章志超，吳 鑫*，朱應(yīng)飛

（江西省食品檢驗(yàn)檢測研究院，江西國家果蔬產(chǎn)品及加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江西 南昌 330001）

黃酒是源于中國的特色古酒，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒[1]。它是以大米、黍米、粟為主要原料，經(jīng)加曲、酵母等糖化發(fā)酵劑釀造而成的發(fā)酵酒，按照產(chǎn)品風(fēng)格分為傳統(tǒng)型黃酒、清爽型黃酒和特型黃酒[2]。它具有乙醇體積分?jǐn)?shù)低、酒性醇厚、營養(yǎng)豐富和風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)[3]，在日常飲用、烹飪和保健等方面的應(yīng)用廣泛，越來越受消費(fèi)者的青睞。

黃酒由于乙醇含量低，多為開放式發(fā)酵，若生產(chǎn)滅菌不徹底、 貯藏或運(yùn)輸過程中容易染菌而發(fā)生酸敗，主要表現(xiàn)為酒液渾濁沉淀，生酸腐敗或白色菌膜形成，甚至異味發(fā)臭，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量[4-5]。該問題是我國黃酒行業(yè)亟需解決的問題之一。導(dǎo)致黃酒生物性酸敗的微生物多種多樣，如酵母、醋酸菌、假單胞菌、乳酸菌和芽孢桿菌等[6-10]。目前關(guān)于黃酒的國家標(biāo)準(zhǔn)中對黃酒的衛(wèi)生控制僅限于金黃色葡萄球菌和沙門菌[11]，食品安全抽檢項(xiàng)目中也無針對性檢測項(xiàng)目及相應(yīng)的檢驗(yàn)方法[12]，食品安全風(fēng)險(xiǎn)顯而易見。

雖然乳酸桿菌導(dǎo)致的黃酒酸敗問題時(shí)有報(bào)道，但因食果糖乳桿菌導(dǎo)致的黃酒酸敗問題則較為少見，按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對乳酸菌的檢測方法則呈培養(yǎng)周期較長的特點(diǎn)，出現(xiàn)了方法適用性不佳等問題，制約了該菌的檢出時(shí)效。本研究在通過形態(tài)學(xué)、生化實(shí)驗(yàn)和16S rRNA基因等方法選擇性篩選出目標(biāo)腐敗菌——食果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans）的基礎(chǔ)上，針對國標(biāo)方法的不足進(jìn)一步采用單因素和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)對目標(biāo)腐敗菌的檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，大大縮短了該菌定量檢出時(shí)間，為評估黃酒該類酸敗嚴(yán)重程度，解決相關(guān)食品安全問題提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒，因微生物自然污染，呈渾濁、異味的某品牌黃酒變質(zhì)樣品A和同品牌同批次的質(zhì)量正常樣品B。

平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）、MRS（man rogosa sharpe）瓊脂、MRS肉湯、孟加拉紅培養(yǎng)基（rose bengal agar，RBA）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile agar，VRBA）、乳酸桿菌生化鑒定套裝北京陸橋生物技術(shù)有限公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXSD-A1430生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；AW200SG 厭氧工作站 英國Electrotek公司；C1000touch型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 美國伯樂公司；BG-Power300型電泳儀 美國Baygene公司。

1.3 方法

1.3.1 總酸的測定

參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[13]方法進(jìn)行測定。

1.3.2 菌落計(jì)數(shù)

菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[14]進(jìn)行測定；大腸菌群：參照GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》[15]進(jìn)行測定；霉菌：參照GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[16]進(jìn)行測定；乳酸菌：參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[17]進(jìn)行測定。

1.3.3 目標(biāo)腐敗菌的分離、鑒定

參照焦唯楨等[18]的方法，對優(yōu)勢菌進(jìn)行培養(yǎng)，純化和鏡檢，并對分離的純菌株進(jìn)行16S rRNA基因鑒定，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序工作，將結(jié)果與NCBI中收錄的其他菌株序列進(jìn)行比對分析，并運(yùn)用MEGA 5.1軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌懸液的制備、接種

將篩選純化得到的菌株于MRS肉湯培養(yǎng)基中活化2 次，再以2%接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)約48 h，使菌懸液濃度達(dá)到8（lg（CFU/mL）），再用生理鹽水稀釋菌液，使最終濃度約為4～5（lg（CFU/mL））（接近黃酒樣品的實(shí)際微生物污染水平）。

