陳 琪，張亞敏，趙 穎，梅 林，傅瑞燕

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036）

乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis）不僅有助于提高食品的營養(yǎng)價(jià)值、改善食品風(fēng)味，而且具有特殊的生理活性和營養(yǎng)功能，在調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群的平衡、提高食物消化率和生物價(jià)、控制內(nèi)毒素、抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長繁殖和腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生等方面發(fā)揮重要的作用[1-3]，因此成為功能性食品開發(fā)的熱點(diǎn)。但是，乳酸乳球菌在工業(yè)生產(chǎn)過程中會(huì)面臨多種物理、化學(xué)方面的脅迫作用，包括酸脅迫、低溫脅迫、氧脅迫、滲透脅迫等，從而抑制其生長，影響生產(chǎn)效率[4]。如何通過代謝工程的手段提升乳酸乳球菌對(duì)外源脅迫的抵御能力，進(jìn)而改善其工業(yè)生產(chǎn)性能，是當(dāng)前迫切需要解決的問題。

γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）是一種普遍以自由態(tài)呈現(xiàn)的非蛋白質(zhì)類氨基酸[5]，對(duì)真核生物和原核生物多具有廣泛的生理功能。GABA主要由L-谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）脫羧產(chǎn)生。在大多數(shù)植物體內(nèi)，當(dāng)處于厭氧或者逆境條件下時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)部的破壞，使得細(xì)胞質(zhì)pH值下降，會(huì)激活GAD活性使得細(xì)胞通過脫羧反應(yīng)將谷氨酸轉(zhuǎn)變成堿性更強(qiáng)的GABA，消耗胞內(nèi)H+，產(chǎn)生ATP，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)pH值恢復(fù)正常后，GAD的活性又會(huì)下降[6-9]。因而GABA支路成為植物中一條重要的防止或減輕逆境引起的細(xì)胞酸中毒途徑。

在乳酸乳球菌體內(nèi)，由于糖類發(fā)酵過程中大量積累終產(chǎn)物有機(jī)酸，導(dǎo)致發(fā)酵體系的酸化，是其生長的本質(zhì)特征[10]，因而降低胞內(nèi)pH值是其抗酸脅迫的一種主要方式。除了通過F1F0-ATPase向胞外運(yùn)輸H+以調(diào)控胞內(nèi)pH值平衡之外，在酸性條件誘導(dǎo)下，還會(huì)啟動(dòng)GAD系統(tǒng)、檸檬酸代謝系統(tǒng)和精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)[11-13]等降低胞質(zhì)酸化程度，從而減少酸脅迫[14]。

本研究基于植物GABA代謝調(diào)控機(jī)制的研究基礎(chǔ)，利用食品級(jí)乳酸鏈球菌素（Nisin）控制的基因表達(dá)系統(tǒng)[15]，將源自茶樹的一條GAD基因與乳酸菌表達(dá)載體pNZ8148[16]連接后轉(zhuǎn)入L. lactis NZ9000中，利用Nisin進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以調(diào)控GAD在乳酸乳球菌中的表達(dá)時(shí)機(jī)[17-18]，研究高效表達(dá)GAD生產(chǎn)GABA的過程對(duì)于改良乳酸乳球菌菌株酸脅迫和冷凍脅迫抗性的影響，旨在為提高乳酸菌的抗脅迫能力及工業(yè)化生產(chǎn)GABA提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

L. lactis NZ9000、表達(dá)質(zhì)粒載體pNZ8148 湖南長沙贏潤生物技術(shù)有限公司；Escherichia coli DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

Taq DNA聚合酶、PrimerSTAR?Max DNA Polymerase、pMD19-T Vector、dNTPs、DL 2 000 DNA Marker、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶HindIII、NcoI日本TaKaRa公司；Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞、TransStart?Fast Pfu Fly DNA Polymerase 北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒美國Axygen公司；溶菌酶 北京Solarbio公司；Nisin 蘭州偉日生物工程有限公司；GABA 美國Sigma公司；M17肉湯培養(yǎng)基 青海海博生物技術(shù)有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物的測序及所需引物的合成工作由美國Invirtrogen公司和上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基及溶液

GM17肉湯培養(yǎng)基：在M17肉湯培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量濃度為5 g/L的葡萄糖溶液，即為GM17肉湯培養(yǎng)基；溶菌酶溶液：用TE緩沖液配制成20 mg/mL溶菌酶溶液，-20 ℃保存；Nisin的配制：用0.05%乙酸溶液配制成10 mg/mL的母液，使用時(shí)用超純水稀釋為終質(zhì)量濃度為1 μg/mL溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

