江用文，滑金杰，袁海波，馬海樂*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

茶黃素是多酚類（兒茶素類）在酶源和濕熱作用下氧化縮合形成的一類溶于乙酸乙酯的、具有苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)的化合物，是組成紅茶鮮爽度和強(qiáng)度等滋味的重要成分，同時(shí)是形成紅茶茶湯“黃金圈”的主要物質(zhì)[1-4]，同時(shí)茶黃素具有防癌抗癌、抗菌、抗氧化等多方面的保健價(jià)值[5-10]。近年來，隨著對(duì)茶黃素功能活性的不斷探究，學(xué)者不僅通過工藝和品種的改良獲得高茶黃素的紅茶，還通過葉外懸浮/液體發(fā)酵獲得高茶黃素的提取液?，F(xiàn)有有關(guān)懸浮發(fā)酵對(duì)茶黃素形成影響的研究多集中在外源因素，如發(fā)酵溫度[11-13]、pH值[14]、通氧量[15-16]、時(shí)間[17-18]等，夏濤等[13,19-21]較系統(tǒng)地研究了鮮葉勻漿懸浮發(fā)酵，明確適度萎凋的鮮葉進(jìn)行懸浮發(fā)酵更有利于茶黃素的生成，獲得影響懸浮發(fā)酵的關(guān)鍵因子（濃度、pH值等），并得到了優(yōu)化的懸浮發(fā)酵工藝參數(shù)。而內(nèi)源因素，如鮮葉品種、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）酶源組合和配比、兒茶素底物組成和含量、酶源與底物共同作用等，對(duì)茶黃素形成能力和形成量影響的研究較少；僅獲得表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）與茶黃素的形成具有明顯的相關(guān)性[22]，PPO和POD對(duì)氧化兒茶素具有競(jìng)爭(zhēng)性[23-24]等初步結(jié)果，而酶源活性和組合及兒茶素組分對(duì)茶黃素組分形成影響的研究缺乏。為此篩選酶源組成和兒茶素組成配比差異較大的、且實(shí)際紅茶產(chǎn)區(qū)中應(yīng)用較廣泛的福鼎大白、英紅9號(hào)、櫧葉齊、金觀音等品種原料進(jìn)行懸浮發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，探究PPO和POD酶源活性和配比、兒茶素組分（簡(jiǎn)單兒茶素和酯型兒茶素）配比和濃度等對(duì)茶黃素形成能力的影響，為茶黃素的合成理論和茶鮮葉的綜合利用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮葉品種及產(chǎn)地：福鼎大白茶 杭州茶葉試驗(yàn)場(chǎng)；櫧葉齊 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所；英紅9號(hào) 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所；金觀音 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所。等級(jí)：一芽一葉至一芽二葉初展。采摘時(shí)間：2016年5月初。

1.2 儀器與設(shè)備

FTE-BTD真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Kinetic公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-3600紫外-可見近紅外分光光度計(jì)、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；BT 124s分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；5810R臺(tái)式高速大容量離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司；T18高速分散機(jī) 德國(guó)IKA集團(tuán)；PLTW-BA型水浴恒溫振蕩器 寧波普朗特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣液制備

參照前人的研究[18,25]，分別取100 g預(yù)萎凋的福鼎大白、英紅9號(hào)、櫧葉齊、金觀音等品種鮮葉，作為不同酶源（PPO、POD等）活性和配比，以及不同兒茶素組分配比的來源，加入1 000 mL濃度0.02 mol/L pH 5.6預(yù)冷的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在高速分散機(jī)內(nèi)勻漿1 min，至葉組織粉碎均勻，置于2 000 mL收集瓶?jī)?nèi)，置于恒溫水浴振蕩器，調(diào)控水浴溫度35 ℃、通氧量0.8 L/min、振蕩速率150 r/min等參數(shù)，開始進(jìn)行懸浮發(fā)酵，分別在發(fā)酵0、15、30、45、60、75、90、120 min等時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行8 點(diǎn)取樣，均勻取樣9 mL，加入1 mL飽和檸檬酸終止氧化反應(yīng)，迅速離心（4 ℃、9 000 r/min離心10 min），過膜待測(cè)。