1.3.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在GB 4789.35—2016中乳酸菌檢測條件的基礎(chǔ)上，從分離菌株的生長促進(jìn)因子、pH值和溫度等方面進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析。單因素試驗(yàn)基本條件設(shè)計(jì)為MRS固體培養(yǎng)基、pH 6.2、溫度36.0 ℃[17]。在其他因素不變的情況下，改變其中一個(gè)因素，各因素設(shè)計(jì)的水平梯度為pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；培養(yǎng)溫度27、30、33、36、39、42 ℃；L-半胱氨酸（L-Cys）質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%、0.075%、0.125%、0.175%、0.225%；無水乙醇體積分?jǐn)?shù)1%、3%、6%、9%、12%；培養(yǎng)9 d后觀察菌落生長情況。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基中L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)4 個(gè)因素作為自變量，以培養(yǎng)7 d的目標(biāo)腐敗菌的菌落數(shù)作為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，取其平均值，因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.7 優(yōu)化后的方法確證

分別采用GB 4789.35—2016和優(yōu)化后的方法對變質(zhì)樣品A或正常樣品B中乳酸菌數(shù)進(jìn)行檢測，比較檢出數(shù)量和檢出時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 2007，結(jié)果以“ ±s”表示。采用Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)腐敗菌的分析

表2 不同培養(yǎng)基對黃酒中微生物的菌落計(jì)數(shù)Table 2 Bacterial colony counts of Rancid Chinese rice wine using different culture media

采用多種常見的非選擇/選擇性培養(yǎng)基對變質(zhì)樣品和正常樣品中可能存在的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如表2所示：兩類樣品在整個(gè)培養(yǎng)過程中，PCA、VRBA和RBA上均無菌落生長；當(dāng)使用MRS選擇性固體培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)到第9天，變質(zhì)樣A中菌落數(shù)達(dá)到（4.43±0.03）（lg（CFU/mL）），而正常樣中則未檢出乳酸菌。正常成品黃酒中無微生物生長，這與市售黃酒經(jīng)滅菌工藝，本身菌含量極低，加上其特有的含醇環(huán)境有關(guān)，而變質(zhì)黃酒中生長的微生物可能也較為單一。同時(shí)通過對樣品總酸（以乳酸計(jì)）的測定，變質(zhì)樣品A的總酸值是同批次正常樣的3 倍，章銀珠等[9]研究的4種壇裝陳化黃酒酸敗后總酸（以乳酸計(jì)）僅上升了30%～60%，因此推斷導(dǎo)致黃酒酸敗變質(zhì)的優(yōu)勢腐敗微生物可能為乳酸菌，且產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。黃酒中總酸的上升則可能與乳酸菌代謝糖類產(chǎn)生乳酸有密切關(guān)系[19]。

2.2 乳酸菌的鑒定

采用傾注法MRS培養(yǎng)的平板上長出的菌如圖1A所示，均為乳白色，其中長在培養(yǎng)基內(nèi)部的菌落呈三角形，表面不規(guī)則，如菌ZH-1；表面菌落呈圓形，表面光滑，如菌ZH-2。挑取純化這2 種菌進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如圖1B所示，選取的兩株菌均為革蘭氏陽性菌、桿菌，因此推測篩選得到的菌ZH-1和菌ZH-2可能均為乳酸桿菌。按照GB 4789.35—2016的方法進(jìn)行初步生化鑒定，表3表明：2 株菌的碳水化合物生化反應(yīng)一致，對照文獻(xiàn)[20-21]，與之類似的菌為食果糖乳桿菌，且文獻(xiàn)[20]中指出該菌具有生長緩慢的特點(diǎn)，與本實(shí)驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象吻合。

圖1 篩選菌株的菌落形態(tài)（A）和菌體形態(tài)（B）Fig. 1 Morphological characteristics of colonies (A) and Gram-staining of isolated bacteria (B)

表3 乳桿菌屬種內(nèi)常見碳水化合物生化反應(yīng)Table 3 Carbohydrate fermentation characteristics of L. fructivorans

圖2 根據(jù)菌ZH-1和菌ZH-2的16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of ZH-1 and ZH-2

