楊勝平，錢韻芳*，章 縝，程 穎，謝 晶*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是一種屬于弧菌科（Vibrionaceae）希瓦氏菌屬的革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧，其對蛋白質(zhì)具有較強的分解能力，并代謝產(chǎn)生硫化氫和胺類物質(zhì)，是水產(chǎn)品等高蛋白食品中常見的一種特定腐敗菌[1-3]。腐敗希瓦氏菌常見于腐敗的冷藏水產(chǎn)品中，可見其具有能夠適應(yīng)低溫環(huán)境的遺傳特性和低溫應(yīng)激調(diào)節(jié)功能，研究腐敗希瓦氏菌等適冷微生物的低溫適應(yīng)機制能夠為冷鏈流通中的水產(chǎn)品靶向抑菌保鮮技術(shù)的研發(fā)提供新的思路[4]。根據(jù)以往研究，利用形態(tài)學(xué)和生理生態(tài)學(xué)研究方法已經(jīng)初步認識了微生物應(yīng)對低溫脅迫的代謝機制[5]，并分析了參與上述過程部分重要基因的功能[6-7]。然而，由于轉(zhuǎn)錄可變剪切、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)亞細胞定位等調(diào)控機制[8-9]，以及基因/蛋白質(zhì)的多途徑調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的存在，單純基因組和轉(zhuǎn)錄組信息并不能全面揭示微生物適應(yīng)低溫的分子調(diào)控機制。另外，現(xiàn)階段的研究對象也主要集中在海洋或極地細菌、單核細胞性李斯特菌等致病菌，而針對腐敗希瓦氏菌的研究較少[10]。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為深入分析生物脅迫生理研究提供了很好的技術(shù)平臺[8,11]。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要方法主要包括雙向電泳技術(shù)和基于液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜分析的非凝膠技術(shù)。雙向電泳技術(shù)是目前應(yīng)用較廣泛的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，Cacace等[12]采用該技術(shù)分析低溫下單核細胞性李斯特菌的蛋白質(zhì)組表達差異，從能量代謝等角度分析了單核細胞性李斯特菌的適冷機制；何偉娜等[13]也采用該技術(shù)初步對比了腐敗希瓦氏菌凈化水產(chǎn)品加工廢水的生物學(xué)機制。該方法主要存在操作技能要求高、分離蛋白數(shù)量有限、歧視效應(yīng)、與質(zhì)譜聯(lián)用差等諸多缺陷[14]。因此，基于液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜分析的非凝膠技術(shù)發(fā)展迅速，在彌補雙向電泳的技術(shù)缺陷方面顯示了很好的實驗效果[15]。

本研究采用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了30、10 ℃和4 ℃培養(yǎng)溫度條件下腐敗希瓦氏菌模式菌株蛋白質(zhì)組差異表達情況，以期為探明腐敗希瓦氏菌在低溫脅迫下的分子調(diào)控機制提供數(shù)據(jù)支持，并為進一步探析腐敗希瓦氏菌野生菌株適冷機制提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM6067 德國Leibniz-Institut DSMZ GmbH公司；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；腦心浸肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB） 青島海博生物技術(shù)有限公司；其他試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機 美國Bio-Rad公司；SC210A熱干濃縮儀、Ultimate 3000高效液相色譜儀、Q-Exactive HF質(zhì)譜儀美國賽默飛世爾科技公司；Unico 2100分光光度計 美國Unico公司；Olympus BHS光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯（中國）有限公司。

1.3 方法

腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM6067菌粉溶解于已滅菌的腦心浸肉湯中，于30 ℃活化培養(yǎng)12～18 h至菌液濃度達到108CFU/mL，取適量菌液接種于TSB中再次活化[16]。

1.3.2 菌種培養(yǎng)

吸取0.1 mL活化培養(yǎng)至108CFU/mL的TSB菌液于100 mL新鮮滅菌的TSB肉湯培養(yǎng)液中，分別在30 ℃（MS30）、10 ℃（MS10）、4 ℃（MS4）條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期中點（OD600nm約為0.6）。

1.3.3 蛋白質(zhì)提取

取1 mL培養(yǎng)至對數(shù)生長期中點的菌體于離心管中，加入0.4 mL的蛋白裂解液（8.0 mol/L脲，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1×蛋白酶抑制劑），冰浴下超聲破碎5 次，每次2 s。將超聲破碎物冰浴20 min后在4 ℃條件下10 000×g離心30 min，取上清液于-80 ℃下保存待用。