C1000 PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc XR凝膠成像儀、Micro Pulser電穿孔儀 美國Bio-Rad公司；Centrifuge 5804R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；600液相檢測系統(tǒng)美國Waters公司；JY99-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；723可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；垂直電泳槽 北京市六一儀器廠；DHP-916電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏設(shè)備有限公司；恒溫水循環(huán)儀 上海錦華試驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取-80 ℃冷凍保存于甘油的L. lactis NZ9000菌，解凍后接種于已滅菌的GM17肉湯液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置過夜培養(yǎng)后，之后再次轉(zhuǎn)接一次，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，即為活化種子培養(yǎng)液。

1.3.2 外源添加GABA對(duì)L. lactis NZ9000生長狀態(tài)影響的測定

配制MRS肉湯液體培養(yǎng)基分裝于15 mL的離心管中，每管10 mL，滅菌后備用。將活化后的種子液按照2%的接種量分別接種于新鮮的MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，向培養(yǎng)基中加入不同濃度的GABA（0、2.5、5、10 mmol/L），每隔1 h在600 nm波長下測量菌液的細(xì)胞密度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞密度（OD600nm）為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線，同時(shí)以添加等量的茶氨酸（theanine，THEA）作為對(duì)比。根據(jù)乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸的特點(diǎn)，采用乳酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 5.5，其余同上，觀察生長曲線的變化。

1.3.3 外源添加GABA對(duì)L. lactis NZ9000抗凍能力影響的測定

取活化后的種子液依照2%的接種量分別接種于新鮮的MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，并向培養(yǎng)基中加入不同濃度的GABA。根據(jù)生長曲線，分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期中期、穩(wěn)定期前期和穩(wěn)定期中后期。取這3 個(gè)時(shí)期的發(fā)酵菌液，4℃、10 000 r/min離心5 min。菌泥經(jīng)0.85 g/100 mL的生理鹽水洗滌3 次后，用等體積的新鮮MRS培養(yǎng)基重懸，按每管1 mL分裝后，分別置于4 ℃和-20 ℃進(jìn)行冷凍脅迫。同樣以添加等量的THEA作為對(duì)比。

每隔一段時(shí)間取出菌懸液解凍，4 ℃、10 000 r/min離心5 min后。用等體積生理鹽水洗滌3 次并重懸，取10 μL重懸液，梯度稀釋后點(diǎn)種于MRS培養(yǎng)基平板上，30 ℃靜置過夜培養(yǎng)后測定菌落數(shù)，并進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.3.4 重組pNZ8148-CsGAD表達(dá)載體的構(gòu)建

pNZ8148-CsGAD食品級(jí)表達(dá)載體的構(gòu)建流程如圖1所示。根據(jù)已經(jīng)獲得的茶樹GAD序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件在序列的5’和3’設(shè)計(jì)一對(duì)引物：CsGAD-up：CCGCCATGGATGGTTCTGTCAAAGACA，下劃線處為N c o I酶切位點(diǎn)；C s G A D-d o w n：CCCAAGCTTTTAGCAAACACCATTAGT，下劃線處為HindIII酶切位點(diǎn)。

圖1 重組質(zhì)粒載體pNZ8148-CsGAD的構(gòu)建Fig. 1 Construction of recombinant plasmid vector pNZ8148-CsGAD

利用高保真酶從提取的茶樹葉片cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為總體積50 μL，Primer STAR Max Premix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。由于高保真酶擴(kuò)增后產(chǎn)生平末端，因而擴(kuò)增結(jié)束后可加入1 μL Taq酶72 ℃延伸30 min進(jìn)行加尾反應(yīng)，隨后參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化回收，并利用TA克隆與載體pMD19-T連接[19]，構(gòu)建pMD19-CsGAD質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，氯霉素平板培養(yǎng)過夜后挑取陽性克隆測序。