對2 株菌的16S rRNA基因進(jìn)行鑒定，由細(xì)菌DNA為模板，以引物27F、1495R進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，得到約1 500 bp的目的片段，測序結(jié)果顯示：代表性菌株ZH-1和ZH-2的16S rRNA基因片段長度分別為1 484 bp和1 483 bp。將測序結(jié)果用NCBI中BLASTn進(jìn)行序列同源性分析，菌ZH-1和菌ZH-2均為乳桿菌屬，且這兩株菌均與L. fructivorans NBRC 14747（AB680654.1）和L. homohiochii DSM 20571（NR_114976.1）的相似度最高，相似度為99%。為進(jìn)一步明確菌株種屬關(guān)系，以比對相似度較高的報(bào)道菌株及同屬的模式菌株為參照構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，菌株ZH-1和ZH-2與L. fructivorans NBRC 14747（AB680654.1）聚為一簇，說明分離得到的這兩株菌為食果糖乳桿菌，與生化反應(yīng)結(jié)果相對應(yīng)。

2.3 目標(biāo)腐敗菌的確定

表4 黃酒中接種菌株ZH-1和ZH-2后的感官和總酸變化Table 4 Sensory evaluation and changes in total acid concentration of Chinese rice wine inoculated with ZH-1 or ZH-2

如表4所示，為驗(yàn)證分離菌為目標(biāo)腐敗菌，實(shí)驗(yàn)中將分離得到食果糖乳桿菌ZH-1和食果糖乳桿菌ZH-2分別接種于正常黃酒中，30 ℃培養(yǎng)2 d后，黃酒呈渾濁、腐敗異味，且總酸分別升高了（0.27±0.02）g/100 mL和（0.20±0.02）g/100 mL，變化顯著，與自然污染的黃酒樣品呈現(xiàn)的腐敗特征一致，因此可以判斷食果糖乳桿菌是導(dǎo)致該黃酒酸敗的原因。乳酸桿菌導(dǎo)致的黃酒酸敗問題報(bào)道較多[6,8-9,19]，但多數(shù)文獻(xiàn)中除對致腐乳酸桿菌形態(tài)進(jìn)行簡單描述外，無更具體的菌株鑒定數(shù)據(jù)及菌株種屬信息。食果糖乳桿菌首次在腐敗的沙拉調(diào)味汁中被發(fā)現(xiàn)[22]，常生長在一些腐敗的酸性或含乙醇的食物中[22-25]，這與黃酒的特性相符。食果糖乳桿菌一般較難分離得到[26]，但發(fā)現(xiàn)于酸敗的黃酒中則更少報(bào)道，且分離得到的食果糖乳桿菌具有發(fā)酵產(chǎn)酸能力強(qiáng)的特點(diǎn)。

2.4 目標(biāo)腐敗菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖3 不同因素對食果糖乳桿菌生長的影響Fig. 3 Effect of different factors on L. fructivorans growth

在GB 4789.35—2016的檢測方法的基礎(chǔ)上，對目標(biāo)腐敗菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。培養(yǎng)至第9天，菌落生長情況如圖3所示，當(dāng)改變MRS固體培養(yǎng)基的pH 5.5時(shí)，肉眼可計(jì)數(shù)菌落最多，達(dá)到（4.89±0.05）（lg（CFU/mL）），pH值為5.0、6.0和6.5時(shí)，均有菌落生長，但均顯著低于pH 5.5的情況，其他pH值條件下則未發(fā)現(xiàn)菌落生長；目標(biāo)腐敗菌在30～42 ℃時(shí)，可計(jì)數(shù)菌落呈下降趨勢，其中培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)目標(biāo)菌生長最快，培養(yǎng)至第7天即可見微小菌落生長； L-Cys作為一種還原劑能夠降低系統(tǒng)的氧化還原電位，加入培養(yǎng)基中能夠形成更好的厭氧環(huán)境，且L-Cys上具有的巰基可作為一些酶的重要小分子底物，促進(jìn)菌的其他生長代謝[27-30]?？紤]到黃酒陳化、貯藏的厭氧或微氧環(huán)境，乙醇體積分?jǐn)?shù)不低于8%的特征，且一些報(bào)道指出食果糖乳桿菌可能有嗜醇性[21]，為更好地契合目標(biāo)腐敗菌的實(shí)際生長環(huán)境，研究考慮將L-Cys和無水乙醇作為目標(biāo)腐敗菌的生長促進(jìn)因子。添加一定量的L-Cys或乙醇能夠促使目標(biāo)菌顯著生長：L-Cys的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.075%時(shí)，可計(jì)數(shù)的目標(biāo)菌數(shù)最多；乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，目標(biāo)菌則生長最好。

2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行29 次試驗(yàn)，序號(hào)25～29為5 次重復(fù)的中心試驗(yàn)，其余為析因點(diǎn)試驗(yàn)。對表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合得到菌落數(shù)Y對各因素編碼值的回歸方程：