1.3.4 蛋白質(zhì)定量

根據(jù)Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒的操作說明測定樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

增加企業(yè)于市場競爭當中的整體優(yōu)勢是企業(yè)實行總體戰(zhàn)略的最終追求目標，而價值優(yōu)勢與成本優(yōu)勢是企業(yè)市場競爭優(yōu)勢的主要體現(xiàn)領(lǐng)域，所謂價值優(yōu)勢，所指的是站在顧客的角度來看，企業(yè)需具有不同于其他競爭者的顧客價值；而成本優(yōu)勢所指的即為低成本經(jīng)營，企業(yè)需獲取與其他競爭者相較更低的價格方面優(yōu)勢。物流管理可為顧客提供更加個性化的服務(wù)，將可靠的服務(wù)與快速的反應(yīng)能力作為企業(yè)的價值優(yōu)勢；且其可有效提升企業(yè)的資產(chǎn)周轉(zhuǎn)率與生產(chǎn)能力利用率，使企業(yè)業(yè)務(wù)流程得到獲得更好的整合與協(xié)作，為企業(yè)增加成本優(yōu)勢，提升企業(yè)市場競爭力。

各取25 μg蛋白質(zhì)樣品加入5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，于14 000×g離心10 min，取上清液，進行12.5% SDS-PAGE。電泳條件：恒流14 mA，電泳時間90 min?？捡R斯亮藍染色。

1.3.6 蛋白Trypsin酶解

取20 μL超濾過的蛋白于離心管中，用50 mmol/L NH4HCO3溶液將尿素濃度稀釋至2 mol/L，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，按照蛋白和酶體積比100∶1加入Trypsin，37 ℃條件下酶解至少12 h。

1.3.7 高效液相色譜-質(zhì)譜分析

每份樣品采用納升流速高效液相色譜系統(tǒng)Easy nLC進行分離。緩沖液：A液為0.1%甲酸溶液，B液為0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈體積分數(shù)為80%）。色譜柱以95%的A液平衡。樣品由自動進樣器上樣到質(zhì)譜預(yù)柱C18trap column（0.10 mm×20 mm，3 μm），再經(jīng)分析柱C18column（0.15 mm×120 mm，1.9 μm）分離，流速為600 nL/min。相關(guān)液相色譜洗脫梯度如表1所示。

表1 液相色譜洗脫梯度參數(shù)Table 1 Mobile phase gradient parameters for HPLC analysis

每份樣品經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。分析時長：90 min；檢測方式：正離子；母離子掃描范圍：m/z 300～1 400；一級質(zhì)譜分辨率：m/z 300時120 000 次；AGC target：1×106；一級最大IT值：80 ms；掃描范圍數(shù)目：1；動態(tài)排除：12 s。多肽和多肽的碎片的m/z按照下列方法采集：每次全掃描后采集10 個碎片圖譜，二級質(zhì)譜激活類型：更高能碰撞離解；隔離窗：m/z 1.6；二級質(zhì)譜分辨率：m/z 120時15 000 次；微碎片圖譜數(shù)：1；二級最大IT值：45 ms。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，將RAW文件通過軟件Proteome Discoverer 1.4提交至Mascot服務(wù)器，進行查庫鑒定及定量分析，查庫使用Mascot軟件版本為Mascot 2.2，數(shù)據(jù)庫為txid24_8666s_160526.fasta。

1.3.9 生物信息學(xué)分析

用R語言編寫的程序基于Gene Ontology（GO）（http://www.geneontology.org）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）（http://www.genome.jp/kegg/）的數(shù)據(jù)庫的信息進行分析（北京邦菲生物科技有限公司）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

經(jīng)蛋白質(zhì)定量測定提取的MS30、MS10和MS4菌體總蛋白質(zhì)量濃度分別為3.92、4.56 μg/μL和3.94 μg/μL，蛋白質(zhì)含量較高。3 個樣品的SDS-PAGE如圖1所示，菌樣蛋白在14～120 kDa區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)的條帶非常密集，數(shù)量較多，相應(yīng)的蛋白條帶清晰，表明蛋白提取效果理想，樣品純度適于進行下一步二維液相色譜分級分離。

圖1 腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM6067在不同溫度下的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE patterns of total proteins from S. putrefaciens DSM6067 at different temperatures

