蔣宏

[摘要] 目的 探討缺氧條件下乳腺癌細(xì)胞γ-分泌酶對(duì)Notch信號(hào)通路的影響。方法 研究該院于2015年4月—2016年4月期間收治的MCF-7乳腺癌患者，將MCF-7乳腺癌患者細(xì)胞分為缺氧Ⅰ組、缺氧Ⅱ組和常規(guī)組，常規(guī)組加入磷酸鹽緩沖液作為對(duì)照，缺氧Ⅰ組、缺氧Ⅱ組則分別以50 μmol/L和100 μmol/L濃度的二氧化鈷處理，后置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h。24 h后檢測(cè)3組樣本NICD陽(yáng)性率，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并比較3組細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果 常規(guī)組、缺氧Ⅰ組和缺氧Ⅱ組MCF-7乳腺癌細(xì)胞中NICD陽(yáng)性率分別為71%、83%和90%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺氧Ⅱ組（265.62±12.68）MCF-7細(xì)胞穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞總數(shù)最多，缺氧Ⅰ組次之（166.59±11.46），常規(guī)組最少（76.72±9.84），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=165.306，P<0.05）。 結(jié)論 缺氧環(huán)境下明顯提高NICD的陽(yáng)性表達(dá)，缺氧程度越高γ-分泌酶活性越高，Notch信號(hào)通路越強(qiáng)，MCF-7細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；缺氧；γ-分泌酶；Notch信號(hào)通路；影響

[中圖分類號(hào)] R614 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2018）06（b）-0026-03

Effect of Gamma Secretase on Notch Signaling Pathway in Human Breast Cancer Cells under Hypoxia

JIANG Hong

Department of Colorectal Anus Surgery， Affiliated Hospital of Binzhou Medical College， Binzhou， Shandong Province， 256600 China

[Abstract] Objective To investigate the effect of γ -secretase on Notch signal pathway in breast cancer cells under hypoxia. Methods The patients with MCF-7 breast cancer admitted and treated in our hospital from April 2015 to April 2016 were selected and divided into three groups， including hypoxia I group， hypoxia II group and routine group， and the routine group added the phosphate buffer for control， and the hypoxia I group and hypoxia II group respectively used the 50 μmol/ L and 100 μmol/ L concentrations of cobalt dioxide for treatment， and were cultured for 24 h in the couveuse at 37℃， 5%CO2， and the positive rate of NICD of the three groups was tested after 24 h， and the invasion capabilities of cells of the three groups were tested and compared by the Transwell invasion experiment. Results The NICD positive rates of breast cancer cells in the routine group， hypoxia I group and hypoxia II group were respectively 71%， 83%， 90%， and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）， and the total number of MCF-7 cell through basal plasmamembrane in the hypoxia II group was the most， then the hypoxia I group and routine group， [（ 265.62±12.68） ， （166.59±11.46） ， （76.72±9.84）]， and the difference was statistically significant（F=165.306，P<0.05）. Conclusion The NICD positive expression is obviously improved under hypoxia， and the higher the hypoxia degree， the higher the activity of gamma secretase， and the stronger the Notch signal pathway and MCF-7 cell invasion and metastasis abilities.

[Key words] Breast cancer； Hypoxia； γ-secretase； Notch signal pathway； Effect

乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%，已成為威脅婦女健康的主要病因，并已成為當(dāng)前社會(huì)的重大公共衛(wèi)生問題[1]。目前，乳腺癌的治療仍然依靠傳統(tǒng)的化療，其深受頻繁的治療失敗和耐藥的困擾，因此尋找新的研究靶點(diǎn)、為腫瘤靶向治療提供新思路無(wú)疑具有十分重要的意義。Notch信號(hào)途徑是一種進(jìn)化保守的傳導(dǎo)信號(hào)通路，Notch信號(hào)蛋白在多種生物體內(nèi)均有表達(dá)，主要介導(dǎo)細(xì)胞的分化抑制信號(hào)，是決定細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)通路[2]，研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路在乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起著不可或缺的作用[3]。而γ-分泌酶是Notch信號(hào)蛋白活化過程中第二步水解的必需酶，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系。此外，低氧腫瘤微環(huán)境通過激活基因增加癌癥細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而介導(dǎo)腫瘤的浸潤(rùn)，缺氧可使上皮細(xì)胞失去附著功能，并獲得能遷徙的間質(zhì)表型，所以有理由認(rèn)為缺氧誘導(dǎo)可導(dǎo)致乳腺癌耐藥及轉(zhuǎn)移，但其機(jī)制尚未完全明確[4]。為進(jìn)一步探討缺氧條件下乳腺癌細(xì)胞γ-分泌酶對(duì)Notch信號(hào)通路的影響，進(jìn)行了該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)該院于2015年4月—2016年4月期間收治的MCF-7乳腺癌患者進(jìn)行分析，以期為乳腺癌治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

乳腺癌MCF-7細(xì)胞系（美國(guó)ATCC公司）、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）、二氧化鈷（美國(guó)Sigma公司）、4%多聚甲醛固定液（北京Solarbio科技有限公司）、FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)羅氏公司）、Transwell小室（美國(guó)康寧生物科技公司）、一抗兔抗人NICD（密理博公司 Millipore，Cat：07-1232，工作濃度1∶100），二抗即用型試劑盒（PV6001、PV9001）及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基。以4×105個(gè)/孔采用6孔板進(jìn)行接種，常規(guī)組加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）作為對(duì)照，缺氧Ⅰ組、缺氧Ⅱ組則分別以50 μmol/L和100 μmol/L濃度的二氧化鈷處理，后置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h。24 h后以細(xì)胞貼壁融合達(dá)80%作為開始傳染的標(biāo)準(zhǔn)，傳染嚴(yán)格按照試劑使用說明書進(jìn)行操作，完成后于培養(yǎng)基中孵育10 min。