1.3.2 酶活性與成分檢測(cè)

PPO活性采用鄰苯二酚比色法[26]進(jìn)行測(cè)定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[26]進(jìn)行測(cè)定。兒茶素組分和茶黃素組分利用高效液相色譜法[27]進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行3 次重復(fù)，以平 ±s顯示。采用SAS 9.1軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，處理間平均值的比較用最小顯著差異法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種鮮葉PPO活性、POD活性和PPO活性/POD活性比值的比較

PPO和POD是催化兒茶素組分氧化，轉(zhuǎn)化形成茶黃素、茶紅素等物質(zhì)的關(guān)鍵酶類，但兩者催化兒茶素反應(yīng)的方向不同，且存在競(jìng)爭(zhēng)性[28-30]。對(duì)4 個(gè)品種的2 種酶活性進(jìn)行比較，PPO活性以福鼎大白和金觀音品種顯著高于其他2 個(gè)品種，均達(dá)到1.60 U/g以上，英紅9號(hào)次之，櫧葉齊顯著最低；POD活性以金觀音和櫧葉齊品種顯著高于其他2 個(gè)品種，均達(dá)到23.0 U/g以上，英紅9號(hào)次之，福鼎大白顯著最低；綜合指標(biāo)PPO活性/POD活性比值（簡(jiǎn)寫為PPO/POD值）以福鼎大白品種顯著最高，達(dá)到0.094，英紅9號(hào)和金觀音品種次之，櫧葉齊品種顯著最小，僅0.042。

表1 不同品種鮮葉PPO和POD活性Table 1 Activities of PPO and POD from fresh leaves of different cultivars

2.2 不同品種鮮葉酶源對(duì)懸浮發(fā)酵下簡(jiǎn)單兒茶素組分和總量變化規(guī)律的影響

不同品種GC、EGC、兒茶素（catechin，C）、EC等4 種簡(jiǎn)單兒茶素及其總量在懸浮發(fā)酵過程中的變化如圖1所示。不同組分在鮮葉的簡(jiǎn)單兒茶素總量（total simple catechin，TSC）中的占比不同，其中以EGC顯著最高（圖1B），均值達(dá)到0.330 mg/mL（P＜0.05），大幅度高于其他3 組分，EC次之（圖1D），GC相對(duì)最低（圖1A），僅0.056 mg/mL。不同品種茶鮮葉不同TSC組分差異較大，其中EGC、C和EC組分以英紅9號(hào)最高，GC以金觀音品種最高，櫧葉齊品種則在GC和EGC組分最低，不足英紅9號(hào)品種的50%。

懸浮發(fā)酵過程中，除金觀音和福鼎大白的C組分在懸浮發(fā)酵前15 min略有增加（圖1C），分析原因在于酯型兒茶素轉(zhuǎn)化形成茶黃素的同時(shí)裂解形成小分子的C組分所致；其他品種的其他組分均不同程度地下降，且均在前30 min呈現(xiàn)大幅度減少，減少量均在75%以上，即發(fā)酵前30 min簡(jiǎn)單兒茶素組分呈現(xiàn)劇烈的酶促氧化反應(yīng)，至發(fā)酵45 min，消耗量達(dá)90.0%以上，簡(jiǎn)單兒茶素組分所剩無幾，4 種組分均在0.010 mg/mL以下。

圖1E為不同品種的TSC在懸浮發(fā)酵下的變化規(guī)律。從鮮葉來看，英紅9號(hào)的TSC顯著最高（P＜0.05），達(dá)0.809 mg/mL，金觀音略高于福鼎大白，櫧葉齊最低，僅0.533 mg/mL；TSC前45 min呈勻速大幅度下降的趨勢(shì)，總消耗量以英紅9號(hào)最大，達(dá)0.783 mg/mL，顯著高于（P＜0.05）其他3 品種鮮葉，金觀音次之，福鼎大白顯著最低，僅0.520 mg/mL。45 min后，各品種TSC均在0.035 mg/mL以下，含量趨于平穩(wěn)。即不同品種間，以英紅9號(hào)的TSC消耗量最大，金觀音次之，櫧葉齊最低。

