陳樹(shù)俊，李佳益，王翠連，張君梅，李 樂(lè)，石 玥

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

高平黃梨是山西著名特產(chǎn)，高平素有梨鄉(xiāng)之稱，距今已有1 500 a的栽培歷史，其個(gè)大、味濃、味香、香甜適口，味道鮮美，各種維生素、礦物質(zhì)含量高，水分大、耐貯運(yùn)且含糖量很高[1]。隨著梨汁加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生越來(lái)越多的梨渣，梨渣中含有豐富的多糖，而多糖是生物體重要的生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫力[2-3]、抗氧化[4-5]、抑菌[6]、抗腫瘤[7]、降血脂、降血糖[8-9]等作用，因此梨渣可作為提取多糖的主要來(lái)源。國(guó)內(nèi)多采用水浴醇沉[10]、超聲[11]等方法提取多糖，利用Sevag法[12]、三氯乙酸法[13]等脫除多糖中的雜質(zhì)蛋白質(zhì)，采用H2O2法[14]、活性炭法[15]等方法對(duì)多糖進(jìn)行脫色，采用凝膠滲透色譜法、超高效液相色譜法[16]測(cè)定多糖的相對(duì)分子質(zhì)量，氣相色譜法測(cè)定其單糖組成以及用紅外光譜法對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析。楊江濤[17]用凝膠滲透色譜法測(cè)定刺梨多糖的相對(duì)分子質(zhì)量為52 000，衛(wèi)強(qiáng)等[18]用氣相色譜分析法確定紅豆杉多糖中含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、木糖和半乳糖，并通過(guò)紅外光譜法鑒定其為一種具有β糖苷鍵的吡喃型多糖。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于高平黃梨的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以高平黃梨渣為原料，利用水浴醇沉法和超聲輔助法提取梨渣多糖，比較Sevag法、酶法、Sevag法和酶法結(jié)合3 種方法確定脫蛋白工藝，比較H2O2法、活性炭法、反膠束溶液法3 種方法確定脫色工藝，采用DEAE-52纖維素柱層析方法對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)，烏氏黏度法測(cè)定黃梨渣多糖的黏均分子質(zhì)量，超高效液相色譜法對(duì)單糖的組成及含量進(jìn)行分析，并通過(guò)紅外光譜對(duì)黃梨渣多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定。旨在為高平黃梨資源的綜合利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高平黃梨渣 山西夏普賽爾食品飲料股份有限公司。

牛血清白蛋白 美國(guó)Roche公司；DEAE-52纖維素、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、三氟乙酸、乙腈（色譜純）、磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）北京Solarbio公司；Sephadex G-100 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WFZ UV-2100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 佳明儀表公司；電子分析天平 上海卓精公司；超聲波清洗機(jī)、真空冷凍干燥箱 寧波新芝生物科技股份有限公司；SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生有限公司；SC-3610低速離心機(jī)、HC-2518高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；恒流泵 上海青浦滬西儀器廠；烏氏黏度計(jì) 上海良晶玻璃儀器廠；1525高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 梨渣多糖的提取及測(cè)定

1.3.1.1 多糖含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=12.08x-0.039 2，R2=0.999 2。

1.3.1.2 超聲輔助提取工藝優(yōu)化

精密稱取1 g，適當(dāng)料液比混勻，超聲輔助熱水浸提，4 000 r/min離心15 min得上清液，旋轉(zhuǎn)濃縮，加入3 倍體積95%乙醇溶液使得最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%以上，4 ℃醇沉過(guò)夜，4 000 r/min離心15 min得沉淀，干燥后即得粗多糖樣品。

單因素試驗(yàn)：選取料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））；超聲功率（110、120、130、140、150 W）；超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）；超聲時(shí)間（40、50、60、70、80 min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察對(duì)梨渣多糖提取量的影響。

響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)：根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以多糖提取量為響應(yīng)值，結(jié)合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in response surface analysis

1.3.2 梨渣多糖脫蛋白

1.3.2.1 蛋白含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20]，以牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=6.345x+0.126 7，R2=0.999 6。

1.3.2.2 脫蛋白方法

Sevag法：取一定量的粗多糖溶液，向其中加入1/5體積的正丁醇-氯仿混合液（正丁醇-氯仿體積比1∶4），磁力攪拌器高速攪拌30 min，8 000 r/min離心20 min，去除沉淀，重復(fù)13 次，直至無(wú)沉淀產(chǎn)生。測(cè)定多糖含量和蛋白含量，按公式（1）、（2）計(jì)算蛋白脫除率和多糖損失率：

