劉慧青，徐中其

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

近年來，我校(東華大學(xué))基礎(chǔ)實驗中心得到上海市化學(xué)學(xué)科建設(shè)資金資助，相繼購置了一批大型分析儀器，建立了精密儀器平臺，旨在推動新型儀器分析實驗改革，提高實驗教學(xué)水平。分析化學(xué)教研室積極開展“儀器分析”課程的教學(xué)研究與改革，以激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生綜合運用知識能力和創(chuàng)新能力。

一、 水質(zhì)檢測實驗項目的教學(xué)現(xiàn)狀

“儀器分析”作為我?；瘜W(xué)化工與生物工程學(xué)院開設(shè)的一門專業(yè)基礎(chǔ)課，具有很強的應(yīng)用性和實踐性。根據(jù)應(yīng)用化學(xué)、生物工程等專業(yè)人才培養(yǎng)的要求，將“儀器分析”實驗課程分為幾大教學(xué)模塊，水質(zhì)檢測為其中之一。它是以分析與測定環(huán)境水樣中某些成分含量為目的，通過水質(zhì)分析技術(shù)了解環(huán)境水質(zhì)情況，為監(jiān)督和控制水質(zhì)質(zhì)量提供依據(jù)。水質(zhì)檢測方法很多，根據(jù)常規(guī)水質(zhì)檢測項目，分為物理性質(zhì)測定、金屬化合物測定、非金屬無機化合物測定和有機化合物測定[1]。在“儀器分析”實驗教學(xué)中，水質(zhì)檢測模塊安排了3個實驗，分別為原子吸收光譜法測定水中的鈣、鎂含量——標(biāo)準曲線法[2]，鉬酸銨分光光度法測定水中總磷[3]，離子色譜法測定水樣中的無機陰離子含量[4]。

二、 教學(xué)改革的目的、意義及設(shè)計

環(huán)境水樣的無機陰離子測定通常采用傳統(tǒng)的離子色譜法[5-6]。離子色譜法(IC)存在樣品分析時間長、準備工作量大、僅適用于低濃度試樣、分離效率低和色譜峰形差等缺點。針對離子色譜法存在的不足，本實驗設(shè)計了一種快速、操作簡便、試劑消耗少、柱效高的檢測方法——毛細管電泳法(CE)。與離子色譜法相比，毛細管電泳法具有更高的分辨能力和分離效率[7]。另外，離子色譜法與“儀器分析”實驗中常用的反相高效液相色譜法的實驗原理、基本概念、儀器結(jié)構(gòu)和操作方法相似，而毛細管電泳法則是在傳統(tǒng)電泳和高效液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型高效分離技術(shù)，使分析科學(xué)從微升級進入到了納升級水平[8]。隨著近幾年毛細管電泳法在生物醫(yī)藥、環(huán)境化學(xué)、農(nóng)學(xué)和食品分析等應(yīng)用領(lǐng)域的快速發(fā)展和深入，越來越多的企業(yè)選用毛細管電泳儀作為分離分析工具。因此，本教學(xué)改革不僅能縮短實驗時間、節(jié)約試劑用量和提高分離效率，而且能將毛細管電泳法引入本科實驗教學(xué)中，讓學(xué)生能夠掌握更多的知識和技能，主動適應(yīng)企業(yè)需求，提升學(xué)生就業(yè)能力。

本實驗的目的是讓學(xué)生理解毛細管電泳的基本原理，熟悉毛細管電泳儀的構(gòu)成，了解影響毛細管電泳法分離的主要操作參數(shù)。因此，將對電泳的背景電解質(zhì)(BGE)、有機添加劑、分離電壓、電滲流改性劑和pH值分別進行討論，讓學(xué)生自主選出合適的毛細管電泳條件。對于自主選擇色譜條件，最初學(xué)生還是有一定的畏難情緒。通過改變毛細管電泳法條件的分離參數(shù)，讓學(xué)生直觀感知到色譜圖的變化，從而更加容易和深入地掌握相關(guān)的理論知識。學(xué)生采用自主選擇的優(yōu)化條件，對校內(nèi)湖水和實驗室未知水樣進行定量分析。這種教學(xué)模式極大地促進了學(xué)生對“儀器分析”實驗課程學(xué)習(xí)的主動性和積極性，培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)新能力和科研能力。

