的表達，可以有效抑制移植腫瘤的生長[7]，更有意思的是，如果在腫瘤細胞內(nèi)過表達ATF4，細胞對多種抗腫瘤藥物（如Cisplatin， Doxorubicin， Vincristine以及Etoposide）的抗性明顯加強，體現(xiàn)了ATF4在腫瘤藥物抗性中的重要作用[10-12]。此外，該信號通路在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移方面也有著重要功能，在乳腺癌中敲除PERK后，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制[9]，而ATF4作為PERK下游重要分子，在腫瘤的轉(zhuǎn)移以及EMT中也起到非常關(guān)鍵的調(diào)控作用[13-14]。包括PERK-eIF2-ATF4通路在內(nèi)的UPR信號通路在黑色素瘤中也扮演著重要角色，抑制細胞內(nèi)PERK蛋白的活性，可以有效降低黑色素瘤的轉(zhuǎn)移[15]，但是具體的分子機制仍不清楚。黑色素瘤細胞不同于正常皮膚細胞一個主要特點是：細胞快速生長需要有大量的新蛋白產(chǎn)生，從而可在細胞中引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活UPR信號通路[1，16-17]。因此對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白ATF4在黑色素瘤中的功能和分子機制的充分研究有助于黑色素瘤的臨床治療以及藥物開發(fā)。本研究關(guān)注ATF4蛋白在黑色素瘤細胞增殖和遷移中的作用，初步探討ATF4調(diào)控黑色素瘤細胞增殖和遷移的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)：黑色素細胞系（HEMn-MP和HEMn-DP）和黑色素瘤細胞系（Mel-CV， MM200， A2058， A375和SKMel-28）均購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫。所有細胞系均使用含10%胎牛血清（FBS，購自于Gibico公司）的DMEM高糖培養(yǎng)基（購自于Corning公司）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。

1.2 熒光定量PCR：熒光定量PCR檢測方法參考文獻[18]。細胞在經(jīng)過相應(yīng)培養(yǎng)或處理后，使用TRIZol（購自Invitrogene公司）固定細胞并按照產(chǎn)品說明提取細胞內(nèi)總RNA，然后使用Takara公司RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。獲得的cDNA使用Power SyberGreen Mix試劑盒（購自ABI公司）進行熒光定量PCR檢測，檢測機器為ABI公司生產(chǎn)7900熒光定量PCR儀。

1.3 免疫印跡：免疫印跡技術(shù)檢測細胞中蛋白表達水平，具體方法參考文獻[19]。細胞在經(jīng)過相應(yīng)培養(yǎng)或處理后，使用RIPA固定并裂解細胞，細胞內(nèi)蛋白制成樣品通過SDS-PAGE按蛋白相對分子量分離并轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素薄膜上，薄膜使用10%脫脂牛奶封閉后，按照需要分別孵育相應(yīng)蛋白的一抗（Primary antibody），在4℃孵育過夜，然后使用辣根過氧化物酶交聯(lián)的相應(yīng)二抗（Secondary antibody）室溫孵育1h，最后使用免疫印跡顯色試劑盒（購自Thermo Fisherie Scientific公司）顯色。

1.4 CCK-8和BrdU染色檢測細胞增殖：Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自Dajino公司，按照產(chǎn)品說明書檢測細胞增殖。在96孔板中接種相應(yīng)細胞，每孔接種細胞數(shù)為1×103個，共分成6組，培養(yǎng)時間分別為4、24、48、72、96或120h，然后向相應(yīng)組中加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2h，最后使用酶標(biāo)儀讀取450nm的吸光度，以該吸光值為基礎(chǔ)計算成細胞數(shù)目。BrdU細胞增殖檢測試劑盒購自Cell Signaling Technology，按照產(chǎn)品使用說明書檢測細胞增殖情況。

1.5 熒光素酶報告實驗：本研究中使用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測ATF4對IL-6表達的調(diào)控作用，具體方法參考文獻[19]。將包含人源IL-6的啟動子的序列（2000bp）克隆到pGL3 basic質(zhì)粒上，然后將該質(zhì)粒與其它相應(yīng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，細胞裂解液使用Dual-luciferase Assay Kit（購自Promega公司），按照產(chǎn)品說明書檢測細胞中熒光素酶活性水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析：本研究所得結(jié)果，使用GraphPad 5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析和處理。所有實驗均進行3次以上，所有數(shù)據(jù)以（x?±s）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用Two-tailed Students t-test方法，兩組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA）或雙因素方差分析（Two-way ANOVA），P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATF4 mRNA水平檢測結(jié)果：黑色素瘤細胞系Mel-CV、MM200、A2058、A375以及SKMel-28細胞中的ATF4 mRNA水平顯著高于正常黑色素細胞系HEMn-MP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明在這些腫瘤細胞中，ATF4 mRNA含量相對較高，ATF4活性升高，可能與黑色素細胞病變?yōu)槟[瘤細胞密切相關(guān)，并有可能參與調(diào)控了腫瘤細胞包括增殖和轉(zhuǎn)移等特性相關(guān)。見圖1。

