于冬蕾，李婷婷，吳海波,2，朱秀清,2,*，石彥國*，萬兆祥，劉春成

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150028；3.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

高溫豆粕是由大豆浸油后，經(jīng)高溫脫溶而得的副產(chǎn)品，它含有大豆中全部蛋白質(zhì)，具有很高的開發(fā)和利用價值[1]。但由于煉油工藝中高溫脫溶步驟造成蛋白質(zhì)的熱變性，導致其蛋白質(zhì)溶解性較差。目前高溫豆粕主要用作飼料，少量用于發(fā)酵食品，未能發(fā)揮其潛在的應用價值，造成了資源的浪費[2]。

酶法處理是改善豆粕營養(yǎng)品質(zhì)的有效方法，其作用條件溫和，不但能夠破壞或消除豆粕中的抗營養(yǎng)因子，且可將豆粕中蛋白質(zhì)等降解為小分子物質(zhì)，在提升生物效價的同時賦予更多的生物活性[3-4]。已有研究表明，酶解高溫豆粕獲得的小分子活性物質(zhì)具有較高的抗氧化活性[5]。近年來，生物小分子抗氧化物質(zhì)以其分子質(zhì)量小、易吸收、活性高等特點越來越受到人們的青睞，成為研究的熱點之一[6-9]。

超聲波在介質(zhì)中傳播時，會產(chǎn)生熱效應、機械效應和空化效應，引起介質(zhì)的一些特性變化[10]。因為上述特性，在促進活性成分的提取[11]、輔助酶解[12]和促進蛋白乳化[13]等方面起到顯著的效果，其中最為顯著的是在超聲輔助酶解方面，可以縮短酶解時間、提高酶解效率、增加產(chǎn)物得率[14]。目前已經(jīng)將超聲輔助酶解法應用到大豆[15]、麥麩[16]、紅豆[17]、核桃[18]以及花生[19]等植物中以制備得到抗氧化活性物質(zhì)。

抗氧化性在食品中主要用于阻止或延緩油脂的自動氧化，還可防止食品在貯藏中因氧化而使營養(yǎng)損壞、褐變、褪色等[20]。因此，開發(fā)和利用天然食物源抗氧化物質(zhì)成為目前科研領域的研究熱點。近年來，相繼有學者以豆粕為原料，采用發(fā)酵[21]以及酶解[22]等方法制備抗氧化物質(zhì)。趙亞琦等[23]研究發(fā)現(xiàn)豆粕固態(tài)發(fā)酵-酶解產(chǎn)物能夠保持肉丸色澤，有效地抑制脂肪氧化及蛋白氧化，并減緩pH值上升，在4 ℃冷藏條件下可保質(zhì)至13 d，顯著延長貨架期。目前對超聲輔助酶解制備高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物的研究較少。

本研究以高溫豆粕為原料，采用超聲輔助酶解法制備抗氧化產(chǎn)物，在單因素試驗基礎上，通過響應面分析法對超聲輔助酶解工藝進行優(yōu)化，然后對酶解產(chǎn)物依次進行乙醇沉淀、DEAE-Cellulose52離子交換層析、SephadxeG-25凝膠色譜層析分離純化以及抗氧化性研究，不僅提高了酶解速率，還使其產(chǎn)物抗氧化性增強，為高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物的實際生產(chǎn)及其在食品領域的開發(fā)與應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

過8 0 目篩后的高溫豆粕粉（其含蛋白質(zhì)（39.24±0.67）%、水分（8.69±0.77）%、灰分（6.23±0.21）%、粗脂肪（1.24±0.39）%） 黑龍江省哈高科大豆食品有限公司；纖維素酶（酶活力（368 250±72.2） U/g） 上海國藥集團化學試劑有限公司；堿性蛋白酶（酶活力（15 963±25.1）U/g） 丹麥諾維信公司；中性蛋白酶（酶活力（95 248±63.8） U/g）上海金穗生物科技有限公司；酸性蛋白酶（酶活力（15 966±22.1） U/g） 天津奧博星生物公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

JY92-11N超聲細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司；TU-1901雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；蛋白質(zhì)純化儀 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物的制備及其得率計算

