尤 雅，段長(zhǎng)青，燕國(guó)梁*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

近年來，由于全球氣候變暖，為追求葡萄成熟度對(duì)其采收期的延長(zhǎng)，導(dǎo)致果實(shí)中糖含量大大增加，這也大幅提高了葡萄酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)[1-4]。已有不少研究表明，高乙醇含量會(huì)嚴(yán)重影響葡萄酒的風(fēng)味特征，增加酒的灼熱感和苦澀味，掩蓋一些芳香類化合物，使甜味和酸味減弱[1-2,4]。低醇葡萄酒已逐步成為國(guó)內(nèi)外葡萄酒研究的主要對(duì)象。

國(guó)內(nèi)外降低葡萄酒乙醇含量的方法主要有采用真空蒸餾、反滲透技術(shù)、萃取等物理方法脫醇[5]，但這些方法或多或少都存在著一些不足，如使用的費(fèi)用過于昂貴，不僅會(huì)增加生產(chǎn)成本，還會(huì)改變一些代謝物含量從而嚴(yán)重影響酒質(zhì)[1-2,5]。構(gòu)建低產(chǎn)乙醇的基因工程菌等轉(zhuǎn)基因技術(shù)在食品飲料中的使用有一定限制且會(huì)導(dǎo)致某些非目標(biāo)性發(fā)酵產(chǎn)物的增加，會(huì)對(duì)葡萄酒質(zhì)量產(chǎn)生不利影響[1-7]。

當(dāng)前生產(chǎn)中多采用的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）能高效地把葡萄酒中的糖分轉(zhuǎn)化為乙醇，在發(fā)酵相同的葡萄汁時(shí)，其乙醇體積分?jǐn)?shù)大致相同[1,2,4]。因此，目前較為經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、有效的方法是篩選出低產(chǎn)乙醇的酵母菌株，將碳的代謝路徑轉(zhuǎn)移到除乙醇外的其他產(chǎn)物上[1-4,6-10]。S. cerevisiae具有發(fā)酵快、產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)、發(fā)酵性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，而大多數(shù)的非釀酒酵母不具備完全發(fā)酵的能力，產(chǎn)乙醇的能力較差。已有較多研究表明充分利用這兩種菌株的特點(diǎn)，進(jìn)行同時(shí)或順序接種的混合發(fā)酵可有效降低乙醇含量[2-4,6-10]。表1總結(jié)了近年來采用非釀酒酵母與S. cerevisiae進(jìn)行混合發(fā)酵在降醇方面的研究進(jìn)展?？梢钥闯?，主要用于降醇的菌種有Metschnikowia pulcherrima和Starmerella bacillaris，乙醇體積分?jǐn)?shù)一般降低0.9%～2.0%[3-4,6-10]。此外，非釀酒酵母不僅能產(chǎn)生大量的甘油、酯類等代謝物，而且具有能夠分解香氣前體物質(zhì)的酶[2,11-12]，在發(fā)酵初期參與發(fā)酵，可產(chǎn)生一些重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，可在一定程度上提高葡萄酒的風(fēng)味復(fù)雜性，改善單一菌種發(fā)酵帶來的不良影響[2,12]。

表1 非釀酒酵母與S. cerevisiae混合發(fā)酵用于生產(chǎn)低醇葡萄酒的研究進(jìn)展總結(jié)Table 1 Summary of recent studies on the mixed fermentation of non-S. cerevisiae and S. cerevisiae for the production of low alcohol wines

在前期研究中從新疆產(chǎn)區(qū)分離到一株非釀酒酵母，經(jīng)鑒定為Candida humilis。初步研究發(fā)現(xiàn)，其具有高產(chǎn)甘油、低產(chǎn)乙醇的能力以及較高的硫耐受性（60 mg/L），具有較好的葡萄酒釀造潛力。另外，C. humilis被認(rèn)為是一種公認(rèn)安全的酵母[13]，其與乳酸菌存在一定的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系，二者常作為天然發(fā)酵劑廣泛應(yīng)用于面包[14]、動(dòng)物飼料、谷物等一些烘焙產(chǎn)品中。在分類學(xué)上，C. humilis與Kazachstania exigua同位于哈薩克斯坦種屬Kazachstania的進(jìn)化分支上，Vaughan等[15]將其歸類于Kazachstania種屬。