酶法：向100 mL粗多糖溶液中加入1%木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH 6.0，于50 ℃水浴中加熱保溫2 h，然后4 000 r/min離心15 min得上清液，并按公式（1）、（2）計(jì)算蛋白脫除率和多糖損失率。

酶法和Sevag法結(jié)合：將酶法所得上清液再用Sevag法脫蛋白，重復(fù)操作5 次至無(wú)蛋白沉淀，并按公式（1）、（2）計(jì)算蛋白脫除率和多糖損失率。

1.3.3 梨渣多糖脫色方法的確定

對(duì)梨渣粗多糖溶液進(jìn)行可見(jiàn)-紫外全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)互補(bǔ)色原理[21]確定檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，測(cè)定溶液脫色前后吸光度，分別按公式（3）、（4）計(jì)算脫色率和多糖損失率：

H2O2法：用2 mol/L的NaOH溶液將脫蛋白后的梨渣多糖溶液調(diào)至pH 8.5，緩慢攪拌加入1/5體積的30% H2O2溶液，50 ℃保溫脫色2 h，直至顏色不再改變，取出后冷卻到室溫，調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，并檢測(cè)其脫色前后的吸光度和多糖含量。

活性炭法：將活性炭用蒸餾水清洗并過(guò)濾，在100 ℃烘箱中干燥20 h備用。取100 mL 5 mg/mL粗多糖溶液，加入3%活性炭，60 ℃水浴脫色2 h，至顏色不再改變，檢測(cè)其脫色前后的吸光度和多糖含量。

反膠束溶液法[18]：取脫蛋白后的多糖配制成5 mg/mL的粗多糖溶液50 mL，置于沸水浴中加熱30 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心5 min，取0.234 g NaCl加入20 mL上清液中備用。將1 mL正己醇、4 mL異辛烷和0.274 g十六烷基三甲基溴化銨混合制成反膠束溶液。移取3 mL粗多糖溶液和1 mL反膠束溶液，振蕩3 min后靜置30 min，取下層液體檢測(cè)其脫色前后色素吸光度和多糖含量。

1.3.4 梨渣多糖的透析

經(jīng)過(guò)脫蛋白、脫色的梨渣多糖，還會(huì)存在單糖、低聚糖和鹽等小分子雜質(zhì)需要除去，故將脫色后的多糖溶液裝入透析袋于蒸餾水中透析36 h，中間隔斷換水。

1.3.5 梨渣多糖的分級(jí)

參考王雪艷[21]采用DEAE-52纖維素柱層析的方法對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)。將經(jīng)過(guò)脫蛋白、脫色、透析的多糖溶液濃縮至適當(dāng)體積，上DEAE-52纖維素柱（2.6 cm×30 cm）進(jìn)行分級(jí)純化，先以20 mL蒸餾水洗脫，然后以0～1 mol/L NaCl的Tris-HCl溶液進(jìn)行線性洗脫，流速為1 mL/min，每3 min收集一管，于490 nm波長(zhǎng)處以苯酚-濃硫酸法測(cè)定吸光度，繪制洗脫曲線，橫坐標(biāo)為接收管數(shù)，縱坐標(biāo)為吸光度。洗脫液經(jīng)濃縮、透析、真空冷凍干燥制得精制多糖。

1.3.6 梨渣多糖的純度鑒定

Sephadex G-100凝膠柱層析：稱取10 mg的精制多糖溶于5 mL 0.1 mol/L NaCl溶液中，加到預(yù)先用0.1 mol/L NaCl溶液平衡的Sephadex G-100凝膠柱上，用0.1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為1 mL/min，每3 min收集一管，在490 nm波長(zhǎng)處以苯酚-硫酸法測(cè)定吸光度，繪制洗脫曲線，橫坐標(biāo)為接收管數(shù)，縱坐標(biāo)為吸光度。

紫外吸收光譜法：將質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL純化后的多糖溶液于200～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，觀察在260 nm、280 nm波長(zhǎng)附近的特征吸收峰。