制備步驟：高溫豆粕→超聲波同步纖維素酶酶解→蛋白酶水解→酶滅活→調(diào)節(jié)pH值至4.5→離心取上清液→乙醇沉淀（加入體積分數(shù)75%乙醇溶液，4 ℃保存，靜置48 h）→沉淀復溶→過濾→濃縮→DEAE Cellulose 52離子交換層析→Sephadex G-25凝膠色譜層析→冷凍干燥→高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物。按公式（1）計算抗氧化產(chǎn)物的提取得率：

式中：m1為抗氧化產(chǎn)物質(zhì)量/g；m2為高溫豆粕總質(zhì)量/g。

1.3.2 可溶性多肽含量測定

取1 mL上清液加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，室溫放置30 min后5 000×g離心10 min，利用快速Lowry法蛋白含量測定試劑盒測定多肽含量，以牛血清白蛋白為標準品。標準曲線方程為y=0.380 3x+0.101 9（R2=0.996 9）。可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)按公式（2）計算：

式中：N1為上清液蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為加入蒸餾水體積/mL；m為高溫豆粕總質(zhì)量/g。

1.3.3 可溶性多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[24]，以葡萄糖為標準品。標準曲線為y=13.293x+0.045 5（R2=0.991 8），線性范圍為0.020～0.100 mg/mL?？扇苄远嗵琴|(zhì)量分數(shù)按公式（3）計算：

式中：N2為上清液多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為加入蒸餾水體積/mL；m為高溫豆粕總質(zhì)量/g。

1.3.4 水解度的測定

總氮的測定采用凱氏定氮法[25]。游離氨基氮測定采用甲醛滴定法[26]。水解度按公式（4）計算：

1.3.5 鐵離子還原力的測定

使用S0116總抗氧化能力檢測試劑盒進行測定。

1.3.6 超氧陰離子自由基清除能力的測定

使用A052抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒進行測定。

1.3.7 超聲波同步纖維素酶酶解高溫豆粕工藝

1.3.7.1 超聲波處理

樣品制備：準確稱取一定質(zhì)量的高溫豆粕溶于100 mL水中，用0.1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值為中性，升溫加熱60 ℃，磁力攪拌2 h。然后用0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH值為4.5，離心（4 000×g，20 min），取上清液用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，對其進行可溶性多肽和可溶性多糖含量的測定。

將高溫豆粕充分溶解，用0.1 mol/L檸檬酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至4.2，加入已活化的纖維素酶，酶解3 h。用0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為4.5，離心（4 000×g，20 min），取上清液用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，對其進行可溶性多肽和可溶性多糖含量的測定。

超聲處理順序：將高溫豆粕充分溶解，在超聲功率200 W條件下處理10 min（按工作3 s、間歇3 s進行）。然后用0.1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4.2，加入已活化的纖維素酶，酶解3 h。

充分溶解高溫豆粕，用0.1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4.2，加入已活化的纖維素酶，在超聲功率200 W、超聲時間10 min條件下進行纖維素酶酶解。用0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為4.5，離心（4 000×g，20 min），取上清液用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，對其進行可溶性多肽和可溶性多糖含量測定。

1.3.7.2 超聲功率、超聲時間對高溫豆粕的影響

充分溶解高溫豆粕，用0.1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4.2，加入已活化的纖維素酶并進行超聲處理，超聲功率分別為100、200、300、400 W；超聲時間分別為10、20、30、40 min。超聲結(jié)束后，用0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為4.5，離心（4 000×g，20 min），取上清液用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，然后對其進行可溶性多肽和可溶性多糖含量的測定。

1.3.7.3 纖維素酶酶解工藝單因素試驗

調(diào)節(jié)高溫豆粕質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10 g/100 mL，用0.1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4.2，加入已活化的纖維素酶并進行超聲處理，超聲功率300 W、超聲時間20 min。超聲結(jié)束后，同1.3.7.2節(jié)方法處理。

高溫豆粕質(zhì)量濃度為10 g/100 mL，用0.1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4.2，加入已活化的纖維素酶，纖維素酶添加量分別為300、600、900、1 200、1 500 U/g，并進行超聲處理，超聲功率300 W、超聲時間20 min。超聲結(jié)束后，同1.3.7.2節(jié)方法處理。

高溫豆粕質(zhì)量濃度為10 g/100 mL，0.1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，加入已活化的纖維素酶600 U/g，并進行超聲處理，超聲功率300 W、超聲時間20 min。超聲結(jié)束后，同1.3.7.2節(jié)方法處理。

1.3.7.4 纖維素酶酶解工藝響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken 3因素3水平試驗設計原理進行響應面優(yōu)化試驗，因素與水平見表1。

