王 強(qiáng)，陸秀云，謝躍杰，任貴禮，劉倩倩，王 波

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 400067；2.西北師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.重慶江源油橄欖開發(fā)有限公司，重慶 404100；4.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000）

角鯊烯又名鯊烯、三十碳六烯，是一種高度不飽和的直鏈三萜類化合物，角鯊烯是重要的天然活性物質(zhì)。角鯊烯最初是從鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，是一種脂質(zhì)不皂化物，其生理功能主要包括抗氧化作用，抗輻射作用，提高體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、抗衰老等；同時(shí)因?yàn)榭鼓[瘤、抗癌活性而應(yīng)用于藥物和保健品中，是一種無毒性的具有防病治病作用的活性物質(zhì)[1-3]。大豆油、菜籽油、棉籽油等植物油中含有少量角鯊烯，但在橄欖油中含量較多[4-6]。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的角鯊烯檢測方法主要是氣相色譜[7-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-16]和液相色譜法[17-23]。采用的預(yù)處理方法除了皂化法外，還有溶劑稀釋法、溶劑分級重結(jié)晶法。國際上僅有的官方發(fā)布的測定角鯊烯含量的方法是AOAC[24]，該方法包含樣品皂化，用大量溶劑萃取不皂化物，通過柱色譜分離以及滴定前的其他處理步驟，整個(gè)檢測過程繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、誤差較大。因此，建立一種快速的檢測方法在實(shí)際樣品檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景。

超高效合相色譜（ultra-performance convergence chromatography，UPC2）是將傳統(tǒng)超臨界流體色譜與超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）的技術(shù)特點(diǎn)相互補(bǔ)充，相比傳統(tǒng)超臨界流體色譜而言，在精密度及穩(wěn)定性上得到大幅度提高，此外，由于UPC2以CO2超臨界流體為流動(dòng)相主體，在色譜保留特性及原理與傳統(tǒng)反相或正相色譜有著很大區(qū)別[25-28]。理論上講，UPC2不僅可分析氣相色譜不適應(yīng)的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的樣品，還能夠?qū)Y(jié)構(gòu)類似物、脂溶性化合物以及熱不穩(wěn)定化合物等多種物質(zhì)進(jìn)行分離[29-32]。

本實(shí)驗(yàn)主要采用UPC2測定植物油中角鯊烯的含量，在2.5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分離。實(shí)驗(yàn)證明，此法快速、樣品預(yù)處理簡便、實(shí)用性強(qiáng)。實(shí)現(xiàn)了植物油中角鯊烯的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物油樣品均購自本地超市，樣品編號及名稱見表1。為防止所取樣品變質(zhì)而影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，樣品均避光冷藏保存。

表1 實(shí)際樣品Table 1 List of actual samples

角鯊烯（純度＞98%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司；CO2（純度＞99.997%） 蘭州匯能公司；其余試劑如無特殊說明則均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPC2儀、Acquity UPLC儀 美國Waters公司；電子天平（±0.01 g） 常熟雙杰測試儀器廠；分析天平（±0.1 mg） 德國Sartorius公司；3K30冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；MS3渦旋儀 德國IKA公司；移液槍（100～1 000、20～100 μL） 美國Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別精確稱取角鯊烯0.21 g，用乙腈溶液準(zhǔn)確定容至100 mL容量瓶中，配制成2 100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冷藏待用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移適量標(biāo)準(zhǔn)貯備液至100 mL容量瓶中，乙腈準(zhǔn)確定容，配制成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃冷藏待用。

1.3.2 樣品處理

方法1（直接稀釋法）：準(zhǔn)確稱取0.10 g植物油樣品于10 mL容量瓶中，正己烷定容至10 mL，混勻后取1.5 mL經(jīng)0.22 μm有機(jī)相膜過濾后裝入進(jìn)樣小瓶中，直接進(jìn)行檢測。

方法2（皂化法）：稱取0.10 g植物油于50 mL試管中，加入10 mL石油醚，搖勻。再加入20 mL 0.3 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液，振搖，在常溫下放置至溶液澄清無油滴，加飽和氯化鈉水溶液至刻度，靜置分層，取上清液1.5 mL經(jīng)0.22 μm有機(jī)相膜過濾后進(jìn)樣。