凍融實(shí)驗(yàn)法：取冷凍過(guò)夜后的精制多糖在室溫下融化，12 000 r/min離心15 min，觀察離心管底部沉淀產(chǎn)生情況。

1.3.7 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

參照金婷[22]方法。精確稱取梨渣精制多糖樣品0.25 g，用蒸餾水溶解并定容至25 mL容量瓶中，將烏氏黏度計(jì)置于25 ℃的恒溫水浴鍋中，在C管和B管的上端套上干燥清潔的橡皮管，從A管沿管壁加入10 mL多糖溶液，恒溫10 min后，測(cè)定其流出時(shí)間t1。然后依次從A管分別加入10、5、15、10 mL水，將原濃度的溶液稀釋成不同的濃度，分別測(cè)定不同濃度時(shí)的流出時(shí)間t。在檢測(cè)樣品的黏度前，先以同樣的方法測(cè)定蒸餾水的流出時(shí)間t0。每個(gè)數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3 次，偏差應(yīng)小于0.2 s，取其平均值。分別計(jì)算相對(duì)黏度ηr、增比黏度ηsp和比濃黏度ηsp/c。橫坐標(biāo)為多糖溶液的質(zhì)量濃度c，縱坐標(biāo)為ηsp/c繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以外推法求得特性黏度[η]。根據(jù)Mark-Houwink公式（[η]=KMηα）求得梨渣多糖的黏均分子質(zhì)量。

1.3.8 單糖組成的測(cè)定

酸水解：稱取凍干的多糖樣品2 mg，加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，在120 ℃條件下水解120 min，氮吹儀吹干。

標(biāo)準(zhǔn)品處理：首先配制10 mg/mL單糖標(biāo)準(zhǔn)品置于-20 ℃，用時(shí)取出融化，在可以密封的玻璃管中加入上述單糖標(biāo)準(zhǔn)品各5 μL，混勻。然后加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，與樣品同時(shí)在120 ℃條件下水解120 min，空氣泵吹干。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生化：向水解干燥后得到的單糖樣品中加入溶于無(wú)水甲醇的0.5 mol/L的PMP溶液和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，充分混勻后，水浴70 ℃反應(yīng)30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl溶液0.5 mL，充分混勻。平均分成兩份到EP管中，其中一份備用，在備用樣品中滴入一滴氯仿置于4 ℃冰箱。另外一份加入0.5 mL氯仿，充分振蕩萃取，離心（5 000 r/min，5 min）去除氯仿層，共萃取3 次。水層（不低于0.4 mL）用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，待上機(jī)。

儀器條件：色譜柱：T h e r m o O D S-2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液-乙腈82∶18（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；波長(zhǎng)：245 nm。

1.3.9 紅外光譜分析

稱取多糖干燥樣品1 mg和KBr混合研磨壓片后在波長(zhǎng)范圍為4 000～500 cm-1采用紅外光譜儀掃描分析，觀察吸收峰，對(duì)多糖的構(gòu)型進(jìn)行初步分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Origin 6.0和Excel軟件進(jìn)行分析作圖，各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，以 ±s表示，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析采用Design-Expert V 8.0.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助法提取梨渣多糖優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Results of one-factor-at-a-time experiments

由圖1a可以看出，多糖提取量在料液比為1∶20（g/mL）時(shí)達(dá)到最大，超過(guò)1∶20（g/mL）后，多糖提取量下降，推測(cè)是由于增加溶劑，有利于多糖溶出，而溶劑用量過(guò)大會(huì)影響提取體系的傳熱和傳質(zhì)，使多糖提取量降低[25]；由圖1b可知，多糖提取量隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，至50 min時(shí)達(dá)到最大，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)多糖提取量趨于平緩，可能由于超過(guò)50 min后，提取時(shí)間的延長(zhǎng)使雜質(zhì)溶出增多，多糖提取量增加緩慢[26]；多糖提取量隨著超聲功率的增加也逐漸上升，130 W時(shí)提取量達(dá)到最大，隨后，超聲功率的升高不再增加多糖提取量，反而有所下降（圖1c），這可能是因?yàn)槌暪β试黾樱暉嵝?yīng)變大，使多糖降解，提取量降低[25]；由圖1d可以看出，多糖提取量在超聲溫度為50 ℃時(shí)達(dá)到最大，低于或高于50 ℃時(shí)提取量都顯著下降，可能由于溫度過(guò)高，溶劑揮發(fā)使溶液黏度增大，不利于多糖溶解，從而使多糖提取量下降[26]。所以，在料液比1∶10～1∶30（g/mL）、超聲時(shí)間40～60 min、超聲功率120～140 W、超聲溫度40～60 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。