溫度是影響酵母菌代謝重要的環(huán)境因素。研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌生長(zhǎng)的最適溫度為20～30 ℃，較低的發(fā)酵溫度會(huì)限制其代謝活動(dòng)，延緩發(fā)酵進(jìn)程[16]。低溫可以增加酵母菌細(xì)胞膜流動(dòng)性，提高細(xì)胞內(nèi)中鏈脂肪酸（C4～C12）的含量，從而影響細(xì)胞膜中脂肪酸的代謝。葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分也會(huì)受到溫度的影響，低溫條件下通常能產(chǎn)生更多的酯類物質(zhì)，揮發(fā)酸和雜醇物質(zhì)的含量則減少[17-18]。

為探究C. humilis在葡萄酒發(fā)酵中是否還具有降低乙醇的能力，本實(shí)驗(yàn)在兩種發(fā)酵溫度（13 ℃和23 ℃）下研究C. humilis與S. cerevisiae以兩種接種方式（同時(shí)接種和順序接種）混合發(fā)酵對(duì)葡萄酒乙醇含量及香氣物質(zhì)合成的影響，以期為葡萄酒的降醇研究提供一種新的解決方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄汁取自2015年河北沙城赤霞珠葡萄果實(shí)，還原糖210 g/L，可滴定酸（以酒石酸計(jì)）5.5 g/L，pH 3.35。

商業(yè)S. cerevisiae EC1118購于法國(guó)Lallemand Inc公司，于本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存；C. humilis CVE20從新疆赤霞珠葡萄在（11±1）℃條件下自然發(fā)酵分離獲得，并經(jīng)26S rDNA（D1/D2）鑒定（同源性達(dá)到99%）。

YPD培養(yǎng)基：1.0%酵母浸提物，2.0%蛋白胨，2.0%葡萄糖；WLN培養(yǎng)基購于海博生物技術(shù)有限公司，具體成分如下：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，葡萄糖50.0 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，氯化鉀0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，硫酸錳0.002 5 g/L，三氯化鐵0.002 5 g/L，溴甲酚綠0.022 g/L，瓊脂20.0 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

1200系列LC高效液相色譜儀（含G1362A示差折光檢測(cè)器和G1315D二極管陣列檢測(cè)器）、6890N/5975BMS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配置PAL-SPME自動(dòng)進(jìn)樣器）美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將供試菌株接種于500 mL的YPD培養(yǎng)基（1.0%酵母浸提物，2.0%蛋白胨，2.0%葡萄糖）中進(jìn)行活化，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，4 ℃低溫離心收集菌體，經(jīng)無菌水洗滌后接入葡萄汁中?；旌习l(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，非釀酒酵母和S. cerevisiae的接種比例為10∶1，即非釀酒酵母C. humilis接種量約為107CFU/mL，S. cerevisiae接種量約為106CFU/mL。采用兩種不同的接種方式：同時(shí)接種C. humilis和S. cerevisiae；先接種C. humilis，48 h后再接入S. cerevisiae。單一接種106CFU/mL S. cerevisiae和接種107CFU/mL C. humilis的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。

發(fā)酵在250 mL搖瓶中密封進(jìn)行，每瓶裝有200 mL巴氏滅菌的葡萄汁，接供試菌株后以橡膠塞和立式發(fā)酵栓液封瓶口，分別在（13±1）℃和（23±1）℃下靜置發(fā)酵，每組處理生物學(xué)重復(fù)3 次。采用二氧化碳失重法監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)程，直至發(fā)酵結(jié)束（連續(xù)2 d的質(zhì)量變化小于0.2 g/100 mL）。隨后將樣品低溫（4 ℃）3 000 r/min離心20 min后棄除菌體，保留上清液于-20 ℃凍藏，用于香氣化合物和其他代謝產(chǎn)物的測(cè)定。

1.3.2 酵母菌數(shù)量測(cè)定

葡萄酒發(fā)酵中酵母菌的種類及其數(shù)量變化會(huì)對(duì)葡萄酒的香氣物質(zhì)產(chǎn)生重要的影響[7]。研究發(fā)現(xiàn)利用WLN培養(yǎng)基的形態(tài)分類能夠?qū)⒉煌湍高M(jìn)行區(qū)分[19]。因此利用WLN培養(yǎng)基對(duì)兩種酵母進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)來監(jiān)測(cè)不同菌株數(shù)量的變化。