方法3（滴定法）：除樣品稱樣量稍作改動(dòng)外，其余步驟均按照AOAC Hicial Method 943.04[11]方法進(jìn)行處理。

1.3.3 色譜條件

1.3.3.1 UPLC條件

采用Acquity UPLC BEH柱（3.0 mm×50 mm，1.7 μm）進(jìn)行定量分析。流動(dòng)相選用乙腈溶液。檢測波長215 nm，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2.0 μL；使用Empower軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.3.2 UPC2條件

采用Acquity UPC2HSS C18SB柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）進(jìn)行定量分析。流動(dòng)相A選用CO2，助溶劑B為乙腈溶液。洗脫梯度為：0～0.2 min，助溶劑B，初始1%，0.2～4.0 min助溶劑B比例由1%變?yōu)?0%，4.0～5.0 min助溶劑B比例回到1%，平衡2.0 min。流速1.5 mL/min，檢測波長215 nm，動(dòng)態(tài)背壓12.4 MPa，柱溫50 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL；數(shù)據(jù)處理使用Empower 3軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的優(yōu)化

在實(shí)際分離過程中，為了在較短時(shí)間內(nèi)使目標(biāo)物獲得良好的分辨率和峰形，比較HSS SB C18和CSH Fluorophenyl柱對目標(biāo)物分離的影響。當(dāng)色譜柱為CSH Fluorophenyl時(shí)，樣品經(jīng)皂化后的某一雜質(zhì)與角鯊烯未能分離，影響其定量的準(zhǔn)確性。當(dāng)使用HSS SB C18色譜柱時(shí)，角鯊烯與此雜質(zhì)能夠較好地分離，且峰形尖銳，分析時(shí)間僅2.5 min，故本實(shí)驗(yàn)選用HSS C18SB柱為分析色譜柱。

2.2 分離條件的優(yōu)化

圖1 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)的UPLC（A）和UPC2（B）圖Fig. 1 UPLC (A) and UPC2 (B) chromatograms of squalene standard

為達(dá)到快速分離角鯊烯的目的，本實(shí)驗(yàn)分別優(yōu)化了流速（1.0～2.0 mL/min）、動(dòng)態(tài)背壓（10.3～13.8 MPa）、進(jìn)樣量（0.5～3.0 μL）、助溶劑（乙腈、甲醇）以及柱溫（40～60 ℃）對角鯊烯分離的影響。通過綜合考慮系統(tǒng)最高壓力的限制以及樣品中雜質(zhì)與目標(biāo)化合物的分離度，實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果為流速1.5 mL/min，動(dòng)態(tài)背壓12.4 MPa，進(jìn)樣量1.0 μL，乙腈作為助溶劑，柱溫為50 ℃時(shí)，角鯊烯與雜質(zhì)完全分離。最佳條件下的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

2.3 樣品前處理優(yōu)化及比較

液相色譜對于角鯊烯的測定原理基本相同，均使用紫外檢測器在210～215 nm波長處進(jìn)行檢測。此外，目前主要的前處理方法主要包括3 類，具體描述見表2，關(guān)于角鯊烯的前處理方法，方法1為溶劑直接稀釋法，此法雖然只需兩步即可完成檢測，但是此法對于反相色譜而言，易對色譜柱造成損害，基質(zhì)效應(yīng)較高，而且過多的雜質(zhì)峰對角鯊烯的峰形產(chǎn)生干擾；方法2為通過對植物油經(jīng)皂化后提取進(jìn)行檢測，此法增加了皂化，基質(zhì)效應(yīng)明顯降低，并且能夠很好地適應(yīng)于UPLC的檢測，但是前處理時(shí)間較長，不能完成快速檢測要求；其次為AOAC的滴定方法，此法操作繁瑣，不僅樣品前處理的時(shí)間較長；而且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，對實(shí)驗(yàn)人員操作技能要求較高。綜合以上前處理的優(yōu)缺點(diǎn)可知，方法1和方法2均適合使用UPC2對植物油中的角鯊烯進(jìn)行檢測，且方法1具有更快的前處理速率；方法2則適用于液相色譜對角鯊烯的檢測；在沒有儀器的前提下，可用方法3對植物油中的角鯊烯進(jìn)行檢測。

表2 角鯊烯檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 2 Comparison of the advantages and disadvantages of squalene detection methods