三、 水質(zhì)檢測實驗基本內(nèi)容

水質(zhì)檢測是大二第一學(xué)期“儀器分析”課程中水質(zhì)分析設(shè)計實驗，4學(xué)時。對于本科生實驗教學(xué)，考察間接吸收背景物質(zhì)、有機添加劑和分離電壓對無機陰離子的毛細管電泳分離的影響。而研究生的水質(zhì)分析設(shè)計實驗為8學(xué)時，在本科生的無機陰離子毛細管電泳分析的基礎(chǔ)上拓展部分內(nèi)容，即討論電滲流改性劑和緩沖溶液pH值對分離的影響。

1. 儀器與試劑

P/ACE MDQ型毛細管電泳儀，彈性石英毛細管柱(60 cm×75 μm，有效長度50 cm)。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、鉻酸鉀(K2CrO4)、丙三醇、乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

陰離子標(biāo)準儲備液：分別準確稱取適量的NaF、NaCl、Na2SO4、KBr和KNO3，用超純水定容配成1 000 mg/L的標(biāo)準儲備液。實驗時將儲備液稀釋到所需濃度。

2. 實驗方法

配制一定濃度的鉻酸鉀溶液作背景電解質(zhì)，實驗前用超聲波脫氣。每次進樣前毛細管依次用超純水和電解質(zhì)溶液沖洗，每進樣4次需更換新鮮電解質(zhì)溶液。采用壓力進樣，毛細管溫度控制為25 ℃。

3. 實驗過程與分析討論

(1) 背景電解質(zhì)對電泳行為的影響。紫外光度檢測器是毛細管電泳法最廣泛使用的檢測器，它具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、高溫穩(wěn)定性優(yōu)和價格實惠等優(yōu)勢。然而，大部分無機離子沒有或只有很低的紫外吸收，如何用紫外光度檢測器來檢測？我們采用含強紫外吸收的物質(zhì)作為背景電解質(zhì)，當(dāng)它通過檢測器窗口時，出現(xiàn)較大的背景吸收。當(dāng)無機陰離子通過紫外檢測窗口時，陰離子代替背景電解質(zhì)降低了背景吸光度值，出現(xiàn)色譜峰從而達到檢測的目的。傅小蕓等[9-11]考察了多種類型背景電解質(zhì)對陰離子分離的影響，發(fā)現(xiàn)鉻酸根較適合作為背景電解質(zhì)來分離遷移率大的無機陰離子。鉻酸根濃度的大小對檢測靈敏度、陰離子的遷移時間和分離具有一定的影響。本實驗中學(xué)生通過考察K2CrO4濃度為1.0～10 mmol/L時，濃度變化對遷移時間和分離效率的影響，然后學(xué)生自主選擇出鉻酸根的最佳濃度。當(dāng)背景電解質(zhì)為5.0 mmol/L左右的鉻酸根時，分離度最佳。

(2) 有機添加劑的影響。在毛細管電泳的電解質(zhì)體系中加入有機溶劑，能降低電解質(zhì)溶液的介電常數(shù)，從而降低電滲流，延長分析時間，改善分離。本實驗考察在1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4的緩沖溶液中，有、無添加混合有機溶劑對分離度的影響。在無添加有機溶劑的條件下，Br-和Cl-嚴重地重疊(圖1中曲線A)，未能實現(xiàn)分離；僅添加一定量的乙醇或丙三醇，5種陰離子也不能完全基線分離；在添加混合有機物3%丙三醇和10%乙醇時，Br-和Cl-得到較好分離度，5種陰離子組分在6.0 min內(nèi)達基線分離(圖1中曲線B)。

圖1 5種陰離子在無有機溶劑(A)和添加有機溶劑(B)條件下的電泳譜圖對比峰序：緩沖體系：1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4(pH=8.4)；分離電壓：-20 kV；樣品壓力進樣0.5 psi×10 s；檢測波長：254 nm

圖2 分離電壓對出峰時間的影響緩沖體系：1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4(pH=8.4)+體積分數(shù)3%丙三醇+體積分數(shù)10%乙醇；樣品壓力進樣：0.5 psi×10 s；檢測波長：254 nm

(3) 分離電壓的影響。實驗采用負電壓，陰極進樣，陽極檢測。外加電壓的改變會產(chǎn)生不同的電場強度和焦耳熱，從而影響各離子的出峰時間、峰形和分離度。一方面，隨著電壓的增大，電滲速度和陰離子的遷移速度增大，出峰時間縮短，峰形變尖，柱效和分離度提高，有利于毛細管電泳法快速分析；另一方面，過高的電壓使得毛細管內(nèi)壁產(chǎn)生過多的焦耳熱，導(dǎo)致譜峰增寬，反而降低柱效和分離度[12]。實驗中考察了不同負電壓(-15～-25 kV)對各陰離子出峰時間、分離度及柱效的影響，讓學(xué)生繪制分離電壓-出峰時間曲線圖(見圖2)，并計算出不同電壓下的分離度和理論塔板數(shù)。通過理論塔板數(shù)的計算了解毛細管電泳法具有強大的分離效率，進而加深對平流(電泳中電滲流的流動)和層流(液相色譜中的溶液流動)驅(qū)動的理解。通過討論不同負電壓對出峰時間、峰形和分離度的影響，讓學(xué)生自主摸索出最佳分離電壓。一般最佳分離電壓為-20 kV，在該電壓下可獲得良好的分離效果。