1.3.3 發(fā)酵主產(chǎn)物分析

發(fā)酵液過濾（PES，0.22 μm）后，采用高效液相色譜進(jìn)行發(fā)酵主產(chǎn)物分析。檢測(cè)參考Verwaal等[20]的方法，離子交換色譜柱HPX-87H Aminex ion-exchange column，流動(dòng)相為5 mmol/L的H2SO4溶液，等度洗脫，流速0.6 mL/min。

葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的測(cè)定使用示差折光檢測(cè)器，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫45 ℃，分析時(shí)間30 min；有機(jī)酸（酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸和乙酸）的測(cè)定采用二極管陣列檢測(cè)器，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫60℃，分析時(shí)間30 min。

1.3.4 香氣化合物的檢測(cè)

利用本實(shí)驗(yàn)室已優(yōu)化的頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的方法測(cè)定[21]。在頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)行，選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS fiber萃取。萃取前，萃取頭270 ℃老化1 h。將5 mL發(fā)酵樣品加入到15 mL樣品瓶中，同時(shí)加入1 g NaCl、10 μL內(nèi)標(biāo)（4-甲基-2-戊醇）后迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的樣品瓶蓋擰緊密封，在40 ℃恒溫條件下，180 r/min平衡30 min，待瓶中的氣-液相香氣物質(zhì)達(dá)到平衡后，將已活化或熱解析過的聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，在40 ℃恒溫下攪拌萃取30 min，使樣品瓶中的香氣物質(zhì)達(dá)到氣-固和氣-液平衡。然后將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口，250℃熱解析8 min，不分流進(jìn)樣。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：采用配置PAL-SPME自動(dòng)進(jìn)樣器的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，所用毛細(xì)管色譜柱為HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣（純度99.999%），流速1 mL/min，自動(dòng)進(jìn)樣。柱溫箱升溫程序：50 ℃保持1 min，以3 ℃/min速率升溫至220℃，保持5 min，總運(yùn)行時(shí)間62.67 min。質(zhì)譜接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電離方式為電子電離源，離子源能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z 20～350。每個(gè)樣品做2 個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

香氣物質(zhì)的定性和定量分析：利用質(zhì)譜全離子掃描圖譜，對(duì)于已有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)已建立的相同色譜條件下該化合物的保留時(shí)間、保留指數(shù)和質(zhì)譜信息進(jìn)行定性分析，制作其在模擬酒溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量（合成酒溶液為2 g/L葡萄糖、7 g/L酒石酸和體積分?jǐn)?shù)12%乙醇溶液，NaOH調(diào)pH值至3.3。將混合香氣標(biāo)準(zhǔn)品配制成15 個(gè)梯度）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析和作圖

采用SPSS 20.0（IBM公司）對(duì)乙醇發(fā)酵結(jié)束后的主產(chǎn)物以及揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，差異顯著，并對(duì)超過其閾值（＞1）的香氣成分進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

圖1為兩種酵母于WLN培養(yǎng)基在25 ℃培養(yǎng)2 d后的不同菌落形態(tài)圖。

圖1 WLN平板鑒定S. cerevisiae和C. humilis結(jié)果Fig. 1 Identification of S. cerevisiae and C. humilis growing on WLN plates

2.2 發(fā)酵速率曲線

如圖2所示，兩個(gè)溫度發(fā)酵均有以下規(guī)律：C. humilis單獨(dú)發(fā)酵組中CO2總產(chǎn)量最少，S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵組的CO2產(chǎn)量最多。順序接種發(fā)酵組的總CO2產(chǎn)量低于同時(shí)接種發(fā)酵組的CO2產(chǎn)量。說明S. cerevisiae主導(dǎo)整個(gè)發(fā)酵過程，非釀酒酵母C. humilis存在的時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)酵速率越慢。發(fā)酵溫度也能夠顯著影響發(fā)酵進(jìn)程。13 ℃發(fā)酵時(shí)CO2產(chǎn)量最大僅為12 g/200 mL左右，而23 ℃發(fā)酵時(shí)CO2總產(chǎn)量可達(dá)到20 g/200 mL左右，約為低溫發(fā)酵條件下的2 倍。說明低溫抑制了酵母菌的代謝活動(dòng)，減緩了發(fā)酵進(jìn)程，延長(zhǎng)了乙醇發(fā)酵的時(shí)間。