2.2 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

3 組樣品中鑒定到的蛋白種類數(shù)量如表2所示。MS30、MS10和MS4中鑒定得到的蛋白質(zhì)條目數(shù)分別為1 739、1 761和1 832，表明隨著培養(yǎng)溫度的降低，腐敗希瓦氏菌表達的蛋白質(zhì)種類逐漸增多，且4 ℃下腐敗希瓦氏菌表達的蛋白質(zhì)種類較30 ℃多近100 個。

表2 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Statistical results of protein identification

與腐敗希瓦氏菌的最適生長溫度（30 ℃）相比，腐敗希瓦氏菌在10 ℃和4 ℃條件下蛋白質(zhì)含量差異超過1.5 倍的差異蛋白表達情況如圖2所示。與最適溫度下培養(yǎng)的菌株（MS30）相比，MS4表達的差異蛋白共1 405 個，其中上調(diào)的蛋白有431 個，下調(diào)393 個，MS30與MS4相比檢出或未檢出的蛋白581 個，而MS10表達的差異蛋白有1 357 個，其中上調(diào)的蛋白有374 個，下調(diào)蛋白有420 個，有無蛋白563 個，表明溫度越低，菌株的蛋白質(zhì)組表達差異越明顯。

圖2 差異蛋白Venn圖Fig. 2 Venn-diagram of numbers of differential proteins

2.3 GO功能注釋分析

一級GO功能注釋分析結(jié)果如圖3所示，得到歸類注釋的蛋白涉及生物學(xué)過程、細胞組分及分子功能3個大類。以MS30為參照，MS10和MS4各差異蛋白在生物學(xué)過程分類中，占比最多的類別依次是代謝過程、氧化還原過程、轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)水解。磷酸化類別在MS4中差異水平較MS10更顯著，在生物學(xué)過程分類中排在第4位，而MS10的磷酸化類別只排到第13位。在細胞組分分類中，膜類別所占比例最多，其次為內(nèi)在膜蛋白類別或細胞質(zhì)類別。在分子功能分類中，排名前5 位的類別有核酸綁定類別、轉(zhuǎn)移酶活性功能類別、ATP綁定類別、催化活性功能類別和金屬離子綁定功能類別。

圖3 差異蛋白GO功能注釋分析Fig. 3 GO functional annotation analysis of differential proteins

圖4 差異蛋白GO功能注釋二級分析Fig. 4 Secondary GO functional analysis of differential proteins

如圖4所示，與MS30相比，MS4和MS10發(fā)生變化的差異蛋白功能類似，以代謝過程類別、細胞過程類別、單組織過程類別為主，分子功能主要是催化活性和結(jié)合功能為主。

2.4 KEGG代謝通路分析

圖5 差異蛋白KEGG注釋Fig. 5 KEGG annotation of differential proteins

在生物體內(nèi)，不同蛋白相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)行為，基于通路的分析有助于更進一步了解其生物學(xué)功能。KEGG是有關(guān)通路的主要公共數(shù)據(jù)庫[17]，通過通路分析能確定蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MS10和MS4與MS30相比較的差異蛋白KEGG代謝通路分析結(jié)果如圖5所示。KEGG通路中的雙組分系統(tǒng)是細菌中普遍存在和非常保守的一種重要調(diào)節(jié)機制，也是原核生物中重要的生理代謝調(diào)控系統(tǒng)[18]，其主要通過磷酸化和去磷酸化來實現(xiàn)信號傳遞。結(jié)果表明溫度對雙組分系統(tǒng)中的蛋白表達差異最為顯著，且溫度越低，差異越明顯。此外，分析還發(fā)現(xiàn)兩個比較組的差異蛋白主要是與碳代謝、氨基酸生物合成、丙酮酸代謝、糖代謝/糖質(zhì)異生、三羧酸循環(huán)以及脂肪酸代謝等代謝信號通路相關(guān)。此外可看出，在參與脂肪酸代謝差異蛋白調(diào)控通路方面，4 ℃培養(yǎng)的腐敗希瓦氏菌與30 ℃相比差異較為顯著。

