楊 凡，劉鈺妮，王世恩，湯桂成，夏 燕，曹春雨2，▲

(1.三峽大學第二人民醫(yī)院腫瘤放化療科， 湖北宜昌 443000；2.湖北民族學院附屬民大醫(yī)院風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室，湖北恩施 445000；3.三峽大學醫(yī)學院腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443002)

三陰性乳腺癌泛指不表達或低表達雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體-2(HER-2)的一類乳腺癌[1]。盡管三陰性乳腺癌僅占臨床乳腺癌病例的15%～20%，但相比其他類型，三陰性乳腺癌侵襲能力強，常伴有遠處多發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移，因而患者預后差。近年來，多種針對ER或HER-2靶點的抗乳腺癌小分子藥物和抗體如他莫昔芬、拉帕替尼、曲妥珠單抗等顯示了臨床治療乳腺癌的效果[2-3]。但三陰性乳腺癌不表達或低表達上述受體，對上述靶向治療不敏感，目前仍亟需除化療以外的抗三陰性乳腺癌藥物和治療方法。信號通路蛋白Akt，即蛋白激酶B在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，已成為重要的抗腫瘤治療靶點[4]。研究表明，Akt可通過其激酶活性介導PI3K-Akt-mTOR信號通路過度活化，促進三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，是治療三陰性乳腺癌的靶點[5]。目前已開發(fā)了多種Akt激酶抑制劑，如MK-2206、Afuresertib和厚樸酚等用于臨床抗腫瘤治療研究[6-8]。其中，MK-2206是一種口服有效的變構(gòu) Akt 抑制劑,目前已進入Ⅱ期臨床抗腫瘤研究。有研究表明，MK-2206能有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞系MCF-7對阿霉素的耐藥性[9]。鑒于Akt在三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究使用Akt抑制劑MK-2206與三陰性乳腺癌臨床一線化療藥物順鉑聯(lián)合用于抗MDA-MB-468細胞增殖作用研究，以評價抑制Akt活性對順鉑抗三陰性乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-468購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。DMEM細胞培養(yǎng)基購自Gibico公司，胎牛血清購自天津灝洋公司。質(zhì)粒pCMV-3tag6-ac-Akt和其對照質(zhì)粒載體pCMV-3tag6為北京協(xié)和醫(yī)學院董文吉教授饋贈，并經(jīng)上海生工公司DNA測序驗證。MK-2206、CCK-8試劑盒購自MCE公司、順鉑購自Sigma公司， BCA試劑盒、AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自Thermo公司?？谷薆ax、Bcl-2、Cytochrome C和抗人β-actin(C4)購自Santa Cruz 公司?？谷薃kt、pSer473 Akt、pThr308 Akt購自Cell Signaling Technology公司。辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠和羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1CCK-8法細胞增殖檢測 細胞傳代于96孔細胞培養(yǎng)板(1×103個/孔)，16 h后以0～50 μmol/L梯度濃度MK-2206和0～10 mol/L梯度濃度順鉑分別處理MDA-MB-468細胞24、48 h。對照組加入等體積二甲基亞砜(DMSO)，以不加入CCK-8試劑的細胞對照組為空白組。達藥物處理指定時間點后，棄去細胞培養(yǎng)基、每孔加入100 μL含CCK-8試劑的細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。使用全波長酶標分析儀檢測450 nm波長的光密度(OD)值，并以如下計算公式計算細胞存活率，使用CompuSyn2.0軟件計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

細胞存活率(%) =[(藥物處理組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%

1.2.2Western blot分析蛋白表達 4 ℃預冷的RIPA全細胞裂解液加入蛋白酶抑制劑cocktail后重懸細胞，放置于混旋儀上4 ℃裂解15 min。然后以10 000×g離心10 min，分離細胞裂解液上清液，以BCA法測定其總蛋白含量。然后加入上樣緩沖液并于100 ℃孵育5 min后完成樣品制備。樣本以總蛋白25 g/孔上樣后經(jīng)10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)(250 mA,2.5 h)至硝酸纖維素膜。然后以TBST (20 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,0.05% Tween-20,pH 7.4)溶液配制的5%脫脂奶粉溶液對硝酸纖維素膜室溫封閉1 h，再分別加一抗 (Cytochrome C 1∶3 000，Bax 1∶1 000，Bcl-2 1∶1 000，β-actin 1∶3 000,Akt 1∶1 000,pSer473 Akt 1∶1 000,pThr308 Akt 1∶1 000。以含1%小牛血清清蛋白TBST溶液稀釋)于4 ℃共孵育16 h洗滌后與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000,TBST溶液稀釋)于室溫孵育1 h，最后加入ECL試劑，使用Bioshine顯影儀(上海歐翔科學儀器有限公司)顯影。β-actin為樣品內(nèi)參照。

1.2.3Annexin V/PI 雙染法分析細胞凋亡 傳代細胞至6孔板(2×105個/孔)，16 h后以2 mol/L MK-2206與0.5 mol/L順鉑分別或聯(lián)合處理MDA-MB-468細胞24 h后以胰酶消化，加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)重懸成單個細胞懸液。按照試劑盒操作步驟進行PI和Annexin V標記，以流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測。

