陳蘭煊，楊 陽，易翠平*

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114）

淀粉粒結(jié)合蛋白（starch granule-associated proteins，SGAPs）是指緊密結(jié)合于淀粉表面及內(nèi)部、具有顯著特征的一類蛋白質(zhì)[1]，占秈米質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.2%～0.5%；它不同于普通蛋白，多以酶的形式存在于淀粉顆粒中決定其結(jié)構(gòu)及形態(tài)[2]，并對淀粉的糊化特性[3]、顆粒性質(zhì)及整個谷物體系的品質(zhì)有著重要影響[4]，以顆粒淀粉合成酶（granule-bound starch synthase，GBSS）最為典型[5-6]。但由于秈米SGAPs含量低、組分復(fù)雜，又與淀粉顆粒結(jié)合緊密[7-8]，相關(guān)研究不易開展，關(guān)于秈米中SGAPs研究鮮有報道，國內(nèi)外研究主要集中在小麥和玉米等谷物中。目前，谷物SGAPs的分離主要采用NaCl溶液、2-丙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和二硫蘇糖醇等強(qiáng)極性溶液進(jìn)行攪拌浸泡[9-12]；但文獻(xiàn)[13-15]指出，這種分離方法并不能將小麥SGAPs全部提取，Sargeant等[15]報道采用NaCl溶液僅能提取小麥總SGAPs的10%，Turnbull等[14]證明采用10% SDS溶液提取小麥SGAPs效率更高。因此，本研究擬采用SDS緩沖液提取秈米SGAPs，對所提取SGAPs進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatographtandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）鑒定；以響應(yīng)面法優(yōu)化SDS添加量、沸水浴時間、不同金屬離子對秈米SGAPs分離純化的工藝條件。為進(jìn)一步分離及分析SGAPs組分對秈米基本品質(zhì)的影響提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈米：浙富802；SDS、丙三醇（甘油）、2-巰基乙醇、乙醇、三（羥甲基）氨基甲烷、溴酚藍(lán)、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)G250、N,N-亞甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；過硫酸銨（分析純） 西隴科學(xué)股份有限公司；乙酸、甲醇、磷酸（均為分析純） 廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOF?5600 HPLC-MS/MS儀、Eksigent nanoLC-Ultra? 2D納升液相系統(tǒng) 美國AB SCIEX公司；5418R型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Savant DNA120離心濃縮儀 美國Thermo Fisher公司；UV-2800型分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；AVY120型分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；DK-2000-L型恒溫水浴鍋、FW100型萬能粉碎機(jī)、HJ-1型磁力攪拌器 天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9140A型鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DYCZ型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 秈米淀粉制備

取過100 目的脫脂秈米粉，以0.045 mol/L NaOH溶液洗去蛋白，重復(fù)5 次，3 500 r/min離心，得到上層黃淀粉糊、中層白淀粉、下層黃淀粉（以下簡稱上、中、下層），用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值中性，洗滌、離心、低溫烘干，4 ℃貯藏備用[16-17]。

1.3.2 SDS-PAGE分析蛋白亞基

根據(jù)Laemmli[18]的方法：采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，分離膠12%，濃縮膠4%，膠板厚度1.0 mm，進(jìn)樣量15 μL，在80 V穩(wěn)流電壓下電泳，樣品條帶至膠板底部1 cm左右停止，采用考馬斯亮藍(lán)G250染色約4 h，脫色至條帶清晰。