表1 纖維素酶酶解工藝Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design for cellulose hydrolysis

1.3.8 蛋白酶水解高溫豆粕工藝技術優(yōu)化

1.3.8.1 蛋白酶制劑的選擇

經(jīng)過超聲波纖維素酶預處理的高溫豆粕，分別加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，在相同的酶添加量、酶解時間，進行反應，水浴滅活。重復3 次，測定可溶性多肽和可溶性多糖的含量。

1.3.8.2 堿性蛋白酶水解高溫豆粕的單因素試驗設計

在酶解時間3 h、酶解溫度50 ℃、酶解pH 8.0條件下，考察堿性蛋白酶添加量（15 000、30 000、45 000、60 000、75 000 U）對可溶性多糖、可溶性多肽以及水解度的影響。

在堿性蛋白酶添加量60 000 U、酶解時間3 h、酶解溫度50 ℃條件下，考察酶解pH值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）對可溶性多糖、可溶性多肽以及水解度的影響。

在堿性蛋白酶添加量60 000 U、酶解溫度50 ℃、酶解pH 9.0條件下，考察酶解時間（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h）對可溶性多糖、可溶性多肽以及水解度的影響。

在堿性蛋白酶添加量60 000 U、酶解時間3 h、酶解pH 9.0條件下，考察酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）對可溶性多糖、可溶性多肽以及水解度的影響。

1.3.8.3 堿性蛋白酶水解高溫豆粕的響應面試驗優(yōu)化方案

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken 3因素3水平試驗設計原理進行響應面優(yōu)化試驗，因素與水平見表2。

表2 堿性蛋白酶酶解工藝Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design for protein hydrolysis

1.3.9 高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物的分離與純化

取高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物粗品若干，用0.01 mol/L Tris-HCl（pH值為7.2）緩沖液溶解，上蛋白質(zhì)純化儀，分兩步進行抗氧化產(chǎn)物的分離與純化。首先以DEAE Cellulose 52離子交換樹脂為填料，依次用含有0.1、0.25、0.5 mol/L NaCl的0.01 mol/L Tris-HCl（pH 7.2）緩沖液進行梯度洗脫，上樣質(zhì)量濃度為10 mg/mL，上樣體積為10 mL，流速為1 mL/min，洗脫液流速為2 mL/min，收集器的裝液量為10 mL/管。每一管測定波長208 nm處的多肽吸收，隔管測定波長490 nm處的多糖吸收，收集二者的重合峰，濃縮，透析除鹽，冷凍干燥后測定其鐵離子還原力和超氧陰離子自由基清除能力。

然后將DEAE-Cellulose52離子交換層析后抗氧化活性較好的產(chǎn)物配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，以Sephadex G-25凝膠為填料，用蒸餾水洗脫，上樣量為10 mL，洗脫速率為1 mL/min，收集器的裝液量為10 mL/管。每一管測定波長208 nm處的多肽吸收，檢測波長490 nm處的多糖含量，收集二者重合的峰，凍干后測定其鐵離子還原力和超氧陰離子自由基清除能力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0繪圖軟件、SPSS 11.5分析軟件、Microsoft Excel 2013對數(shù)據(jù)進行處理與分析，數(shù)據(jù)重復3 次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波同步纖維素酶處理高溫豆粕工藝

2.1.1 超聲波處理結(jié)果

圖1 超聲波纖維素酶對高溫豆粕可溶性多肽（A）、可溶性多糖（B）提取的影響Fig. 1 Effects of ultrasonic-assisted cellulose extraction on the extraction efficiency of soluble polypeptide (A) and polysaccharide (B)from soybean meal

如圖1所示，經(jīng)過超聲波同步纖維素酶處理的高溫豆粕，其可溶性多肽和可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)分別為（6.11±0.49）%和（7.26±0.27）%，顯著高于（P＜0.05）其他處理方式的可溶性多肽以及多糖含量，這說明超聲對于纖維素酶酶解具有一定的促進作用，故選擇超聲波同步纖維素酶處理工藝進行后續(xù)試驗。

2.1.2 超聲條件對高溫豆粕水解效果的影響

圖2 超聲功率、超聲時間對高溫豆粕水解的影響Fig. 2 Effects of ultrasonic power and irradiation time on the extraction efficiency of soluble polysaccharide and polypeptide from soybean meal