1.2.2 免疫組化 采用SP二步法免疫組化染色，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比表示，即低倍鏡下（40倍）隨機(jī)選取10個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取均值，以胞核或胞漿呈棕黃、棕褐色為判斷陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)[5]。無(wú)染色或陽(yáng)性率不足1%以（-）表示，陽(yáng)性率1%～20%以（+）表示，21%～40%以（++）表示，40%以上以（+++）表示，陽(yáng)性率≥21%記為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.3 MCF-7侵襲能力實(shí)驗(yàn) 將上室未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞和基質(zhì)膠去除，切下聚碳酸酯膜，浸入4%多聚甲醛液中固定30 min，PBS溶液清洗3次，常規(guī)蘇木素染色，中性樹膠封片。顯微鏡（100倍）下計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞。每組樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，以穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞總數(shù)表示乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力，計(jì)算出平均值，每組重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，樣本率間比較用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，各組細(xì)胞穿透基底膜數(shù)量比較均采用單因素方差分析（Analysis of single variance，ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組樣本NICD陽(yáng)性率比較

結(jié)果顯示，常規(guī)組、缺氧Ⅰ組和缺氧Ⅱ組MCF-7乳腺癌細(xì)胞中NICD陽(yáng)性率分別為71%、83%和90%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 3組樣本MCF-7細(xì)胞穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞總數(shù)

結(jié)果顯示，缺氧Ⅱ組MCF-7細(xì)胞穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞總數(shù)最多，缺氧Ⅰ組次之，常規(guī)組最少，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物阿霉素和多西紫杉醇在乳腺癌治療中耐藥性的產(chǎn)生在某些情況下可以歸因于Notch信號(hào)通路與Akt途徑的串?dāng)_[6]。Notch信號(hào)途徑是一種進(jìn)化保守的傳導(dǎo)信號(hào)通路，Notch信號(hào)蛋白在多種生物體內(nèi)均有表達(dá)，其成員的結(jié)構(gòu)具有高度的保守性；并在多種細(xì)胞分化、生物發(fā)育的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]。Notch信號(hào)蛋白主要介導(dǎo)細(xì)胞的分化抑制信號(hào)，是決定細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)通路，同時(shí)也是維持干細(xì)胞增殖能力的信號(hào)通路。Notch信號(hào)通路不單影響細(xì)胞的分化、發(fā)育及凋亡，而且與一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[8]。Notch的活化是通過啟動(dòng)Notch配體（Jagged/Serrate家族）結(jié)合Notch受體（Notch1-4），之后通過TACE和γ-分泌酶相繼水解，釋放Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）影響核轉(zhuǎn)錄。γ-分泌酶是一種包括PS二聚體、Nicastrin、Aph-1、PEN-2 等組分的多酶復(fù)合體，是Notch信號(hào)蛋白活化過程中第二步水解的必需酶，能夠促使受體蛋白胞內(nèi)段的釋放，胞內(nèi)段進(jìn)入細(xì)胞核后與轉(zhuǎn)錄因子CBF-1相結(jié)合而產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)[9]。

該研究中缺氧Ⅰ組和缺氧Ⅱ組分別以50 μmol/L和100 μmol/L濃度的二氧化鈷處理，結(jié)果顯示，常規(guī)組、缺氧Ⅰ組和缺氧Ⅱ組MCF-7乳腺癌細(xì)胞中NICD陽(yáng)性率分別為71%、83%和90%；并且缺氧Ⅱ組MCF-7細(xì)胞穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞總數(shù)最多，缺氧Ⅰ組次之，常規(guī)組最少。缺氧Ⅱ組（265.62±12.68）MCF-7細(xì)胞穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞總數(shù)最多，缺氧Ⅰ組次之（166.59±11.46），常規(guī)組最少（76.72±9.84），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=165.306，P<0.05）國(guó)外研究已證實(shí)γ-分泌酶抑制劑阻斷癌細(xì)胞中的Notch信號(hào)后，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制。由于γ-分泌酶在調(diào)節(jié)NICD釋放中起到關(guān)鍵作用，所以，觀察缺氧條件下NICD的變化可反映γ-分泌酶的活性，進(jìn)而反映Notch信號(hào)通路的表達(dá)狀態(tài)。同時(shí)在，周敏等[10]專家的研究中，證實(shí)Notch～4各亞型在A549細(xì)胞中均有一定的表達(dá)，5、10、20 μmol/L。MW167處理肺腺癌A549細(xì)胞2 d后，加藥組以及對(duì)照組對(duì)比，NotchL水平呈現(xiàn)為升高的趨勢(shì)，組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；細(xì)胞繁殖率也相應(yīng)上升（r=0.904）。

綜上所述，缺氧環(huán)境下明顯提高NICD的陽(yáng)性表達(dá)，缺氧程度越高γ-分泌酶活性越高，Notch信號(hào)通路越強(qiáng)，MCF-7細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。

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（收稿日期：2018-03-18）