1.3.3 HPLC-MS/MS鑒定

樣品經(jīng)SDS-PAGE得到60 kDa亞基條帶，經(jīng)胰蛋白酶充分酶解得到上清液，離心濃縮干燥后得到胰酶切多肽[19-21]。將胰酶切多肽溶解入Nano-RPLC流動相A（0.1%甲酸溶液，2%乙腈溶液），裝瓶上樣到C18預(yù)柱（100 μm×3 cm，3 μm，150 ?），進(jìn)行在線HPLC-MS/MS分析：流動相流速2 μL/min、10 min，液相采用C18反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm，120 ?，Chrom XP Eksigent）分離，梯度洗脫為60 min內(nèi)流動相B（0.1%甲酸，95%乙腈溶液）由5%升高至40%。質(zhì)譜采用Triple TOF?5600系統(tǒng)結(jié)合納升噴霧III離子源，噴霧電壓為2.3 kV，氣簾氣壓為30 psi，霧化氣壓為5 psi，加熱溫度為150 ℃，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下，一級飛行時間質(zhì)譜單張圖譜掃描時間為250 ms，每次采集工作模式循環(huán)下最多采集35 個電荷為2+到5+且單秒計數(shù)大于200 cps的二級圖譜，每張二級圖譜的累積時間為60 ms。每次循環(huán)時間固定為2.5 s，碰撞室能量設(shè)定適用于所有前體離子碰撞誘導(dǎo)解離，動態(tài)排除設(shè)置為12 s，約等于色譜半峰寬。

1.3.4 SGAPs的分離純化

1.3.4.1 SGAPs的提取及測定

分別取1.0 0 g樣品，加入S D S提取液（3%～12% SDS，5%巰基乙醇，10%甘油，62.5 mmol/L Tris，pH 6.9），攪拌均勻，沸水浴加熱，冷卻至室溫后15 000 r/min離心15 min，考馬斯亮藍(lán)G250染色法測定上清液的蛋白含量[22]。

1.3.4.2 單因素試驗(yàn)

以樣品煮沸時間3 min、MgSO4濃度0.75 mmol/L、SDS添加量9%為基本條件，改變SDS添加量：3%、5%、7%、9%、10%、12%，樣品煮沸時間：1、2、3、4、5 min，濃度均為0.75 mmol/L的金屬離子緩沖液：NaCl、MgCl2、KCl、CaCl2、Na2SO4、K2SO4、CaSO4、MgSO4，MgSO4濃度：0.25、0.5、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50 mmol/L進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取SGAPs含量為響應(yīng)值，選取SDS添加量、煮沸時間、MgSO4濃度3 個因素，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。各因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007、SPSS軟件進(jìn)行方差分析，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較；HPLC-MS/MS鑒定采用Maxquant軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析，數(shù)據(jù)庫為Uniprot的oryza sativa japonica物種蛋白數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 秈米淀粉蛋白含量

將秈米粉堿洗5 次后得到上、中、下層淀粉3 個樣品，與秈米粉一起，分析其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（表2）。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)由低到高分別是中層、下層、上層、秈米粉，且經(jīng)分離后的3層淀粉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于0.5%，與Koziol等[23]報道SGAPs在秈米淀粉顆粒中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%～0.5%一致，說明殘留淀粉中的蛋白可能是SGAPs。

表2 堿處理秈米粉各組分的蛋白含量分析（n=3）Table 2 Protein content of starch layers of alkali-washed indica rice fl our (dry basis, n= 3)

2.2 蛋白亞基分析

圖1 秈米粉及不同秈米淀粉所提SGAPs的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE image of SGAPs from indica rice fl our and different rice starch layers

將各層淀粉提取的SGAPs及秈米粉蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳（圖1），結(jié)果表明，與秈米粉蛋白亞基對照，3 層淀粉所提的SGAPs基本一致，均只有60 kDa亞基條帶，說明多次堿洗后以SDS緩沖液提取能有效去除其他雜蛋白，得到較純的SGAPs。其中，中層亞基顏色最深，下層次之，上層最淺，與上、中、下3 層淀粉中的蛋白含量呈相反趨勢，說明上層淀粉蛋白中殘留更多的與淀粉分子結(jié)合緊密的儲藏蛋白，如谷蛋白、醇溶蛋白；中層淀粉SGAPs含量最高且更純。

2.3 SGAPs的HPLC-MS/MS鑒定結(jié)果

表3 SDS-PAGE條帶HPLC-MS/MS鑒定結(jié)果Table 3 HPLC-MS/MS analysis of the bands from SDS-PAGE