圖2 23 ℃（A）和13 ℃（B）各發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 2 Fermentation kinetics (CO2 production) of the mixed and pure fermentations at 23 ℃ (A) and 13 ℃ (B)

2.3 酵母菌生長(zhǎng)變化分析

圖3 23 ℃（A）和13 ℃（B）純培養(yǎng)發(fā)酵S. cerevisiae和C. humilis的細(xì)胞生長(zhǎng)變化曲線Fig. 3 Growth kinetics of pure fermentation of S. cerevisiae and C. humilis at 23 (A) and 13 ℃ (B)

如圖3所示，單獨(dú)發(fā)酵中，23 ℃時(shí)，S. cerevisiae和C. humilis具有相似的生長(zhǎng)狀況，均在發(fā)酵的第4～5天達(dá)到最大數(shù)量，分別為7.76×107CFU/mL和5.50×107CFU/mL。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩種菌的數(shù)量始終維持在106～107CFU/mL左右。13 ℃時(shí)，S. cerevisiae在前期數(shù)量較為緩慢其后數(shù)量迅速增加，而C. humilis的生長(zhǎng)速率一直較為緩慢，盡管其接種量約為S. cerevisiae的10 倍，但在發(fā)酵中后期，其數(shù)量明顯低于S. cerevisiae。

圖4 同時(shí)接種及順序接種S. cerevisiae和C. humilis各自的細(xì)胞生長(zhǎng)變化曲線Fig. 4 Growth kinetics of mixed fermentation performed with S. cerevisiae and C. humilis at 23 and 13 ℃

如圖4所示，同時(shí)接種中，在接入S. cerevisiae后，C. humilis的數(shù)量在達(dá)到其最大值3.09×107CFU/mL之后開始迅速減少，直至不能在WLN平板上檢測(cè)到。相較之下，S. cerevisiae在達(dá)到其最大數(shù)量后一直以較為平穩(wěn)的速度保持在較高的數(shù)量級(jí)（106～107CFU/mL）直至發(fā)酵結(jié)束。順序接種中，C. humilis的數(shù)量在第2天達(dá)到其最大值4.88×107CFU/mL，由于S. cerevisiae遲于C. humilis 48 h接入葡萄汁，發(fā)酵前期基質(zhì)中的氮源被C. humilis大量消耗，導(dǎo)致S. cerevisiae的生長(zhǎng)受到抑制，其最大數(shù)量為6.03×107CFU/mL，遠(yuǎn)小于S. cerevisiae純培養(yǎng)發(fā)酵。說明兩種酵母之間存在明顯的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。這與前人結(jié)果相一致，S. cerevisiae能更快、更有效地利用基質(zhì)中的氮源[22]，在混合發(fā)酵中顯示出遠(yuǎn)優(yōu)于非釀酒酵母的發(fā)酵能力。

表2 乙醇發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵主產(chǎn)物Table 2 Primary fermentation products in wine at the end of alcoholic fermentation

2.4 發(fā)酵主產(chǎn)物分析

混合發(fā)酵不僅會(huì)影響發(fā)酵進(jìn)程，還會(huì)進(jìn)一步影響葡萄汁發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的組成和含量。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了發(fā)酵結(jié)束后各發(fā)酵液中發(fā)酵主產(chǎn)物，包括乙醇、甘油和6 種重要的有機(jī)酸，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，與S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵相比，23 ℃條件下，混合發(fā)酵時(shí)甘油含量明顯增加，其中同時(shí)接種和順序接種中分別增加了15.42%和21.29%，明顯增加了葡萄酒的圓潤(rùn)感[12]?；旌习l(fā)酵時(shí)乙醇含量顯著降低，同時(shí)接種和順序接種時(shí)分別降低了約1.24%和2.59%，降醇程度達(dá)到了8.41%和17.56%。接種有C. humilis的處理中乙酸含量顯著增加，雖仍在國(guó)標(biāo)規(guī)定乙酸最高質(zhì)量濃度1.2 g/L以內(nèi)。但通常認(rèn)為其在0.2～0.7 g/L左右較為適宜，在接近感覺閾值0.7～1.1 g/L時(shí)，會(huì)給葡萄酒帶來一定的溶劑味和酸敗感[12]。與S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵相比，其他3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的琥珀酸含量明顯降低，乳酸含量顯著增加，而各實(shí)驗(yàn)組的酒石酸、蘋果酸和檸檬酸的含量并無顯著差異。