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 線性范圍和最低檢出限

取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，稀釋成5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，按1.3.3節(jié)優(yōu)化后色譜條件進(jìn)行測定，并繪制樣品質(zhì)量濃度（橫坐標(biāo)x，mg/L）與峰面積（縱坐標(biāo)y，AU）標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，且當(dāng)信噪比為3和10時(shí)，該方法的最低檢出限及定量限如表3所示。結(jié)果表明，使用該方法對目標(biāo)物的檢測，在線性范圍內(nèi)具有良好的線性（r＞0.999 1），均能滿足對植物油中的角鯊烯進(jìn)行檢測的要求。

表3 角鯊烯的線性范圍及檢出限Table 3 Linear ranges and limits of detection for squalene

2.4.2 樣品加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在空白樣品中添加高、中、低水平的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋2.0 min后靜置10 min，按2.3節(jié)樣品處理進(jìn)行前處理操作后，按1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率。每加標(biāo)水平的樣品重復(fù)測定8 次。結(jié)果顯示，加標(biāo)回收率在86.97%～102.41%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～4.1%之間。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=8）Table 4 Recoveries of UPC2 and UPLC (n= 8)

2.4.3 UPC2與UPLC檢測方法的比較

為進(jìn)一步確定方法的準(zhǔn)確性，本課題組隨機(jī)抽取3 個(gè)植物油樣品對不同的檢測方法進(jìn)行比對實(shí)驗(yàn)，按2.3節(jié)樣品處理進(jìn)行前處理操作后，按1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果如表5所示。

表5 不同檢測方法的比對結(jié)果（n=3）Table 5 Comparison of squalene determination in vegetable oils by UPC2 and UPLC (n= 3)

由表5可知，UPC2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與UPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，由此可以證明UPC2與UPLC均能滿足檢測要求，檢測方法可靠，相對于UPLC法，UPC2不但可以節(jié)約檢測時(shí)間與檢測成本，還可大大提高檢測效率，可認(rèn)為是一種全新的檢測方法。

2.5 實(shí)際樣品的檢測結(jié)果

圖2 皂化后菜籽油樣品（A）、橄欖油樣品（B）的UPLC圖和UPC2圖（C）以及直接稀釋后橄欖油樣品的UPC2圖（D）Fig. 2 UPLC chromatogram of saponified rapeseed oil (A), olive oil (B), UPC2 chromatogram of saponified olive oil (C) and UPC2chromatogram of diluted olive oil sample (D)

本實(shí)驗(yàn)在實(shí)際樣品檢測過程中，采用3 種前處理方法分別對不同種類的植物油進(jìn)行檢測。首先，不同植物油樣品（編號：CZY001、GLY018）使用傳統(tǒng)檢測方法2進(jìn)行處理的UPLC見圖2A、B；其次，同一樣品（編號：GLY018）使用不同前處理方法（方法1、方法2）的UPC2見圖2C、D，可以看出，UPC2因?yàn)槌R界流體作為流動(dòng)相而使得色譜保留的性質(zhì)與傳統(tǒng)反相液相色譜不同，不僅適用于傳統(tǒng)的方法2，而且同樣適用于簡單快速的方法1。由表6可知，除橄欖油中角鯊烯含量較高以外，菜籽油、花生油等植物油中角鯊烯含量較少；且UPLC和UPC2均能較為準(zhǔn)確地檢測出橄欖油中角鯊烯的含量，而滴定法測得角鯊烯含量均較高，且處理時(shí)間長，穩(wěn)定及重復(fù)性較差。

表6 實(shí)際樣品檢測結(jié)果（n=3）Table 6 Squalene contents of real samples determined by UPC2 and UPLC with different sample pretreatments (n= 3)g/kg

3 結(jié) 論

綜上所述，使用UPC2以及UPLC對植物油中角鯊烯的檢測結(jié)果比較可以看出，由于分離原理以及流動(dòng)相的不同，對植物油中角鯊烯的檢測具有獨(dú)特的分離優(yōu)勢。而滴定法準(zhǔn)確度不高，重復(fù)性不好，且操作過程繁雜，不適應(yīng)大批量樣品的快速檢測。通過3 種前處理方法的比較，UPC2可兼容樣品經(jīng)正己烷稀釋后直接進(jìn)樣，且分離過程中對目標(biāo)物基本無干擾，檢出限低，分離速率快，適合對植物油中角鯊烯進(jìn)行高通量檢測；并對未來的分析提供新的方向及思路。