圖1 不同品種鮮葉懸浮發(fā)酵過程中4 種簡(jiǎn)單兒茶素組分含量的變化Fig. 1 Variations in 4 simple catechins during suspended fermentation of fresh leaves of different cultivars

2.3 不同品種鮮葉酶源對(duì)懸浮發(fā)酵下酯型兒茶素組分和總量變化規(guī)律的影響

不同品種EGCG、GCG、ECG、CG等4 種酯型兒茶素組分懸浮發(fā)酵過程中的變化規(guī)律如圖2所示。4 組分在茶鮮葉中酯型兒茶素總量（total ester-type catechin，TETC）的占比不同，以EGCG相對(duì)最高，均值達(dá)到0.531 mg/mL（圖2A），顯著高于（P＜0.05）其他3 個(gè)組分總和（0.245 mg/mL），ECG次之，CG相對(duì)最低，僅0.005 mg/mL（圖2D）。不同品種茶鮮葉的不同TETC差異顯著，如EGCG、ECG和CG組分以英紅9號(hào)顯著最高（P＜0.05），以櫧葉齊顯著最低，而GCG組分則以櫧葉齊品種最高，英紅9號(hào)最低。

不同TETC在懸浮發(fā)酵中變化規(guī)律不同，其中EGCG和ECG組分呈前45 min迅速消耗（圖2A和圖2C）而后平穩(wěn)的趨勢(shì)，前30 min消耗量最大，達(dá)70%以上，至45 min，各品種EGCG質(zhì)量濃度均在0.05 mg/mL以下，ECG質(zhì)量濃度均在0.015 mg/mL以下，消耗量在90%以上；不同品種比較，福鼎大白和金觀音的EGCG和ECG消耗量顯著大于英紅9號(hào)和櫧葉齊品種，前2 個(gè)品種的EGCG組分在發(fā)酵30 min時(shí)質(zhì)量濃度在0.04 mg/mL以下，而英紅9號(hào)和櫧葉齊EGCG保留量均高于0.10 mg/mL。GCG組分除櫧葉齊呈逐漸下降的趨勢(shì)，其他3 品種呈先升后降的趨勢(shì)，峰值點(diǎn)出現(xiàn)在15～30 min，以金觀音增長(zhǎng)相對(duì)最多，后迅速消耗；CG組分總體呈前期略有上升后期平穩(wěn)的趨勢(shì)，其中以英紅9號(hào)顯著最高（P＜0.05），櫧葉齊次之，福鼎大白相對(duì)最低。

圖2 不同品種鮮葉懸浮發(fā)酵過程中4 種酯型兒茶素組分的變化Fig. 2 Variations in 4 catechin esters during suspended fermentation of fresh leaves of different cultivars

圖2E是不同品種的TETC在懸浮發(fā)酵過程中的變化，從鮮葉來看，英紅9號(hào)顯著最高（P＜0.05），達(dá)0.872 mg/mL，福鼎大白略高于金觀音，櫧葉齊最低，僅0.697 mg/mL。整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中前30 min TETC消耗最快，不同品種相比以英紅9號(hào)和櫧葉齊仍有部分保留（保留量0.190 mg/mL以上），這與較低活性的PPO相關(guān)，而具有高PPO活性的福鼎大白和金觀音品種在發(fā)酵30 min后TETC均低于0.080 mg/mL，氧化消耗率均在90.0%以上。而后在發(fā)酵45 min后緩慢趨于穩(wěn)定，各品種TETC差異不顯著。整體上，以英紅9號(hào)的TETC消耗量最大，達(dá)0.842 mg/mL，金觀音次之，櫧葉齊相對(duì)最低，僅0.650 mg/mL。

圖3 不同品種鮮葉懸浮發(fā)酵過程中TAC的變化Fig. 3 Variations in total amount of catechins during suspended fermentation during fresh leaves of different cultivars