確定測序結(jié)果與原始序列無誤后，對(duì)提取的高濃度pMD19-CsGAD質(zhì)粒和pNZ8148質(zhì)粒分別進(jìn)行NcoI和HindIII酶的雙酶切。酶切體系：10×K Buffer 2 μL，NcoI 1 μL，HindIII 1 μL，質(zhì)粒DNA（pNZ8148和pMD19-CsGAD分別進(jìn)行酶切）約3 μL，牛血清白蛋白2 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL，輕彈管壁混勻，37 ℃水浴3 h，將雙酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖電泳后，進(jìn)行凝膠回收?；厥彰盖挟a(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL，線性去磷酸化pNZ8148載體0.5 ng，酶切后的CsGAD 3 ng，T4 DNA連接酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)充至10 μL。16 ℃連接過夜后于65 ℃滅活15 min，利用DNA Clean-Up System將連接產(chǎn)物純化回收獲得重組的pNZ8148-CsGAD表達(dá)載體，再次轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后挑菌測序。

確定結(jié)果無誤后，搖菌提取pNZ8148-CsGAD質(zhì)粒，利用電穿孔儀轉(zhuǎn)入L. lactis NZ9000感受態(tài)細(xì)胞[20]，30 ℃恢復(fù)培養(yǎng)2 h后涂布于含10 ng/mL氯霉素的GM17平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)過夜，同時(shí)轉(zhuǎn)入pNZ8148空載體作為對(duì)照。挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切的驗(yàn)證。電泳檢測片段大小正確后表明獲得重組乳酸菌L. lactis NZ9000/pNZ8148-CsGAD。

1.3.5 pNZ8148-CsGAD的誘導(dǎo)表達(dá)與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測

將導(dǎo)入目的質(zhì)粒pNZ8148-CsGAD的乳酸菌命名為重組菌，將導(dǎo)入pNZ8148空載體的乳酸菌命名為對(duì)照菌。對(duì)獲得的重組菌L. lactis pNZ8148-CsGAD利用Nisin進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，利用SDS-PAGE對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測，通過與對(duì)照菌總蛋白量進(jìn)行對(duì)比，確定重組菌中GAD蛋白的表達(dá)。

活化重組菌L. lactis pNZ8148-CsGAD至5 mL GM17液體培養(yǎng)基中（10 ng/mL氯霉素），30 ℃靜置培養(yǎng)過夜，隨后按照5%接種量轉(zhuǎn)接至GM17培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)至OD600nm為0.45～0.50[21]，加入Nisin溶液使其最終質(zhì)量濃度為2 ng/mL繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，最后用冷凍的石英砂碾磨提取菌體總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，檢測誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白[22]，以轉(zhuǎn)入pNZ8148空載體的乳酸菌作為對(duì)照菌同時(shí)進(jìn)行處理。

1.3.6 高效液相色譜檢測GABA含量

柱前衍生方法[23]：取樣品1 mL置于10 mL棕色瓶中，加入0.5 mol/L碳酸氫鈉（pH 9.0）溶液1 mL和1% 2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液1 mL，混合均勻，置于60 ℃水浴中暗處反應(yīng)1 h后取出冷卻，加50 mmol/L氯霉素磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）至刻度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取10 mg GABA標(biāo)樣，用超純水配制成1 mg/mL的溶液。取1 mL標(biāo)樣按上述方法衍生后進(jìn)行梯度稀釋，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣。

色譜條件：Waters 600液相系統(tǒng)和Waters 2489紫外檢測器，C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水-磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）（20∶20∶60，V/V），檢測波長360 nm，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

取1.3.5節(jié)中加Nisin誘導(dǎo)后的重組菌與對(duì)照菌，4 ℃、10 000 r/min離心5 min。菌泥經(jīng)0.85 g/100 mL生理鹽水洗滌3 次后，用等體積50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）重懸后超聲破碎細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm濾膜，測定GABA含量。

1.3.7 基因工程乳酸菌L. lactis pNZ8148-CsGAD抵御逆境能力的比較

1.3.7.1 抗酸能力的比較

配制GM17肉湯液體培養(yǎng)基，利用乳酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 5.5和pH 4.0的酸性條件。每管15 mL分裝滅菌，分別將重組菌和對(duì)照菌的活化種子液按照5%的接種量加入，并加入10 ng/mL的氯霉素，每隔2 h在600 nm波長下測定菌液的細(xì)胞密度，并繪制生長曲線。另外，因?yàn)橘|(zhì)粒pNZ8148經(jīng)Nisin誘導(dǎo)后會(huì)使蛋白大量產(chǎn)生，在接種的時(shí)候再加入2 ng/mL的Nisin誘導(dǎo)液，觀察重組菌和對(duì)照菌生長曲線的變化。