2.2 黑色素瘤A375細胞ATF4轉(zhuǎn)染結(jié)果：轉(zhuǎn)染可高表達人源ATF4的質(zhì)粒，提高了該細胞中ATF4的表達水平（見圖2A）。CCK-8檢測結(jié)果顯示，A375細胞內(nèi)ATF4含量增加后，細胞的生長速率顯著提高（見圖2B）；BrdU檢測結(jié)果顯示ATF4過表達促進了A375細胞增殖（見圖2C）。實驗結(jié)果說明，ATF4表達水平的提高可以促進黑色素瘤細胞生長及增殖；Transwell技術(shù)檢測細胞轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果顯示ATF4水平提高可以顯著增加穿過小室薄膜的A375細胞數(shù)量，說明過表達ATF4可以增加黑色素瘤A375細胞的轉(zhuǎn)移能力，ATF4具有促進黑色素瘤細胞轉(zhuǎn)移的功能（見圖2D～E）。

2.3 黑色素瘤MM200細胞si-ATF4轉(zhuǎn)染結(jié)果：si-ATF4轉(zhuǎn)染黑色素瘤MM200細胞，特異性降低該細胞中內(nèi)源ATF4的表達水平（見圖3A）。CCK-8檢測結(jié)果顯示，MM200細胞在ATF4降低后，細胞生長的速率明顯降低（見圖3B）； BrdU檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si-ATF4的細胞增殖能力減弱（見圖3C）；Tanswell實驗結(jié)果顯示，隨著ATF4含量的降低，穿過小室薄膜的腫瘤細胞的數(shù)量顯著減少（見圖3D～E），說明降低細胞內(nèi)ATF4水平可以抑制MM200細胞遷移能力。

2.4 黑色素瘤A375細胞中IL-6表達水平檢測結(jié)果：結(jié)果顯示過表達ATF4后，A375細胞中IL-6 表達水平顯著升高（見圖4A），進一步研究發(fā)現(xiàn)，ATF4過表達的A375細胞內(nèi)STAT3蛋白磷酸化水平顯著升高（見圖4B），說明增加細胞內(nèi)ATF4可以促進STAT3信號通路的激活。利用IL-6受體（IL-6 receptor，IL-6R）抑制劑Sarilumab特異性阻斷IL-6與IL-6R的結(jié)合，結(jié)果顯示Sarilumab可以有效抑制ATF4過表達引起的STAT3磷酸化的升高（見圖4B）。以上結(jié)果表明，黑色素瘤細胞中高水平的ATF4促進了細胞表達IL-6，從而提高細胞IL-6-STAT3信號通路的激活水平。

3 討論

UPR信號通路在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，但是具體的分子機制至今仍不是特別清楚。本次研究結(jié)果顯示，相對于正常的黑色素細胞，黑色素瘤細胞中ATF4 mRNA水平顯著升高，具有轉(zhuǎn)錄激活活性的ATF4蛋白增多。在黑色素瘤細胞中提高ATF4水平，會促進細胞表達更多的IL-6，通過自分泌作用使細胞內(nèi)STAT3信號通路激活。另一方面，升高細胞內(nèi)ATF4的水平，可以有效提高黑色素瘤細胞增殖和遷移的功能，而降低內(nèi)源ATF4的水平，則可以有效抑制黑色素瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

ATF4是一種重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，UPR信號通路激活后，大量表達的ATF4蛋白促進了多種基因的表達，從而緩解了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[2，4]。而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，除調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達外，ATF4還參與了調(diào)控了多種病理生理過程相關(guān)的基因表達。研究發(fā)現(xiàn)ATF4可以促進黑色素瘤細胞內(nèi)IL-6 啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，增加IL-6的表達和分泌，暗示ATF4可能是參與調(diào)控了IL-6的表達，詳細闡釋黑色素瘤細胞中ATF4參與IL-6表達調(diào)控的分子機制仍需要更多的研究結(jié)果。

有意思的是，用IL6受體抑制劑Sarilumab可以抑制ATF4高表達造成的細胞IL-6-STAT3信號通路的激活，這一結(jié)果提示黑色素瘤細胞表達的IL-6進一步通過自分泌或旁分泌作用激活了細胞內(nèi)STAT3信號通路。以往的研究發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路在多種腫瘤，特別是惡性腫瘤中，都處于高度激活狀態(tài)，而且在腫瘤細胞增殖和侵襲過程中都起到重要的作用[20-23]，在50%～90%的惡性黑色素瘤患者中，也發(fā)現(xiàn)了STAT3蛋白處于高度磷酸化狀態(tài)[22]，但是其具體原因和功能并不是十分清楚。本次研究結(jié)果顯示，黑色素瘤細胞內(nèi)高水平的ATF4可能通過增加細胞IL-6的表達，從而提高細胞內(nèi)STAT3信號通路的激活，而另一方面，增加的磷酸化STAT3可以促進黑色素瘤細胞的增殖和遷移能力，這可能是ATF4調(diào)控黑色素瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的（部分）分子機制。在接下來的研究中，仍需做更多的研究工作，更好地闡釋ATF4促進黑色素瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的具體分子機制。

綜上所述，黑色素瘤細胞內(nèi)高表達的ATF4蛋白，具有促進黑色素瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用，而其通過調(diào)控細胞IL-6的表達和分泌，激活細胞內(nèi)STAT3信號通路的激活，從而參與調(diào)控了黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過程。本次研究結(jié)果對黑色素瘤的臨床治療和藥物研發(fā)提供了很有價值的參考。

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[收稿日期]2018-04-28 [修回日期]2018-05-28

編輯/朱婉蓉