低溫13 ℃發(fā)酵時(shí)，C. humilis的代謝活動(dòng)受到抑制，發(fā)酵并不完全，導(dǎo)致其殘?zhí)橇枯^高，代謝物乙醇和甘油含量也相應(yīng)減少。與S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵相比，甘油、乙醇和乙酸在混合發(fā)酵組中變化與23 ℃發(fā)酵相類似，它們的含量均有顯著增加。檸檬酸、酒石酸和琥珀酸的含量也有所增加，但乳酸含量有所減少，蘋果酸含量并無顯著差異。

2.5 香氣成分分析

香氣值（odour activity value，OAV）是用來評(píng)價(jià)葡萄酒揮發(fā)性組分對(duì)實(shí)際香氣貢獻(xiàn)大小所普遍采用的指標(biāo)，每組揮發(fā)性組分的OAV是由該物質(zhì)的含量除以其閾值得到的[23]，其中OAV大于1的物質(zhì)共16 種。發(fā)酵結(jié)束后共檢測(cè)到28 種香氣物質(zhì)，包括4 種酸類、10 種乙酯類、4 種酯類、6 種高級(jí)醇類、2 種萜烯類物質(zhì)以及2 種其他物質(zhì)，見表3。

由表3可知，23 ℃時(shí)混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組中酸類物質(zhì)的總量較S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵顯著下降，尤其是己酸、辛酸、癸酸等帶有酸腐味的脂肪酸。2-苯乙酸的含量顯著提高了79.17%，而C. humilis單獨(dú)發(fā)酵時(shí)其含量并沒有顯著變化。但帶有類似蜂蜜、丁香、玫瑰香氣的2-苯乙酸的含量顯著提高，而C. humilis單獨(dú)發(fā)酵時(shí)2-苯乙酸的含量并沒有明顯的提高。因此可以認(rèn)為：混合發(fā)酵時(shí)S. cerevisiae與C. humilis存在協(xié)同作用促進(jìn)2-苯乙酸的生成，明顯增加酒中的甜香味。

與S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵相比，雖然混合發(fā)酵中己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量有所減少，但乙酯類物質(zhì)的總量卻有明顯的提高，這主要是由于乙酸乙酯含量的顯著增加，順序發(fā)酵其含量增加了16.04%。高質(zhì)量濃度的乙酸乙酯（＞100～150 mg/L）會(huì)使葡萄酒具有溶劑味[3,12]，本實(shí)驗(yàn)中該物質(zhì)的含量在50 mg/L左右，可以增加酒中香氣的復(fù)雜性。與S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵相比，C. humilis單獨(dú)發(fā)酵能產(chǎn)生高質(zhì)量濃度的丁酸乙酯（1.81 mg/L），約是S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵（0.43 mg/L）的4.2 倍。順序接種發(fā)酵中其含量也有明顯增加，約提高了2.77倍，為葡萄酒帶來香蕉、菠蘿等果香?；旌习l(fā)酵時(shí)乙酸苯乙酯的含量均超過了其閾值（0.25 mg/L），其含量增加了1.46倍，有類似玫瑰、丁香等花香。乙酸異戊酯等乙醇酯類物質(zhì)的含量顯著降低，酯類物質(zhì)的總量并無顯著差異。

混合發(fā)酵時(shí)明顯減少的異戊醇是高級(jí)醇總量下降的主要原因。葡萄酒中高級(jí)醇質(zhì)量濃度超過400 mg/L時(shí)，會(huì)帶來強(qiáng)烈的刺鼻味，當(dāng)其質(zhì)量濃度低于300 mg/L時(shí)，可以增加香氣復(fù)雜性[3,12]。實(shí)驗(yàn)中各處理組的高級(jí)醇質(zhì)量濃度在100 mg/L左右，給酒帶來愉悅的香氣。雖然混合發(fā)酵中香氣復(fù)雜性有所下降，但指甲油味等不良味感由于異戊醇含量的減少而明顯下降。異丁醇含量有所增加，但并未達(dá)到其感覺閾值，不會(huì)增加生青味等不良味感。同時(shí)，β-苯乙醇的含量顯著增加，順序接種中增幅達(dá)到了23.9%。