1.3.7.2 抗凍能力的比較

將重組菌和對(duì)照菌的活化種子液按照5%的接種量分別接種于新鮮的GM17肉湯液體培養(yǎng)基（10 ng/mL氯霉素，2 ng/mL Nisin）中，培養(yǎng)及單位體積菌落數(shù)計(jì)算方法見1.3.3節(jié)，為避免兩種菌培養(yǎng)過程中可能存在的起始數(shù)目差異，采用計(jì)算存活率的方式進(jìn)行抗凍能力比較。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 6.0軟件ANOVA方法進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)[24]，并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性條件下外源添加劑對(duì)L. lactis NZ9000生長曲線的影響

圖2 不同培養(yǎng)條件對(duì)L. lactis NZ9000生長曲線的影響Fig. 2 Effect of different culture conditions on the growth of L. lactis NZ9000

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明添加不同濃度的GABA對(duì)于乳酸菌的生長沒有特別明顯的影響，在添加5 mmol/L GABA時(shí)，乳酸菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期細(xì)菌的OD600nm最高，因而選擇5 mmol/L GABA作為外源添加劑量進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)?？紤]到額外添加氨基酸可能會(huì)有能量增加的影響，選擇添加THEA作為外源氨基酸添加劑的參比，添加量同為5 mmol/L。由圖2可知，在正常情況下（pH 7.2），外源添加GABA或THEA對(duì)L. lactis NZ9000的最大生物量（OD600nm）并無明顯的影響。而在弱酸性培養(yǎng)環(huán)境下（pH 5.5），L. lactis NZ9000的生長速率明顯受酸性脅迫影響而放緩，其到達(dá)穩(wěn)定生長平臺(tái)期的培養(yǎng)時(shí)間由正常條件下的8 h左右延長至14 h左右。同時(shí)，外源添加5 mmol/L GABA對(duì)于酸脅迫條件下L. lactis NZ9000的生長并無明顯影響；但是另一方面，外源添加5 mmol/L THEA對(duì)于酸脅迫條件下L. lactis NZ9000的生長具有明顯的抑制作用。這表明外源添加GABA并不能幫助乳酸菌抵御酸脅迫，而外源添加THEA對(duì)于酸性條件下培養(yǎng)的乳酸菌具有較強(qiáng)的抑制作用。

2.2 外源添加GABA對(duì)乳酸菌抗凍脅迫的影響

根據(jù)測得生長曲線，確定乳酸菌L. lactis NZ9000在正常培養(yǎng)條件下（pH 7.2）到達(dá)對(duì)數(shù)期中期、穩(wěn)定期前期和穩(wěn)定期后期的時(shí)間分別為4、8、20 h。隨后對(duì)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間的乳酸菌分別進(jìn)行低溫脅迫處理。

由圖3可以看出，對(duì)數(shù)生長期中期的菌置于4 ℃時(shí)，脅迫處理前期乳酸菌生長會(huì)有一個(gè)明顯的增長趨勢，但隨著低溫時(shí)間延長，菌體逐漸死亡，而在-20 ℃條件下，乳酸菌不能繼續(xù)生長，存活數(shù)隨著凍存時(shí)間逐漸下降。其他培養(yǎng)階段的乳酸菌受到低溫脅迫均會(huì)抑制其生長，隨著處理時(shí)間延長，存活菌數(shù)顯著下降?？傮w來說，低溫脅迫前期會(huì)抑制乳酸菌的生長，并導(dǎo)致緩慢死亡，而后期（處理30 d以后）死亡數(shù)會(huì)明顯增加，使得菌存活數(shù)目明顯下降。處于4 ℃條件下的乳酸菌由于更容易產(chǎn)生冰晶使得存活率明顯低于-20 ℃處理組。外源添加5 mmol/L GABA在大多數(shù)培養(yǎng)階段并無作用，僅對(duì)處于穩(wěn)定期中后期的乳酸菌表現(xiàn)出一定的幫助，而外源添加5 mmol/L THEA對(duì)于抗冷凍脅迫沒有明顯作用。因而可以排除GABA對(duì)乳酸菌抗逆脅迫起到一定作用的原因是由于培養(yǎng)基中能量物質(zhì)增加所導(dǎo)致。基于此，設(shè)計(jì)外源表達(dá)載體向乳酸菌中導(dǎo)入一段茶樹中的GAD序列，目的是經(jīng)過Nisin誘導(dǎo)后，乳酸菌自身會(huì)大量合成GABA，進(jìn)而觀察高產(chǎn)GABA情況下乳酸菌抵御逆境的能力。