2.1.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental values of polysaccharide yield

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for the effect of extraction conditions on polysaccharide yield

對(duì)表2梨渣多糖提取量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合后，由統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert V 8.0.6分析，建立二次多元回歸方程：Y=61.81+0.96A+1.24B+1.50C-0.51D-7.04AB+1.95AC-1.27AD-1.07BC+2.60BD+3.93CD-4.88A2-3.2B2-4.75C2-2.64D2。

從表3可以看出，建立的模型F值為27.63（P＜0.000 1），說(shuō)明該模型極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.296 9大于0.05，不顯著，說(shuō)明該模型可以很好地?cái)M合試驗(yàn)的真實(shí)情況，可以用于梨渣多糖提取工藝的優(yōu)化。其中R2值為0.965 1，校正后決定系數(shù)R2Adj值為0.930 1，說(shuō)明該模型能夠解釋93.01%試驗(yàn)數(shù)據(jù)響應(yīng)值的變化。此外，AB、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)多糖的提取量影響差異極顯著，B、C、AC、BD對(duì)多糖提取量影響高度顯著，A對(duì)多糖提取量影響顯著，D、AD、BC項(xiàng)不顯著（P＞0.05），需將此3 項(xiàng)從回歸模型中刪除。因此，回歸模型方程最終為Y=61.81+0.96A+1.24B+1.50C-7.04AB+1.95AC+2.60BD+3.93CD-4.88A2-3.2B2-4.75C2-2.64D2。

2.1.3 交互作用分析

圖2 各因素交互作用對(duì)梨渣多糖提取量影響的響應(yīng)面圖Fig. 2 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on the extraction efficiency of polysaccharides

由圖2a可知，多糖提取量分別隨著超聲時(shí)間和溶劑用量的增加呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)之后趨于平緩，兩者的交互作用顯著。由圖2b可知，超聲功率和料液比對(duì)多糖提取量的影響均呈拋物線趨勢(shì)，即隨超聲功率和溶劑用量的增加，多糖提取量呈先升高后降低的趨勢(shì)，兩者交互作用曲面較陡，即對(duì)多糖提取量影響顯著。由圖2e可知，多糖提取量隨超聲溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)先升高最后趨于平穩(wěn)，且多糖提取量隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)大于超聲溫度的變化，說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)多糖提取量的影響較大。由圖2f可知，多糖提取量隨超聲功率的增加先上升后下降，呈現(xiàn)拋物線的趨勢(shì)，而隨超聲溫度的升高先上升后趨于平緩，兩因素的交互曲面較陡，說(shuō)明兩因素的交互作用顯著。

2.1.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)Design-Expert優(yōu)化后得到的最優(yōu)條件為料液比1∶13.26（g/mL）、超聲時(shí)間60 min、超聲功率131.99 W、超聲溫度57.08 ℃，此時(shí)多糖提取量的理論值最高為62.680 1 mg/g。為驗(yàn)證最優(yōu)條件的準(zhǔn)確性，考慮到實(shí)際操作的可行性，設(shè)定最優(yōu)條件為料液比1∶13（g/mL）、超聲時(shí)間60 min、超聲功率132 W、超聲溫度57 ℃，在此條件下進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后測(cè)得多糖提取量的平均值為62.375 mg/g，與理論值接近，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可靠，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)測(cè)定，水浴醇沉法在Design-Expert優(yōu)化后得到的最優(yōu)條件（料液比1∶35（g/mL）、溫度67 ℃、時(shí)間3.7 h）下，測(cè)得多糖提取量的最大值為56.879 9 mg/g，低于62.375 mg/g，且超聲輔助提取法具有省時(shí)、高效、便于操作等優(yōu)點(diǎn)，故綜合考慮選取超聲輔助法提取黃梨渣多糖。

2.2 梨渣多糖脫蛋白結(jié)果

圖3 脫蛋白方法對(duì)多糖的影響Fig. 3 Effects of deproteinization methods on protein removal and polysaccharide loss