萜烯物質(zhì)的總量并未在不同組間表現(xiàn)出差異性。混合發(fā)酵中β-大馬士酮的含量高于S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵，其中23 ℃順序接種時(shí)增加18.74%。這種高產(chǎn)β-大馬士酮的特性在低溫下表現(xiàn)更為顯著，13 ℃同時(shí)接種發(fā)酵其含量增加26.19%。在接種有C. humilis的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，帶有脂肪味的3-甲硫基丙醇含量明顯減少。

13 ℃時(shí)，與S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵相比，混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組中高級(jí)醇、酯類物質(zhì)、乙酯類物質(zhì)的總量以及酸類物質(zhì)的含量均有所下降，萜烯物質(zhì)的總量沒有表現(xiàn)出顯著差異性。13 ℃發(fā)酵時(shí)，S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵中β-苯乙醇、異戊醇的含量顯著減少，而異丁醇的含量有所增加。

2.6 OAV的模擬計(jì)算

將葡萄酒中物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似的揮發(fā)性香氣組分歸為一組，并計(jì)算該組的OAV總和，即可對(duì)樣品的香氣輪廓進(jìn)行模擬，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，采用不同的酵母菌株在不同溫度下發(fā)酵獲得的葡萄酒具有不同的香氣特征。與單菌株發(fā)酵相比，23 ℃混合發(fā)酵時(shí)萜烯類物質(zhì)無顯著變化，酸類、高級(jí)醇類和其他酯類物質(zhì)有所減少，但乙酯類物質(zhì)的含量顯著增加（圖5a）。13 ℃混合發(fā)酵能顯著增加萜烯類物質(zhì)，酸類、酯類和高級(jí)醇類物質(zhì)均有所減少（圖5b）。

表3 發(fā)酵結(jié)束酒樣中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量、閾值及其香氣描述Table 3 Volatile aroma compounds, threshold and their odor descriptions in wines after alcoholic fermentation

圖5 葡萄酒香氣輪廓圖（OAV＞1）Fig. 5 Wine aroma profile （OAV ＞ 1）

2.7 香氣主成分分析

為更好地分析不同處理之間葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的差異，選取樣品中OAV大于1的16 種香氣成分進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，兩個(gè)主成分（PC1和PC2）的總貢獻(xiàn)率為82.4%，其中PC1的貢獻(xiàn)率為50.1%，PC2的貢獻(xiàn)率為32.3%。由于接種菌株的不同，S. cerevisiae和C. humilis單獨(dú)發(fā)酵分別位于圖的左右兩邊。而根據(jù)不同的發(fā)酵溫度，該圖又被大致分為上下兩部分。其中，13 ℃的4 個(gè)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組主要位于PC2正方向上，23 ℃的4 個(gè)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組主要位于PC2負(fù)方向上。23 ℃時(shí)，同時(shí)接種和順序接種兩個(gè)混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組距C. humilis單獨(dú)發(fā)酵組較近。13 ℃時(shí)，兩個(gè)混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組與S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵組相距較近，說明23 ℃時(shí)C. humilis在混合發(fā)酵中對(duì)香氣的影響更為顯著，其特征香氣為丁酸乙酯、乙酸苯乙酯和β-苯乙醇，這些化合物均有類似丁香、玫瑰花香以及蜂蜜果香，可以提高香氣質(zhì)量。低溫下C. humilis代謝活動(dòng)受到抑制，導(dǎo)致13 ℃混合發(fā)酵的呈香特征與S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵較為接近，而β-大馬士酮、1-己醇、萜烯醇和癸酸乙酯等化合物可以較好地區(qū)分C. humilis和S. cerevisiae的發(fā)酵香氣。

圖6 發(fā)酵結(jié)束后酒樣中OAV大于1部分香氣化合物主成分分析得分圖（A）和載荷圖（B）Fig. 6 Score and loading plots of principal component analysis(PCA) for aroma compounds (OAV ＞ 1) in fi nal wines after alcoholic fermentation