3 討 論

本研究運用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對比研究了不同溫度下腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM6067差異蛋白質(zhì)組表達情況，共檢測到蛋白質(zhì)2 165 條，不同樣品之間蛋白質(zhì)數(shù)量上存在差異，且培養(yǎng)溫度越低，腐敗希瓦氏菌表達的蛋白質(zhì)數(shù)量越多，這可能與腐敗希瓦氏菌對低溫的應(yīng)激表達有關(guān)。通過GO注釋分析發(fā)現(xiàn)，在細胞組分部分共涉及的14 個分類中，細胞和膜組分占比最高，說明參與腐敗希瓦氏菌生理活動的分子組分主要集中于細胞內(nèi)和細胞膜上。生物學(xué)過程部分中，代謝過程類別占比最高，其次為氧化還原過程、轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)水解類別。KEGG代謝通路分析則發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要涉及與能量代謝有關(guān)的碳代謝、丙酮酸代謝、糖代謝/糖異生、三羧酸循環(huán)等類別，說明腐敗希瓦氏菌在低溫應(yīng)激條件下對蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的需求和消耗量增加，而Cacace等[12]也發(fā)現(xiàn)單核細胞性李斯特菌在低溫下生長時能量代謝水平較最適溫度下高。因此，推測提高基礎(chǔ)代謝水平是微生物抵御低溫環(huán)境、維持其生長活力的重要途徑[19]。

本研究GO注釋分析也證實低溫下腐敗希瓦氏菌差異蛋白質(zhì)組中磷酸化類別和信號傳導(dǎo)類別分別在生物學(xué)過程和分子功能中占比較高，與Cybulski等[20]研究發(fā)現(xiàn)低溫下枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的膜蛋白磷酸化水平提高相一致，說明外界生長條件的改變會使得細胞的應(yīng)答機制也要進行相應(yīng)的調(diào)整，推測膜蛋白的磷酸化可降低低溫信號傳遞至基因，激活特定基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。該結(jié)果與KEGG代謝通路中雙組分系統(tǒng)類別占主導(dǎo)相一致。

在分子功能部分中最具特征的是綁定分子功能類別所占比例最多，包括核酸綁定功能、ATP綁定功能、金屬離子綁定、DNA綁定分子功能、RNA綁定分子功能等類別，表明綁定分子功能類別在腐敗希瓦氏菌中顯著的差異表達，其對于腐敗希瓦氏菌在低溫下的生理活動占有重要地位。有學(xué)者認為，低溫可導(dǎo)致細菌DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的形成，使轉(zhuǎn)錄水平降低，而冷激蛋白可以與DNA、RNA等結(jié)合，保持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使復(fù)制和轉(zhuǎn)錄順利進行[21-23]。另外，一些調(diào)控子、操縱子也可以與DNA、RNA結(jié)合，促進或抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。ATP綁定功能則通常與轉(zhuǎn)運和能量代謝有關(guān)[24]。

從KEGG代謝通路分析結(jié)果可知腐敗希瓦氏菌的脂肪酸代謝活動也有一定增強。前人研究認為低溫導(dǎo)致細胞膜磷脂雙分子層脂肪酸凝固，膜流動性下降進而影響代謝[25-26]，而適冷菌之所以能夠適應(yīng)低溫，與其能合成不飽和脂肪酸、短鏈脂肪酸、支鏈脂肪酸有關(guān)[27]。位于膜上的DesK和DesR被認為是脂肪酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子[28]，DesK是一個在C末端含有組氨酸殘基的組氨酸激酶，其可發(fā)生自磷酸化并催化DesR的磷酸化，最終將信號傳導(dǎo)至基因[29-30]。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM6067在不同溫度環(huán)境下生長受到多基因網(wǎng)絡(luò)體系的調(diào)控，各種信號

與代謝途徑之間相互交錯、彼此關(guān)聯(lián)。高通量的微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究從整體上揭示了與低溫脅迫相關(guān)代謝和信號網(wǎng)絡(luò)應(yīng)答機制，顯示腐敗希瓦氏菌可以全面調(diào)節(jié)碳與能量代謝、信號傳導(dǎo)與物質(zhì)轉(zhuǎn)運、基因表達與蛋白質(zhì)合成，以及包括氨基酸、核酸、脂肪酸等多種物質(zhì)的代謝過程，以維持細胞相對正常的代謝水平。研究結(jié)果為深入分析腐敗希瓦氏菌應(yīng)對低溫脅迫的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制提供了重要信息，也為探析腐敗希瓦氏菌野生菌株適冷機制提供了理論參考依據(jù)。