如圖2所示，在超聲功率100～400 W條件下，隨著超聲功率的增加，高溫豆粕可溶性多肽含量和可溶性多糖含量呈現(xiàn)相同趨勢，先升高后降低。這說明，在一定的超聲功率內(nèi)，超聲波可以有效破壞高溫豆粕的細胞壁，加快纖維素酶水解，使大分子纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性多糖，同時促進包裹在大分子纖維素里的可溶性物質(zhì)溶出，使可溶性多糖以及多肽含量增加。但是超聲功率過強可能導致細胞及溶液局部溫度增加過快，破壞多肽和多糖的結(jié)構。此外，較高的超聲功率會產(chǎn)生瞬時空化作用，使酶分子結(jié)構被破壞，導致酶活力下降[27]，也會影響可溶性多肽和可溶性多糖的含量。

超聲作用能夠縮短反應時間，在超聲功率300 W條件下，超聲處理20 min的大豆肽含量顯著高于（P＜0.05）其他處理時間，可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)為（14.63±1.56）%，可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)為（6.64±0.56）%。在一定的超聲時間范圍內(nèi)，處理時間越長，酶催化反應效果越好，超出范圍后，可能會使酶催化效果下降，可能更長時間超聲波促進了蛋白質(zhì)變性、聚合的發(fā)生。綜上所述，選擇超聲功率300 W、超聲時間20 min進行下一步試驗。

2.1.3 纖維素酶酶解工藝單因素試驗結(jié)果

2.1.3.1 底物質(zhì)量濃度對高溫豆粕的影響

圖3 底物質(zhì)量濃度對高溫豆粕水解的影響Fig. 3 Effect of substrate concentration on the extraction efficiency of soluble polysaccharide and polypeptide from soybean meal

如圖3所示，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，多肽含量及多糖含量呈現(xiàn)先升高到趨于平穩(wěn)的趨勢，當?shù)孜镔|(zhì)量濃度為8 g/100 mL時，可溶性多肽（（17.44±0.42）%）和可溶性多糖（（10.92±0.08）%）質(zhì)量分數(shù)為最大值。這是由于在低底物質(zhì)量濃度情況下，酶解速率降低，酶解效果不佳，但過量則不利于高溫豆粕的充分溶解和酶的水解反應進行，造成可溶性多肽和可溶性多糖提取效果上升不明顯。因此，較適宜的底物質(zhì)量濃度確定為8 g/100 mL左右。

2.1.3.2 纖維素酶添加量對高溫豆粕的影響

從圖4可以看出，隨著纖維素酶添加量的增加，高溫豆粕可溶性多肽和可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)表現(xiàn)為先升后降的趨勢，當纖維素酶的添加量為600 U/g時，高溫豆粕可溶性多肽和可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)最高，分別為（18.44±0.89）%和（10.61±0.32）%，故纖維素酶添加量確定在600 U/g左右最佳。

圖4 纖維素酶添加量對高溫豆粕水解的影響Fig. 4 Effect of cellulase dosage on the extraction efficiency of soluble polysaccharide and polypeptide from soybean meal

2.1.3.3 纖維素酶酶解pH值對高溫豆粕的影響

圖5 pH值對高溫豆粕水解的影響Fig. 5 Effect of hydrolysis pH value on the extraction efficiency of soluble polysaccharide and polypeptide from of soybean meal

如圖5所示，當纖維素酶酶解pH值為4.0時，可溶性多肽和可溶性多糖的質(zhì)量分數(shù)分別為（17.59±0.42）%和（10.53±0.69）%，高于其他pH值條件下可溶性多肽和多糖的含量。這可能由于溶液pH值是決定酶催化活性的重要參數(shù)之一，一方面過酸過堿可改變酶的空間構象，使酶失活；另一方面，pH值還可以改變反應底物的解離狀態(tài)，影響其與酶的結(jié)合[28]。故酶解pH值確定為4.0左右為宜。

2.1.4 Box-Behnken試驗設計結(jié)果及響應面試驗分析

以可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)為響應值，依據(jù)Box-Behnken設計因素水平編碼值，測定結(jié)果見表3。

采用Design-Expert 8.0軟件進行回歸擬合，去除不顯著的因素，得到各試驗因素對響應值影響的回歸方程為R=10.81+0.17A+0.18B+0.11C-0.055AB-0.077AC+0.035BC-0.42A2-0.37B2-0.27C2。