由圖3可以看出，單獨(dú)使用Sevag法脫蛋白，可以去除51.16%蛋白質(zhì)，此方法使用次數(shù)多、耗時(shí)長(zhǎng)、有機(jī)試劑用量大、多糖損失率高；單獨(dú)使用木瓜蛋白酶法脫蛋白，多糖損失率降低到22.39%的同時(shí)可去除56.82%的蛋白質(zhì)，這是由于木瓜蛋白酶可以起到降解蛋白質(zhì)的作用；在酶法基礎(chǔ)之上再進(jìn)行5 次Sevag法脫蛋白后，蛋白脫除率為75%且多糖損失率僅為24.71%。故用酶法和Sevag法聯(lián)合除蛋白可達(dá)到簡(jiǎn)化操作工藝、省時(shí)、最大限度去除蛋白質(zhì)[22]的同時(shí)保證多糖得率的目的。因此，該方法是一種去除蛋白較為理想的方法。

2.3 梨渣多糖的脫色結(jié)果

圖4 脫色方法對(duì)多糖的影響Fig. 4 Effects of decolorization methods on decoloraization rate and polysaccharide loss

由圖4可以看出，H2O2法脫色率最高，可達(dá)78.56%，且多糖損失率最低，僅25.86%。由于活性炭對(duì)色素吸附具有特異性，所以活性炭脫色率較低，多糖損失率高達(dá)54.35%，用反膠束溶液法脫色時(shí)，脫色率僅47.69%且多糖損失率較高。H2O2法脫色通過(guò)氧化色素來(lái)達(dá)到脫色目的，脫色效果好，操作簡(jiǎn)單，能最大限度地降低多糖損失率[14]，因此，選用H2O2法對(duì)多糖進(jìn)行脫色。

2.4 多糖的分級(jí)結(jié)果

用苯酚-硫酸法測(cè)定90 管樣品溶液的多糖含量，以試管數(shù)目為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作洗脫曲線圖。從圖5可以看出，脫蛋白、脫色、透析后的梨渣多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析分離得到3 個(gè)峰，表明梨渣多糖由3 種不同組分構(gòu)成，分別為L(zhǎng)PB-A、LPB-B和LPB-C，結(jié)果如圖5所示，第23～32管為L(zhǎng)PB-A，第33～38管為L(zhǎng)PB-B，第50～60管為L(zhǎng)PB-C，三組分峰形對(duì)稱較好，說(shuō)明以0～1 mol/L NaCl的Tris-HCl溶液進(jìn)行線性洗脫能較好地分離梨渣多糖。經(jīng)DEAE-52柱分離后LPB-A、LPB-B含量較少，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅對(duì)LPB-C進(jìn)行繼續(xù)研究。

圖5 多糖DEAE-52纖維素柱洗脫曲線Fig. 5 Elution profile of polysaccharides by DEAE-52 cellulose column chromatography

2.5 純度鑒定結(jié)果

2.5.1 Sephadex G-100凝膠柱層析

圖6 LPB-C的Sephadex G-100凝膠柱洗脫曲線Fig. 6 Elution profile of LPB-C on Sephadex G-100 column

如圖6所示，多糖LPB-C經(jīng)過(guò)Sephadex G-100凝膠柱流出的曲線呈單一對(duì)稱峰，說(shuō)明經(jīng)過(guò)一系列處理后多糖LPB-C已經(jīng)被純化，且為相對(duì)分子質(zhì)量分布均一的組分，是一種較純的多糖。

2.5.2 紫外吸收光譜結(jié)果

圖7 梨渣多糖LPB-C的紫外掃描圖Fig. 7 UV absorption spectrum of LPB-C

如圖7所示，多糖的特征吸收峰出現(xiàn)在225 nm波長(zhǎng)處，260 nm和280 nm波長(zhǎng)處沒(méi)有出現(xiàn)吸收峰，表明經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析純化后的多糖不含核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，說(shuō)明LPB-C是一種較純的多糖。

2.5.3 凍融實(shí)驗(yàn)結(jié)果

LPB-C經(jīng)凍融離心后沒(méi)有沉淀出現(xiàn)，表明LPB-C為一種較純的多糖。

綜上可知，3 種方法都證明LPB-C為相對(duì)分子質(zhì)量分布單一的組分，是一種較純的多糖。

2.6 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果

圖8 梨渣精多糖LPB-C的ηsp/c-c圖Fig. 8 ηsp/c versus c plot of LPB-C

多糖分子的不均一性導(dǎo)致其分子質(zhì)量的測(cè)定比較困難，通常所測(cè)得的分子質(zhì)量是一種統(tǒng)計(jì)平均值，只代表一定分子質(zhì)量范圍的平均分布而不是確切大小。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定經(jīng)分離純化后分子質(zhì)量分布比較均一的梨渣多糖LPB-C組分的相對(duì)分子質(zhì)量。如圖8所示，經(jīng)測(cè)定，其特性黏度[η]為1.11 cm3/g，已知在25 ℃時(shí)，K值為2×10-4，α值為0.76，根據(jù)Mark-Houwink公式可求得梨渣多糖LPB-C的黏均分子質(zhì)量為8.47×104g/mol。