圖3 不同前培養(yǎng)階段乳酸菌L. lactis NZ9000的冷凍抗性比較Fig. 3 Comparison of anti-freeze ability of L. lactis NZ9000 cells at different growth phases

2.3 pNZ8148-CsGAD表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

圖4 菌落PCR檢測的結(jié)果Fig. 4 PCR results of recombinant bacterial colonies

以改良CTAB法提取的茶樹葉片mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后利用設(shè)計(jì)的GsGAD上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到大小約為1 500 bp的特異性條帶。通過凝膠回收試劑盒回收純化該P(yáng)CR產(chǎn)物，通過TA克隆與PMD-19T載體連接并轉(zhuǎn)入E. coli DH5α菌中，挑取陽性克隆測序，結(jié)果顯示該序列長度為1 482 bp，與目標(biāo)基因序列一致。將GsGAD與pNZ8148載體分別進(jìn)行NcoI和HindIII的雙酶切，然后利用DNA Ligase進(jìn)行連接，熱擊轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑抗性平板篩選陽性克隆，測序證明無誤后，提取質(zhì)粒pNZ8148-GsGAD電擊轉(zhuǎn)入L. lactis NZ9000中獲得基因工程菌L. lactis NZ9000/pNZ8148-CsGAD。以轉(zhuǎn)入空載體pNZ8148的L. lactis NZ9000作為對(duì)照菌，利用菌落PCR檢測轉(zhuǎn)化結(jié)果。由圖4可知，重組菌中可擴(kuò)增出大小約為1 500 bp的目的條帶，而對(duì)照菌擴(kuò)增無此條帶。

2.4 CsGAD表達(dá)產(chǎn)物鑒定及其產(chǎn)GABA能力分析

收集2 ng/mL Nisin誘導(dǎo)8 h的重組菌L. lactis NZ9000/pNZ8148-CsGAD，利用SDS-PAGE分析總蛋白。根據(jù)CsGAD序列推算翻譯后蛋白大小約為55.5 kDa。由圖5可知，重組菌總蛋白添加Nisin后與對(duì)照菌相比在目的區(qū)域有明顯的誘導(dǎo)條帶，表明目的蛋白得到表達(dá)。經(jīng)Nisin誘導(dǎo)表達(dá)CsGAD蛋白后，重組菌合成GABA的能力明顯增強(qiáng)，由于L. lactis NZ9000菌株在pNZ8148受Nisin誘導(dǎo)過程中可以持續(xù)穩(wěn)定合成GAD蛋白，保證了GABA的合成與積累，培養(yǎng)8 h后，重組菌中GABA的含量達(dá)到對(duì)照組的5 倍左右（圖6）。

圖5 SDS-PAGE檢測目的蛋白Fig. 5 Identification of the target protein by SDS-PAGE

圖6 HPLC測定乳酸菌中GABA含量Fig. 6 GABA content detected by HPLC

2.5 基因工程菌抗酸脅迫結(jié)果

在正常培養(yǎng)條件下添加Nisin對(duì)重組菌和對(duì)照菌進(jìn)行培養(yǎng)，并測定生長曲線，由圖7可以看出，重組菌與對(duì)照菌的生長曲線相比發(fā)生了明顯的變化。其中對(duì)照菌大概在6 h達(dá)到了穩(wěn)定期，而重組菌大約在10 h達(dá)到穩(wěn)定期，但是重組菌到達(dá)穩(wěn)定期的最大生物量大約是對(duì)照菌的1.5 倍，說明重組pNZ8148-CsGAD質(zhì)粒在表達(dá)GAD的蛋白情況下大大提高了乳酸菌的生長活力。在弱酸性培養(yǎng)條件下（pH 5.5），重組菌與對(duì)照菌的生長均受到抑制，到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間延長，而重組菌仍表現(xiàn)出一定的生長量優(yōu)勢；在pH 4.0的培養(yǎng)條件下，對(duì)照菌基本不生長，而重組菌表現(xiàn)出明顯的酸脅迫耐受性。

圖7 酸性培養(yǎng)條件對(duì)L. lactispNZ8148-CsGAD生長的影響Fig. 7 Effect of acidic culture conditions on the growth of L. lactis pNZ8148-CsGAD

2.6 基因工程菌抗冷凍脅迫結(jié)果

圖8 不同前培養(yǎng)階段的乳酸菌L. lactis pNZ8148-CsGAD的冷凍抗性比較Fig. 8 Comparison of anti-freeze ability of L. lactis pNZ8148-CsGAD cells at different growth phases