對模型采用方差分析，由表4可知，一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2表現(xiàn)為差異極顯著；交互項AB、BC差異不顯著；AC為差異顯著。模型具有極顯著性（P＜0.01），因變量與所考察的自變量之間的線性關系顯著（R2=0.991 7），模型調(diào)整確定系數(shù)為0.981 0，該模型擬合程度良好，失擬項（P=0.059 3＞0.05）差異不顯著，說明所得的回歸方程可行度高，可以用于預測纖維素酶酶解高溫豆粕工藝參數(shù)。

表3 纖維素酶酶解工藝Box-Behnken試驗設計方案及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results for optimization of cellulase hydrolysis

表4 纖維素酶酶解工藝二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for the fi tted quadratic response surface regression model describing cellulase hydrolysis

按照回歸方程優(yōu)化結(jié)果，計算得最佳工藝條件為底物質(zhì)量濃度8.36 g/100 mL、纖維素酶添加量666 U/g、酶解pH值4.1，響應面模型指標值為10.85%。依據(jù)最佳工藝，進行驗證實驗5 次，測出可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)的均值為（10.83±0.32）%，實際值與模型值的誤差絕對值小于5%，t檢驗差異不顯著（P＞0.05），說明可以使用響應面試驗優(yōu)化設計模型參數(shù)，作為實際的酶解工藝，并且在最優(yōu)條件下可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)為（18.51±0.36）%。

2.2 蛋白酶水解高溫豆粕工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 蛋白酶的選擇結(jié)果

圖6 不同酶制劑對高溫豆粕可溶性多肽（A）、可溶性多糖（B）提取的影響Fig. 6 Effect of different proteases on the extraction efficiency of soluble polypeptide (A) and polysaccharide (B) from soybean meal

如圖6所示，經(jīng)過超聲波-纖維素酶處理后的高溫豆粕溶液分別進行3 種蛋白酶處理，相同條件酶添加量和酶解時間，堿性蛋白酶對高溫豆粕多肽的影響顯著高于（P＜0.05）其他2 種酶，堿性蛋白酶在酶解時間1、2、3 h的可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)分別為（22.41±80.72）%、（21.76±0.67）%、（22.74±0.53）%，可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)分別為（11.458±0.29）%、（12.08±0.71）%、（12.32±0.48）%。這是由于堿性蛋白酶是一種內(nèi)切型的絲氨酸蛋白酶，一般在芳香族或疏水性氨基酸（如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）的羧基發(fā)生水解[29-30]。而大豆中7S和11S球蛋白為主要大豆蛋白，堿性氨基酸的含量占大部分，因此更易于被堿性蛋白酶作用，并且水解所產(chǎn)生的斷裂位點比其他酶多。綜上所述，選取堿性蛋白酶進行下一步試驗。

2.2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.2.1 堿性蛋白酶添加量對高溫豆粕的影響

圖7 堿性蛋白酶添加量對高溫豆粕水解的影響Fig. 7 Effect of protease dosage on the extraction efficiency of soluble polysaccharide and polypeptide from soybean meal

從圖7可以看出，隨著加酶量的增大，水解度逐漸上升，當?shù)鞍酌柑砑恿繛?0 000 U時，水解度達到最大，此時高溫豆粕的可溶性多肽和可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)達到最大值，分別為（24.91±0.37）%和（12.57±0.18）%。這是因為在底物質(zhì)量濃度一定時，隨著堿性蛋白酶添加量增多，使酶與蛋白質(zhì)分子接觸機會增多，高溫豆粕中的蛋白質(zhì)水解越充分，生成的小分子多肽越多，多肽含量和水解度隨之上升。但當酶添加量進一步增加時，底物被酶完全飽和，水解度增加緩慢，酶解反應受到抑制。因此，堿性蛋白酶的最適添加量在60 000 U左右。

2.2.2.2 堿性蛋白酶酶解pH值對高溫豆粕的影響

圖8 酶解pH值對高溫豆粕水解的影響Fig. 8 Effect of hydrolysis pH value on the extraction efficiency of soluble polysaccharide and polypeptide from soybean meal

pH值能影響酶活性部位上有關基團的解離，進而影響酶與底物蛋白的結(jié)合與催化，酶只有在其最適的pH值條件下，才能使酶反應速率達到最大[31]。由圖8所示，堿性蛋白酶在較低pH值條件下，高溫豆粕可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)隨水解度的增大呈現(xiàn)增加趨勢，當pH值為9.0時，水解度達到最大，此時的可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)最多，為（23.40±0.49）%，然而pH值繼續(xù)升高，可溶性多肽含量顯著下降（P＜0.05）。因此，堿性蛋白酶的較適宜酶解pH值為9.0。