懸浮發(fā)酵過程中不同品種8 種兒茶素總量（total amount of catechins，TAC）的變化規(guī)律如圖3所示。以英紅9號(hào)鮮葉TAC顯著最高（P＜0.05），達(dá)1.680 mg/mL，金觀音和福鼎大白次之，兩者相差不大，但以福鼎大白品種的TETC相對(duì)較高，金觀音品種的TSC相對(duì)較高，櫧葉齊相對(duì)最低，僅1.230 mg/mL。4 個(gè)品種TAC整體呈前30 min迅速下降的趨勢(shì)，平均下降速率以金觀音最大，達(dá)0.042 mg/（mL·min），福鼎大白次之，櫧葉齊顯著最低，僅0.030 mg/（mL·min）。發(fā)酵30～45 min間TAC在PPO和POD作用下進(jìn)一步消耗，降至在0.095 mg/mL以下，45 min后含量趨于平穩(wěn)。整體上，以英紅9號(hào)的TAC消耗量最大，達(dá)1.639 mg/mL，金觀音次之，櫧葉齊相對(duì)最低，僅1.192 mg/mL。

2.4 不同品種鮮葉酶源和底物對(duì)懸浮發(fā)酵下茶黃素組分及總量形成規(guī)律的影響

不同品種的茶黃素（theaflavin，TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（theaflavin 3-gallate，TF-3-G）、茶黃素-3’-沒食子酸酯（theaflavin 3’-gallate，TF-3’-G）、茶黃素雙沒食子酸酯（theaflavin 3,3’-digallate，TF-D-G）4 種茶黃素組分在懸浮發(fā)酵過程中的生成變化規(guī)律如圖4所示。不同品種各茶黃素組分均隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，然而不同品種茶黃素組分峰值點(diǎn)出現(xiàn)的時(shí)間不同，英紅9號(hào)和櫧葉齊在發(fā)酵30 min達(dá)到峰值，而福鼎大白和金觀音品種的PPO活性顯著較高（表1），故可以較快將兒茶素組分轉(zhuǎn)化形成茶黃素，在發(fā)酵15 min即達(dá)到峰值，而后隨著兒茶素組分消耗過快，茶黃素各組分含量逐漸下降。不同品種不同茶黃素組分的峰值差異顯著，TF組分（圖4A）以英紅9號(hào)顯著最高（P＜0.05），達(dá)0.089 mg/mL，金觀音次之（0.046 mg/mL），櫧葉齊最低，僅0.022 mg/mL；TF-3-G組分含量在發(fā)酵15min時(shí)呈福鼎大白＞金觀音＞英紅9號(hào)＞櫧葉齊（圖4B）趨勢(shì)，原因在于發(fā)酵15 min時(shí)TF-3-G組分的合成前體EGCG組分以福鼎大白品種消耗量最大（圖2A），在高PPO活性催化下達(dá)0.290 mg/mL，金觀音次之（0.244 mg/mL），櫧葉齊顯著最低（P＜0.05），僅0.127 mg/mL，然進(jìn)一步發(fā)酵金觀音和福鼎大白品種TF-3-G組分的轉(zhuǎn)化量大于生成量開始下降，而英紅9號(hào)和櫧葉齊品種兒茶素在低活性PPO作用下持續(xù)氧化轉(zhuǎn)化，加上具有較高含量的底物（圖2A），故峰值高于福鼎大白品種，且TF-3-G峰值英紅9號(hào)品種大于櫧葉齊品種；TF-3’-G組分峰值點(diǎn)呈現(xiàn)英紅9號(hào)＞金觀音＞櫧葉齊＞福鼎大白的特點(diǎn)。TF-D-G組分峰值以福鼎大白品種顯著最高，英紅9號(hào)品種底物更多地用于TF-3-G組分的形成，故TF-D-G組分峰值低于福鼎大白品種，然而高組分的兒茶素底物保證了英紅9號(hào)品種的4 個(gè)茶黃素組分在30 min以后的發(fā)酵時(shí)間里均顯著高于其他3 個(gè)品種，而櫧葉齊品種雖兒茶素底物含量較低，但PPO和POD活性亦較低，故茶黃素組分轉(zhuǎn)化成茶紅素、茶褐素等能力差，故在TF、TF-3-G、TF-D-G等組分含量在發(fā)酵60 min以后高于金觀音和福鼎大白品種。