3 討 論

利用不同菌株進(jìn)行混合發(fā)酵是降低葡萄酒中乙醇含量的一種有效手段。Contreras等[6]采用M. pulcherrima 和S.cerevisiae以順序接種的方式分別在霞多麗和西拉酒中進(jìn)行混合發(fā)酵，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別降低了0.9%和1.6%。同年，Contreras等[7]又發(fā)現(xiàn)采用M. pulcherrima和S. uvarum兩種菌株與S. cerevisiae混合發(fā)酵比任意接入一種非釀酒酵母與S. cerevisiae混合發(fā)酵的降醇程度都大，乙醇體積分?jǐn)?shù)可降低1.7%～1.8%。本研究采用C. humilis與S. cerevisiae以兩種接種方式（同時(shí)接種和順序接種）進(jìn)行混合發(fā)酵，研究對(duì)酒中乙醇含量及香氣物質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)接種和順序接種發(fā)酵能分別降低乙醇體積分?jǐn)?shù)約1.24%和2.59%。與S. cerevisiae單一菌株發(fā)酵相比，順序接種的降醇幅度可以達(dá)到17.56%。Merico等[29]發(fā)現(xiàn)，Kazachstania種屬菌株的代謝方式為產(chǎn)生—積累—消耗，當(dāng)培養(yǎng)基質(zhì)中葡萄糖殆盡時(shí)，乙醇作為碳源會(huì)被Kazachstania吸收代謝。這可能是發(fā)酵后乙醇含量較少的原因。另一方面，由于糖酵解途徑向產(chǎn)物甘油方向的轉(zhuǎn)移[4]，甘油含量顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)接種和順序接種發(fā)酵中甘油含量分別增加了15.42%和21.29%，這可能也是導(dǎo)致乙醇含量降低的原因。Vaudano等[30]發(fā)現(xiàn)K.exigua與S. cerevisiae進(jìn)行混合發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生了較多的乙酸，Kurtzman等[15]發(fā)現(xiàn)C. humilis用于酸面團(tuán)發(fā)酵時(shí)產(chǎn)揮發(fā)酸極少，本研究發(fā)現(xiàn)接種C. humilis增加了乙酸含量，可能是不同的發(fā)酵基質(zhì)及菌株差異導(dǎo)致這一差別。

除了降低乙醇含量，混合發(fā)酵還能夠提高某種重要香氣物質(zhì)的含量。例如，采用S. uvarum與S. cerevisiae混合發(fā)酵得到的低醇葡萄酒中，β-苯乙醇和乙酸苯乙酯的含量與S. cerevisiae單獨(dú)發(fā)酵相比，分別提高了2.46 倍和1.81 倍[4]。采用M. pulcherrima 和S. cerevisiae 得到的低醇葡萄酒中，其乙酯類物質(zhì)和乙酸乙酯的含量明顯增加[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用S. cerevisiae和C. humilis進(jìn)行混合發(fā)酵，β-苯乙醇和乙酸苯乙酯的含量分別增加了23.9%和1.46倍。此外，順序接種發(fā)酵中乙酯類物質(zhì)的總量增加了18.30%，其中丁酸乙酯的含量提高了2.77倍。這些物質(zhì)通常被描述為具有花香（類似蜂蜜、玫瑰和紫丁香）和果香（香蕉、菠蘿），可以顯著提高葡萄酒的香氣質(zhì)量。單萜和降異戊二烯可以賦予葡萄酒特殊的品種香氣，對(duì)葡萄酒的品質(zhì)有重要的貢獻(xiàn)[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，混合發(fā)酵組中β-大馬士酮的含量顯著增加，低溫條件其增幅更顯著：13 ℃同時(shí)接種發(fā)酵其含量增加26.19%，為葡萄酒帶來類似紫羅蘭的香氣。

從整體上來看，采用C. humilis與S. cerevisiae混合發(fā)酵可以顯著降低葡萄酒中乙醇含量，不會(huì)降低葡萄酒的香氣品質(zhì)。目前還鮮有相關(guān)的研究報(bào)道，本研究結(jié)果可以為葡萄酒的降醇提供一種新的方法。由于該菌株還具有較高的耐硫特性，因此也具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。在后續(xù)工作中，可以通過優(yōu)化發(fā)酵條件（如改變C. humilis的接種濃度、時(shí)間以及與S. cerevisiae的接種比例）來繼續(xù)提高該菌的釀造品質(zhì)（如繼續(xù)提高酯類物質(zhì)以及甘油的含量，降低乙酸的濃度），以滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。