2.7 單糖的組成

圖9 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的超高效液相色譜圖Fig. 9 UPLC chromatogram of derivatives of standard monosaccharide mixture

圖10 黃梨渣多糖衍生物的超高效液相色譜圖Fig. 10 UPLC chromatogram of derivatives of LPB-C

將黃梨渣多糖衍生物的超高效液相色譜圖與混合標(biāo)準(zhǔn)單糖進(jìn)行對(duì)比（圖9和圖10）可知，7～12 min的色譜峰為PMP溶劑峰，根據(jù)其出峰時(shí)間可以確定黃梨渣多糖中含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖和木糖，根據(jù)峰面積計(jì)算出4 種單糖的物質(zhì)的量比為3.3∶2.3∶10.6∶23.2。

2.8 紅外光譜分析

圖11 LPB-C的紅外光譜圖Fig. 11 IR spectrum of LPB-C

由圖11可知，LPB-C具有多糖的特征吸收峰：3 376.54、3 234.76 cm-1處為氫鍵的—OH伸縮振動(dòng)吸收峰，說(shuō)明存在分子內(nèi)或分子間氫鍵；2 979.18 cm-1處為糖類的C—H伸縮振動(dòng)吸收峰；1 629.92、1 552.76 cm-1處為C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰；1 464.03 cm-1處的吸收峰為CH3、CH2、CH等的C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)；1 400、1 297 cm-1為—COOH中C—O伸縮振動(dòng)，說(shuō)明存在糖醛酸結(jié)構(gòu)；1 135 cm-1為多糖中糖的醚鍵C—O—C伸縮振動(dòng)吸收峰；1 040 cm-1處為吡喃環(huán)的變形振動(dòng)，說(shuō)明該多糖可能為吡喃型多糖；908 cm-1處為β-D-吡喃葡萄糖的特征吸收峰，說(shuō)明此多糖級(jí)分中含有β糖苷鍵；經(jīng)比對(duì)，663、595 cm-1處可能為鼠李糖的特征吸收峰[18]，說(shuō)明LPB-C中含有鼠李糖。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究黃梨渣中多糖的提取、分離純化的方法，并對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量、單糖組成以及基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。最終確定采用超聲波輔助提取法提取梨渣多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶13（g/mL）、超聲時(shí)間60 min、超聲功率132 W、超聲溫度57 ℃，多糖提取量可達(dá)到62.38 mg/g，比水浴醇沉法的提取量（56.9 mg/g）高，且大大節(jié)省了時(shí)間[27-28]。Sevag法與酶法聯(lián)合除蛋白的方法效果最佳，蛋白脫除率和多糖損失率分別為75%和24.71%，此法簡(jiǎn)化了操作工藝，省時(shí)，最大限度去除蛋白質(zhì)的同時(shí)可保證多糖得率。H2O2法脫色率最高，可達(dá)78.56%，且多糖損失率最低，僅25.86%。脫蛋白、脫色、透析后的梨渣多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析分離得到LPB-A、LPB-B和LPB-C三個(gè)不同的組分，其中LPB-A、LPB-B含量較少，故僅對(duì)LPB-C進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。對(duì)于同一種物質(zhì)，不同方法測(cè)定出的相對(duì)分子質(zhì)量也有所差別，經(jīng)烏氏黏度計(jì)法測(cè)定，LPB-C的黏均分子質(zhì)量約為8.47×104g/mol。用高效液相色譜法[29-31]測(cè)得黃梨渣多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖和木糖組成，且物質(zhì)的量比為3.3∶2.3∶10.6∶23.2，經(jīng)紅外光譜法分析進(jìn)一步得出其是一種含有β糖苷鍵的吡喃型多糖，這為高平黃梨進(jìn)一步研究和綜合開(kāi)發(fā)利用提供了一定參考價(jià)值。