對電泳分離的60 kDa蛋白條帶通過HPLC-MS/MS法進(jìn)行鑒定[24]，結(jié)果見表3，3層淀粉中的60 kDa蛋白均是以GBSS I為主的SGAPs，其中上層含A型谷蛋白0.58%、B型谷蛋白1.94%、醇溶蛋白0.15%、GBSS I 97.33%；中層淀粉SGAPs含量較為單一，GBSS I 99.80%、B型谷蛋白僅0.11%，可見SDS緩沖液能有效分離出中層淀粉SGAPs；下層淀粉仍以97.51%的GBSS I為主，A型谷蛋白0.15%、B型谷蛋白0.97%、醇溶蛋白0.06%，除此之外還含0.75%的α-ATP合成酶以及參與細(xì)胞代謝、能量調(diào)控及DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的酶類和蛋白，如α伸長因子、60核糖體蛋白L2、NLP1蛋白、丙酮酸磷酸二激酶等。

HPLC-MS/MS結(jié)果表明，以SDS緩沖液從秈米淀粉中分離SGAPs的方式可行，能有效提取出SGAPs，且秈米中的SGAPs以GBSS I為主并以主要生物酶的形式負(fù)責(zé)谷物中的淀粉合成，影響直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例[25]。上、中、下3 層淀粉中以中層淀粉的SGAPs含量最高最純，因此選取中層淀粉進(jìn)行SGAPs提取的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 SDS添加量對SGAPs提取量的影響

圖2 SDS緩沖液添加量對SGAPs提取量的影響Fig. 2 Effect of SDS buffer concentration on the extraction efficiency of SGAPs

如圖2所示，SDS添加量對SGAPs提取量有顯著影響（P＜0.05），隨著SDS添加量加大，SGAPs提取量逐漸升高，當(dāng)SDS添加量為10%時達(dá)到最大提取量，隨著SDS添加量繼續(xù)升高，樣品的SGAPs提取量開始有所下降，是由于SDS分子中的長鏈?zhǔn)杷鶊F(tuán)與蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性基團(tuán)相互作用，打破其原來有序結(jié)構(gòu)[26]，使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，目標(biāo)蛋白變性，從而導(dǎo)致SGAPs的提取量降低。因此，提取秈米中SGAPs的最佳SDS添加量為10%。

2.4.2 煮沸時間對SGAPs提取量的影響

由于SGAPs緊密結(jié)合于淀粉顆粒內(nèi)部，即便是鹽濃度很高的提取液或緩沖液在低溫下都很難進(jìn)入到淀粉分子的內(nèi)部與其作用[27]。利用高溫條件下淀粉顆粒的糊化作用[28]，淀粉顆粒的內(nèi)部SGAPs緩慢膨脹并慢慢暴露，與反應(yīng)試劑發(fā)生作用，由此可以分離純化得到SGAPs[29]。因此煮沸時間對SGAPs的提取有重要影響。由圖3可知，當(dāng)煮沸時間為4 min時SGAPs提取量顯著高于其他條件下提取量（P＜0.05）。而隨著煮沸時間的延長，SGAPs提取量逐漸下降?？赡苁怯捎谝话愕矸垲w粒在溫度達(dá)到50 ℃時開始膨脹，反應(yīng)試劑開始逐漸進(jìn)入淀粉顆粒內(nèi)部，當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時淀粉完全糊化[30]，提取試劑最大程度與SGAPs接觸，此時所用時間為4 min，隨著煮沸時間延長，所提SGAPs由于高溫作用已經(jīng)發(fā)生熱變性，導(dǎo)致在測定SGAPs提取量時呈逐漸減少趨勢。

圖3 煮沸時間對SGAPs提取量的影響Fig. 3 Effect of heating time in boiling water bath on the extraction efficiency of SGAPs

2.4.3 金屬離子對SGAPs提取量的影響

圖4 金屬離子對SGAPs提取量的影響Fig. 4 Effect of metal ions on the extraction efficiency of SGAPs