2.2.2.3 堿性蛋白酶酶解時間對高溫豆粕的影響

圖9 酶解時間對高溫豆粕水解的影響Fig. 9 Effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of soluble polysaccharide and polypeptide from soybean meal

由圖9可以看出，隨著酶解時間延長，水解度和可溶性多肽含量增加，當酶解時間為3 h時，水解度最大，此時的可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)達到最大值（24.23±0.20）%，繼續(xù)延長酶解時間，整體表現(xiàn)為多肽含量先降低后升高最后趨于平緩。故最佳酶解時間確定為3 h左右較為合適。

2.2.2.4 堿性蛋白酶酶解溫度對高溫豆粕的影響

圖10 酶解溫度對高溫豆粕水解的影響Fig. 10 Effect of hydrolysis temperature on the extraction efficiency of soluble polysaccharide and polypeptide from of soybean meal

從圖10可以看出，酶解溫度在55 ℃以內(nèi)，隨著酶解溫度的不斷升高，酶活性增加，同時酶解速度加快，水解度不斷增加，使可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)不斷增加。當酶解溫度為55 ℃時，水解度效果最好，此時的可溶性多肽和可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)最高，分別為（25.33±0.33）%和（13.14±0.39）%。這是由于升高溫度可以加速蛋白質(zhì)分子運動，使蛋白質(zhì)分子間、分子內(nèi)的二硫鍵斷裂，導致亞基結(jié)構伸展[30]；但持續(xù)升高酶解溫度，酶蛋白部分變性，使堿性蛋白酶鈍化失活，降低酶的催化能力，并且溫度過高，也會使蛋白分子發(fā)生折疊-聚合以至于聚合體增多[32]，導致可溶性多肽和多糖含量下降。因此，最佳的酶解溫度確定為55 ℃左右。

2.2.3 響應面試驗結(jié)果

響應值為可溶性多肽含量，依據(jù)Box-Behnken設計因素水平編碼值，測定結(jié)果見表5。

表5 堿性蛋白酶酶解工藝Box-Behnken試驗設計方案及結(jié)果Table 5 Box-Behnken experimental design and results for optimization alkaline protease hydrolysis

采用Design-Expert 8.0軟件進行回歸擬合，可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)對蛋白酶添加量、酶解pH值、酶解時間和酶解溫度的二次多項回歸模型為Y=25.46+0.14X1+0.048X2+

表6 堿性蛋白酶酶解工藝二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance for the fi tted quadratic response surface regression model describing alkaline protease hydrolysis

如表6所示，模型的一次項X4、交互項X1X2、X2X3、X2X4和二次項X12、X22、X32、X42差異極顯著；X1、X1X3、X3X4差異顯著；X2、X3、X1X4差異不顯著。模型為極顯著（P＜0.01），因變量與所考察的自變量之間線性關系顯著（R2=0.954 8），調(diào)整確定系數(shù)R2Adj為0.913 5，該模型擬合程度良好，失擬項（P=0.549 7＞0.05）差異不顯著，說明所得的回歸方程可行度高，可以用于預測蛋白酶酶解工藝。

按照回歸方程優(yōu)化出的工藝條件，蛋白酶添加量61 900 U、酶解pH 9、酶解時間3 h、酶解溫度56.4 ℃，響應面模型指標值為25.51%。驗證實驗重復5 次，獲得可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)為（25.47±0.81）%，實際值與預測值的誤差絕對值小于5%，t檢驗差異不顯著（P＞0.05）。在最佳工藝條件下，計算得到高溫豆粕的水解度為（33.51±0.42）%，說明運用響應面優(yōu)化設計出的模型參數(shù)準確，可應用實際的酶解實驗中，同時在最優(yōu)條件下可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)為（13.22±0.49）%。

2.3 高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物的分離與純化

2.3.1 離子交換層析結(jié)果

圖11 DEAE-Cellulose 52離子交換層析Fig. 11 DEAE-Cellulose 52 anion-exchange chromatography

如圖1 1所示，高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物粗品經(jīng)DEAE Cellulose 52離子交換層析分離出3 種混合物，分別為抗氧化產(chǎn)物a1、a2和a3，其分別對應第10、23、36管，且每管收集到的量為10 mL。