圖4 不同品種鮮葉懸浮發(fā)酵過程中4 種茶黃素組分含量和總量的變化Fig. 4 Variations in the contents of four theaf l avins during suspended fermentation of fresh leaves of different cultivars

不同品種4種茶黃素總量隨著發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律如圖4E所示。因高活性PPO、發(fā)酵前15 min較高消耗量的EGC、EGCG、ECG等組分，導(dǎo)致金觀音和福鼎大白品種在發(fā)酵15 min時(shí)茶黃素總量出現(xiàn)峰值，且金觀音品種略高于英紅9號(hào)品種。而較低活性的PPO和POD（表1）可持續(xù)氧化最高兒茶素底物含量的英紅9號(hào)品種，可實(shí)現(xiàn)茶黃素的持續(xù)生成，在30 min達(dá)到峰值，為0.226 mg/mL，極顯著高于其他品種（P＜0.01），并且直至120 min發(fā)酵結(jié)束，仍顯著最高（P＜0.05）。櫧葉齊品種則因相對(duì)最低活性的PPO（1.004 U/g），以及相對(duì)最低含量的兒茶素底物（圖3），茶黃素總量峰值顯著最低，然而較低活性的POD可減少TFS的再轉(zhuǎn)化，故發(fā)酵60 min后櫧葉齊茶黃素總量略高于福鼎大白和金觀音品種。

從總體上看，不同茶樹品種，對(duì)應(yīng)的兒茶素底物濃度和組分比例以及酶源活性和配比顯著不同，進(jìn)而直接影響茶黃素的生成速率和生成量，具有顯著最高TAC的英紅9號(hào)品種可產(chǎn)生顯著最多的茶黃素（P＜0.05）；福鼎大白和金觀音品種的TAC相近，然而組成不同，其中以福鼎大白TETC/TSC相對(duì)較高，且PPO/POD值顯著高于金觀音品種（P＜0.05），故福鼎大白品種可產(chǎn)生第2高的茶黃素，但TAC顯著低于英紅9號(hào)，故茶黃素形成能力略差于英紅9號(hào)，而TAC含量和PPO/POD值顯著最低的櫧葉齊品種，茶黃素的形成速率和形成量顯著最低（P＜0.05）。

3 結(jié) 論

4 個(gè)品種鮮葉PPO活性、POD活性、PPO/POD值差異顯著，其中PPO活性以福鼎大白品種顯著最高，以櫧葉齊品種顯著最低；POD活性以櫧葉齊品種最高，福鼎大白品種顯著最低；PPO/POD值以福鼎大白最高，英紅9號(hào)次之。

不同品種的簡(jiǎn)單兒茶素組分以EGC含量最高，EC次之；酯型兒茶素組分以EGCG含量最高，ECG次之；酯型兒茶素的鮮葉原始量和氧化消耗量均大于簡(jiǎn)單兒茶素，TSC和TETC均以英紅9號(hào)顯著最高，櫧葉齊顯著最低；兒茶素各組分除GCG和CG外均呈前期劇烈消耗下降，后期平穩(wěn)的趨勢(shì)，巨降期均在發(fā)酵前30 min。

不同品種的不同茶黃素組分形成能力和形成量差異顯著，各茶黃素組分均呈先升后降的趨勢(shì)，但峰值點(diǎn)時(shí)間和峰高不同，其中英紅9號(hào)和櫧葉齊各茶黃素總量組分峰值點(diǎn)均為發(fā)酵30 min，福鼎大白和金觀音品種則為15 min，茶黃素總量以英紅9號(hào)最大，福鼎大白和金觀音次之，櫧葉齊顯著最低。

PPO/POD值和兒茶素含量及配比兩者對(duì)茶黃素的形成具有同等關(guān)鍵作用，高兒茶素底物含量的同時(shí)，需配有對(duì)應(yīng)高PPO活性和PPO/POD值，才能快速高效地形成茶黃素，同時(shí)減少茶黃素的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，保持高茶黃素的形成，同等兒茶素含量以TETC/TSC值較高者，即酯型兒茶素含量較高，更有利于茶黃素的形成。