由圖8可以看出，利用Nisin誘導(dǎo)表達(dá)CsGAD的重組菌在不同培養(yǎng)階段對(duì)于低溫脅迫的耐受性均明顯高于對(duì)照菌，其中以預(yù)培養(yǎng)至穩(wěn)定前期階段的差異最為明顯。總體來說，預(yù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期中期和穩(wěn)定前期的對(duì)照菌抵御冷凍的能力均很弱，當(dāng)處理至15 d時(shí)，對(duì)照菌幾乎都已死亡，重組菌存活率低于10%；培養(yǎng)至穩(wěn)定期后期的重組菌抗冷凍能力明顯增強(qiáng)，盡管對(duì)照菌的存活率有所上升，但仍能觀察到重組菌的存活率明顯高于對(duì)照菌，在4 ℃與-20 ℃脅迫條件下，培養(yǎng)15 d后存活率仍高于10%。表明利用Nisin誘導(dǎo)表達(dá)外源CsGAD基因后，高產(chǎn)GABA的乳酸菌相比于對(duì)照乳酸菌抗低溫脅迫能力有了明顯提高。

3 結(jié) 論

工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)乳酸菌不可避免的遭受到各種逆境脅迫。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了外源添加GABA與體內(nèi)合成GABA兩種模式對(duì)于乳酸菌抗逆的影響，結(jié)果表明，正常培養(yǎng)條件和酸脅迫條件下，外源添加一定量的GABA對(duì)于L. lactis NZ9000的生長狀態(tài)沒有明顯的影響。而低溫脅迫情況下，乳酸菌在外源添加GABA相較于未添加物培養(yǎng)條件，表現(xiàn)出一定的生存優(yōu)勢。這可能是由于這些物質(zhì)起到了一定的冷凍保護(hù)劑作用，抑制冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，減少冰晶對(duì)細(xì)胞膜的損傷，從而減少細(xì)菌的死亡[25]。當(dāng)采用基因工程的方法將一段CsGAD基因?qū)隠. lactis NZ9000，進(jìn)而利用Nisin誘導(dǎo)GAD合成從而可以體內(nèi)大量生成GABA時(shí)，再觀察重組菌的生長情況發(fā)現(xiàn)，重組菌的生物增長量在進(jìn)入穩(wěn)定期后達(dá)到了對(duì)照菌的1.5 倍。在酸性培養(yǎng)條件下，尤其是pH 4的酸性條件下，重組菌的耐酸性明顯高于對(duì)照菌，推測是因?yàn)橹亟M菌在Nisin誘導(dǎo)后大量產(chǎn)生GAD，而當(dāng)環(huán)境中的pH 4.0～5.5時(shí)，GAD就會(huì)通過脫羧反應(yīng)消耗環(huán)境中的H+，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生堿性較強(qiáng)的GABA中和H+[26-28]。

有研究表明，處在不同生長期的菌株對(duì)冷凍干燥的抗性有很大的差別[29]。一般來說，處在對(duì)數(shù)生長期末期和穩(wěn)定期前期的菌體細(xì)胞其存活率較高，可能是對(duì)數(shù)生長期末期和穩(wěn)定期前期的菌體細(xì)胞生長代謝最旺盛、活力也最強(qiáng)，與其他生長階段的菌體細(xì)胞相比，耐受不良環(huán)境的能力也要強(qiáng)[30-31]。在本次低溫脅迫實(shí)驗(yàn)中，同樣發(fā)現(xiàn)普通L. lactis NZ9000在培養(yǎng)至穩(wěn)定期前期時(shí)其抗凍能力要略優(yōu)于對(duì)數(shù)期中期和穩(wěn)定期后期2 個(gè)培養(yǎng)階段，但是對(duì)于轉(zhuǎn)入pNZ8148質(zhì)粒的L. lactis NZ9000乳酸菌來說，處于穩(wěn)定期后期的菌體冷凍耐受性表現(xiàn)較強(qiáng)，尤其是重組菌存活率明顯高于其他2 個(gè)階段，表明Nisin誘導(dǎo)重組菌表達(dá)CsGAD以促進(jìn)GABA合成與積累的過程有助于提高乳酸菌的冷凍脅迫耐受性。綜上所述，利用基因工程手段構(gòu)建的L. lactis NZ9000/pNZ8148-CsGAD能明顯提高乳酸菌抵御酸性和低溫脅迫的能力，有利于乳酸菌的工業(yè)化生產(chǎn)。