圖12 高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物的抗氧化能力Fig. 12 Antioxidant activity of different antioxidant products from highly denatured soybean meal

如圖12所示，3 種混合物的抗氧化效果存在顯著差異。在相同濃度情況下，a2的鐵離子還原力和超氧陰離子自由基清除能力，顯著高于（P＜0.05）同一水平的a1、a3，且隨著a1、a2、a3產(chǎn)物濃度增加其抗氧化能力也增強。因此選擇具有抗氧化能力較強的抗氧化產(chǎn)物a2進行下一步分離純化。

2.3.2 凝膠色譜層析結(jié)果

圖13 Sephadex G-25凝膠色譜層析Fig. 13 Sephadex G-25 gel chromatography

如圖13所示，抗氧化產(chǎn)物a2經(jīng)Sephadex G-25柱層析分離后獲得2 種產(chǎn)物，即抗氧化產(chǎn)物a2b1、a2b2，且2 種產(chǎn)物在波長208 nm和490 nm處均有吸收峰。

圖14 高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物組分的抗氧化能力Fig. 14 Antioxidant activity of different antioxidant products from highly denatured soybean meal

如圖14所示，在相同條件下，a2b1的鐵離子還原力和超氧陰離子自由基清除能力顯著高于（P＜0.05）a2b2，因此a2b1為本研究所提取的高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物。經(jīng)計算，其提取得率為2.18%，其中可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)為（61.28±0.83）%，可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)為（29.76±0.26）%，糖肽復合物質(zhì)量分數(shù)為（8.96±0.55）%。

2.3.3 抗氧化能力測定結(jié)果

表7 高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物的抗氧化能力Table 7 Antioxidant capacity of the hydrolysate of highly denatured soybean meal

如表7所示，當?shù)孜镔|(zhì)量濃度為1 mg/mL時，高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物與高溫豆粕相比較，其鐵離子還原力和超氧陰離子自由基清除能力顯著提高（P＜0.05）。這說明，高溫豆粕經(jīng)過超聲、酶解以及分離純化處理，其變性蛋白質(zhì)被分解成多肽和短肽，使蛋白結(jié)構中具有抗氧化能力的基團（如巰基、咪唑基、酚羥基等）暴露出來；這些基團具有清除自由基，抑制氧化降解的作用，從而使高溫豆粕表現(xiàn)出更強抗氧化活性[32]。

3 結(jié) 論

本實驗采用超聲波復合酶制劑處理高溫豆粕，依次進行乙醇沉淀、DEAE-Cellulose52離子交換層析、SephadxeG-25凝膠色譜層析純化，制備高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物，拓展了高溫豆粕在食品領域的開發(fā)與利用。

超聲波-纖維素酶處理高溫豆粕工藝最優(yōu)條件為超聲功率300 W、超聲時間20 min、底物質(zhì)量濃度8.36 g/100 mL、纖維素酶添加量666 U/g、酶解pH 4.1，可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)為（18.51±0.36）%，可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)為（10.83±0.32）%。

堿性蛋白酶酶解工藝條件為蛋白酶添加量61 900 U、酶解pH 9、酶解時間3 h、酶解溫度56.4 ℃，可溶性多肽質(zhì)量分數(shù)為（25.47±0.81）%，可溶性多糖質(zhì)量分數(shù)為（13.22±0.49）%。

高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物提取工藝：采用75%乙醇溶液沉淀粗品糖肽，透析、濃縮，利用DEAE-Cellulose52離子交換層析分離、純化3 種產(chǎn)物，分別為抗氧化產(chǎn)物a1、a2和a3，并對3 種產(chǎn)物進行抗氧化活性的測定，選擇具有抗氧化能力較強的抗氧化產(chǎn)物a2進一步分離純化；采用Sephadex G-25凝膠色譜層析分離、純化后獲得篩選具有抗氧化產(chǎn)物a2b1和a2b2，進行抗氧化活性的測定，抗氧化產(chǎn)物a2b1為本研究所提取的具有抗氧化功能的水溶性高溫豆粕抗氧化產(chǎn)物。經(jīng)計算，其提取得率為2.18%，并且當其質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，其鐵離子還原力和超氧陰離子自由基清除能力分別為（0.495±0.042）mmol/g和（17.02±0.22）U/g。