同時(shí)對回歸模型進(jìn)行方差分析，如表6所示，方程極顯著，擬合優(yōu)度R2為0.98，擬合性較好，說明該方程能夠很好地反映響應(yīng)值與各因素間的對應(yīng)關(guān)系。由P值可以看出：一次項(xiàng)極顯著，一次項(xiàng)X2顯著，其余不顯著。由于二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)具有正交性，可以刪除方程中不顯著項(xiàng)[27]，得到方程如下：

由F值大小可以判斷各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值影響：pH值＞L-Cys質(zhì)量濃度＞培養(yǎng)溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

表5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Box-Behnken design and experimental results

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance for the regression model

2.4.3 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

圖4 不同顯著性因素對食果糖乳桿菌生長影響的響應(yīng)面Fig. 4 Response surface plots showing the interactive effects of various significant factors on the growth of L. fructivorans

為進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，繪制響應(yīng)面曲線圖可進(jìn)行直觀分析。將沒有顯著性影響的自變量設(shè)為零，觀察具有顯著性因素間的交互作用。如圖4所示，各顯著因素在設(shè)定的變化范圍內(nèi)均有最大值，食果糖乳桿菌菌落數(shù)較大的培養(yǎng)條件范圍分別為pH 5.4～5.6、培養(yǎng)溫度30～31 ℃、L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.07%～0.10%。采用Design-Expert軟件的Optimization模塊，對食果糖乳桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)檢測條件：在MRS固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，調(diào)整pH值為5.42、培養(yǎng)溫度為30.31 ℃、L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.079%、乙醇體積分?jǐn)?shù)為9%，對應(yīng)的模型預(yù)測值為（6.04±0.05）（lg（CFU/mL））。結(jié)合實(shí)際操作的方便和方差分析結(jié)果，確定最佳培養(yǎng)條件為：在MRS固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.08%的L-Cys，調(diào)節(jié)pH值為5.4，臨用時(shí)加入體積分?jǐn)?shù)9%的無水乙醇，培養(yǎng)溫度為30 ℃，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件檢測分離的食果糖乳桿菌，培養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)值為（5.94±0.03）（lg（CFU/mL）），與預(yù)測值接近，可見該模型能較好地預(yù)測目標(biāo)菌的生長。

2.4.4 檢測方法的確證結(jié)果

表7 國標(biāo)方法和優(yōu)化后的方法對樣品中目標(biāo)腐敗菌檢測效果評價(jià)Table 7 Comparative assessment of GB 4789.35-2016 and the optimization method

為驗(yàn)證優(yōu)化后的檢測方法能夠更好地應(yīng)用于黃酒等實(shí)際樣品中腐敗乳酸菌的檢測，分別對采用國標(biāo)方法和優(yōu)化后的方法對黃酒變質(zhì)樣A或正常樣品B進(jìn)行檢測，如表7所示，檢測方法優(yōu)化后，培養(yǎng)4 d后即可計(jì)數(shù)，連續(xù)監(jiān)測第6天和第8天的菌落數(shù)結(jié)果，無顯著差異；而國標(biāo)方法培養(yǎng)至第9～10天才能夠計(jì)數(shù)，菌落數(shù)與優(yōu)化的方法接近，同時(shí)采用優(yōu)化的方法對正常的黃酒樣進(jìn)行檢測，無菌落生長，排除了假陽性和假陰性的可能。因此該優(yōu)化的檢測方法適用于導(dǎo)致黃酒變質(zhì)的食果糖乳桿菌的檢測，檢測時(shí)間較國標(biāo)方法縮短5～7 d。

3 結(jié) 論

研究中觀測到的黃酒生物性腐敗呈渾濁、異味和總酸升高等特點(diǎn)。食果糖乳桿菌是導(dǎo)致黃酒變質(zhì)的目標(biāo)腐敗菌，該菌在固體培養(yǎng)基上生長緩慢，采用GB 4789.35—2016的方法，需要9～10 d出結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對食果糖乳桿菌檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，得到了最優(yōu)的培養(yǎng)條件為：在MRS固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，L-Cys添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.08%，調(diào)節(jié)pH值為5.4，臨用時(shí)加入體積分?jǐn)?shù)9%的無水乙醇，培養(yǎng)溫度為30 ℃。采用優(yōu)化后的方法，定量檢出時(shí)間為3～4 d，縮短一半以上。針對食果糖乳桿菌引起的酸敗問題，優(yōu)化的定量檢測條件能夠?yàn)檩^快評估該類黃酒腐敗程度提供參考。