圖5 MgSO4濃度對SGAPs提取量的影響Fig. 5 Effect of magnesium ion concentration on the extraction efficiency of SGAPs

在SDS緩沖液中分別加入了Na+、K+、Mg2+和Ca2+等陽離子以及不同的陰離子Cl-和后，對淀粉顆粒上的SGAPs進(jìn)行提取。如圖4所示，不同金屬離子對SGAPs的解離有顯著影響（P＜0.05），其中加入MgSO4后從淀粉顆粒上解離的SGAPs最多。由圖5可知，隨著MgSO4濃度的增大，SGAPs提取量呈先增大后減小的趨勢。MgSO4濃度為0～0.75 mmol/L時，SGAPs提取量不斷提高；濃度為0.75 mmol/L時，SGAPs提取量達(dá)到最大；當(dāng)MgSO4濃度大于0.75 mmol/L后，SGAPs提取量逐漸下降。由于共價鍵不隨離子類型與強(qiáng)度的變化而異[31]，秈米SGAPs的解離隨離子類型與強(qiáng)度的變化而變化，因此判斷SGAPs結(jié)合力為非共價鍵。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken設(shè)計試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

表5 中層秈米淀粉提取SGAPs回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the regression model describing the extraction efficiency of SGAPs

從表5可以看出，一次項(xiàng)A、B、C對SGAPs提取量的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；交互項(xiàng)AB、BC達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），交互項(xiàng)AC不顯著（P＞0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。其中模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.220 6＞0.05），模型決定系數(shù)R2值為0.991 9，校正決定系數(shù)值為0.998 3，說明該模型能較好地反映SGAPs提取量與SDS添加量、煮沸時間、MgSO4濃度之間的關(guān)系，由此可見，這種試驗(yàn)方法是可靠的。

圖6 因素交互作用對中層秈米淀粉SGAPs提取量的影響Fig. 6 Response surface plots showing interactive effects of various factors on the extraction efficiency of SGAPs

由表5可知，SDS添加量、煮沸時間與MgSO4濃度均為影響淀粉SGAPs提取量的主要因素，各因素間交互影響分別如圖6所示。SDS添加量與MgSO4濃度交互作用不顯著（圖6b），其余2 組交互顯著，與表5方差分析結(jié)果一致。等高線呈橢圓形，表明煮沸時間與SDS添加量、MgSO4濃度間交互作用對SGAPs提取量有顯著影響，此與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對樣品提取SGAPs的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到SGAPs最優(yōu)提取條件：SDS添加量10.95%、煮沸時間4.14 min、MgSO4濃度0.92 mmol/L。為方便工藝操作，將SGAPs提取最佳條件均修正為SDS添加量10.90%、煮沸時間4.10 min、MgSO4濃度0.90 mmol/L。在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分別得到SGAPs提取量實(shí)測值為（1 028.61±0.05）μg/g，與預(yù)測值1 037.28 μg/g非常接近。

3 結(jié) 論

堿洗秈米粉可以得到上、中、下3 層淀粉，SDS緩沖液提取、HPLC-MS/MS鑒定表明，不同淀粉層中的SGAPs均以GBSS I為主，其中以中層淀粉SGAPs含量最高，達(dá)99.80%。至于秈米粉中的GBSS I是否具有生理活性、在秈米的加工過程中能否因?yàn)槠渖砘钚远鴮Ξa(chǎn)品產(chǎn)生影響尚不得而知。響應(yīng)面優(yōu)化中層淀粉SGAPs提取參數(shù)，結(jié)果表明SDS添加量10.90%、煮沸時間4.10 min、MgSO4濃度0.90 mmol/L，SGAPs的提取量最大，達(dá)（1 028.61±0.05）μg/g。當(dāng)然，這種條件下提取的SGAPs顯然不可能是具有活性的酶，但同樣可以考慮這種SGAPs僅作為蛋白質(zhì)對于秈米基本品質(zhì)的影響，至于具有酶活性的SGAPs分離提取方法，則需要進(jìn)一步研究。