圖3 校內(nèi)湖水的電泳圖峰序：緩沖體系：1.0 mmol/L CTAB+5 mmol/L K2CrO4(pH=8.4)+體積分數(shù)3%丙三醇+體積分數(shù)10%乙醇；樣品壓力進樣：0.5 psi×10 s；分離電壓：-20 kV；檢測波長：254 nm

4. 實驗拓展部分

(1) 電滲流改性劑的影響。毛細管電泳分離過程中，陰離子的電泳淌度大，且方向與電滲流相反，存在遷移時間長、峰形寬、分離效率低的問題。因此需要在電解質(zhì)溶液中加入一定量的電滲流改性劑，利用CTAB中[H4N]+對毛細管壁表面的硅醇基團進行屏蔽，從而改變電滲流方向，實現(xiàn)陰離子的快速分離分析效果[13-14]。本實驗中學(xué)生可配制濃度分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的CTAB，考察電滲流改性劑濃度對遷移時間、分離度的影響，從而自主選出最佳濃度的CTAB。一般采用CTAB濃度為0.5～1.0 mmol/L，完全能實現(xiàn)各離子的分離。

(2) 緩沖溶液pH值對分離的影響。毛細管電泳分離無機陰離子需在弱堿性條件下進行，學(xué)生配制不同pH值(7.0～9.5)的緩沖溶液，考察其pH值對陰離子分離的影響，選出最合適的pH值。發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值為7.0～8.3時，隨著pH值增大，各組分的遷移時間縮短，背景電解質(zhì)體系不穩(wěn)定，組分峰高降低，分離效率不佳；當(dāng)pH值為8.4～8.9時，pH值對遷移時間的影響很小，峰形和分離度較好；當(dāng)pH值大于9.0時，F(xiàn)-峰擴展嚴重，分離度減小。因此一般選擇緩沖溶液的pH值為8.4～8.9。

四、 考核體系

“儀器分析”實驗課程的考核簡單地以實驗結(jié)果作為唯一評判標(biāo)準是不合適的，應(yīng)該更關(guān)注和重視學(xué)生在整個實驗課程中的綜合表現(xiàn)[15-16]。實驗成績分成三部分：(1)實驗前期的預(yù)習(xí)(包括毛細管電泳法理論知識、儀器操作方法、實驗方案設(shè)計等)，實驗準備工作的參與以及預(yù)習(xí)報告的完成情況，占20%。(2)實驗過程，包括實驗態(tài)度、組內(nèi)合作、實驗效率、操作能力、實驗結(jié)果等，這部分考核是整個考核體系中的重點，占50%。為了能全面、公正地考核學(xué)生的實驗過程，指導(dǎo)教師需要在整個實驗過程中對每名學(xué)生的操作進行仔細觀察并及時糾正錯誤操作，對學(xué)生的實驗過程考核做出準確評價。(3)實驗報告，包括實驗?zāi)康?、實驗原理、儀器與試劑、實驗數(shù)據(jù)及處理(包括分離電壓-遷移時間曲線圖和各離子標(biāo)準曲線的繪制，不同電壓下的分離度和理論塔板數(shù)、回歸方程和實際水樣含量的計算)、實驗結(jié)果分析(特別是影響電泳分離的幾個參數(shù)對毛細管電泳法分離的結(jié)果和討論)、思考題，占30%。

五、 結(jié)語

以毛細管電泳法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的離子色譜法，促使“儀器分析”實驗課程中儀器分析手段的多元化。同時使用區(qū)別于以往的色譜分析的間接紫外檢測法，讓學(xué)生學(xué)會無或只有很低的紫外吸收物質(zhì)的測定。通過本實驗的教學(xué)改革，激發(fā)學(xué)生對“儀器分析”課程的學(xué)習(xí)興趣，增強學(xué)生的分析能力，有利于學(xué)生的就業(yè)和發(fā)展，同時也提高了學(xué)生的科研能力，為大四的畢業(yè)設(shè)計(論文)奠定基礎(chǔ)。