1.2.4線粒體裂解液和細胞質(zhì)裂解液的制備 本實驗中使用預冷的細胞裂解液500 μL于冰上裂解1×106個細胞15 min，使細胞膜裂解而保留線粒體膜和細胞核膜完整，然后于1 000 r/min、4 ℃離心10 min將細胞核與線粒體組分和細胞質(zhì)分離。再收集上清液于12 000 r/min、4 ℃離心15 min沉淀線粒體，離心所得上清液為細胞質(zhì)。然后使用200 μL線粒體裂解液[10 mmol/L Tris(pH 7.4),150 mmol/L NaCl,1% Triton X-100,5 mmol/L EDTA(pH 8.0)，臨用前加入蛋白酶抑制劑cocktail]于4 ℃裂解15 min，獲得線粒體蛋白裂解液。

1.2.5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 傳代2×105個細胞于6孔細胞培養(yǎng)板并持續(xù)培養(yǎng)16 h使細胞生長至80%融合，取質(zhì)粒pCMV-3tag6-ac-Akt(隨過表達組)和其對照質(zhì)粒載體pCMV-3tag6(空白組)以Lipofectamine2000TM試劑進行細胞轉(zhuǎn)染，實驗中每孔細胞取2 g質(zhì)粒和4 L Lipofectamine2000TM,按照生產(chǎn)商提供的操作步驟實施。轉(zhuǎn)染36 h后，進行相應(yīng)藥物處理或制備細胞裂解液進行蛋白表達分析。

1.2.6細胞增殖的藥物協(xié)同作用分析 細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板(1×104個/孔)、繼續(xù)培養(yǎng)16 h使細胞生長至80%融合，同時加入順鉑和MK-2206(終濃度為0、0.1 μmol/L順鉑+0.1 μmol/L MK-2206、0.25 μmol/L順鉑+0.25 μmol/L MK-2206、0.5 μmol/L順鉑+0.5 μmol/L MK-2206、1 μmol/L順鉑+1 μmol/L MK-2206、2 μmol/L順鉑+2 μmol/L MK-2206、5 μmol/L順鉑+5 μmol/L MK-2206)，每個藥物濃度設(shè)3個復孔。24 h后，以前述CCK-8法進行細胞增殖檢測。按照Chou-Talalay中位效應(yīng)與聯(lián)合指數(shù)模型進行順鉑和MK-2206聯(lián)合效應(yīng)分析[10-11]，實驗數(shù)據(jù)以CompuSyn 2.0軟件進行藥物聯(lián)合作用分析，兩藥物的聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)<1為協(xié)同效應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1MK-2206抑制MDA-MB-468細胞增殖 MK-2206和順鉑均能夠以濃度和時間依賴性的方式顯著抑制MDA-MB-468細胞增殖，其中MK-2206的24 h IC50為11.23 μmol/L、順鉑的24 h半數(shù)抑制濃度為1.35 μmol/L，見圖1。

a:P<0.05,b：P<0.01，與未添加MK-2206或順鉑時比較

圖1 MK-2206和順鉑對MDA-MB-468細胞增殖的影響

2.2MK-2206通過抑制Akt磷酸化促進順鉑抑制MDA-MB-468細胞增殖 2、5 μmol/L MK-2206均可顯著抑制細胞內(nèi)Akt Thr308和Ser473的磷酸化(圖2A)；而過表達組活化的Akt可顯著拮抗順鉑對MDA-MB-468細胞的增殖抑制作用,與空白組相比，過表達組Akt的過表達使順鉑對MDA-MB-468細胞的IC50從1.12 μmol/L提高到1.75 μmol/L(圖2B、C)。2 μmol/L MK-2206與0～10 μmol/L梯度濃度順鉑聯(lián)合應(yīng)用可促進順鉑對MDA-MB-468細胞的增殖抑制；但過表達組活化的Akt 可部分抵消MK-2206對順鉑抑制MDA-MB-468細胞增殖的促進作用(圖2D)。

A、B：Western blot檢測細胞內(nèi)Akt磷酸化水平；C：CCK-8法檢測過表達組成性激活Akt對順鉑抑制MDA-MB-468細胞增殖作用的影響；D：CCK-8法檢測過表達組成性激活Akt對順鉑單獨或聯(lián)合2 μmol/L MK-2206抑制MDA-MB-468細胞增殖作用的影響。a:P<0.05,b：P<0.01

圖2 MK-2206與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對MDA-MB-468細胞增殖的影響

2.3MK-2206促進順鉑誘導的MDA-MB-468細胞凋亡 AnnexinV/PI檢測結(jié)果顯示，2 μmol/L MK-220不能誘導MDA-MB-468細胞凋亡，但可顯著促進0.5 μmol/L順鉑誘導的細胞凋亡(圖3A)。Western blot結(jié)果表明，2 μmol/L MK-2206與0.5 μmol/L順鉑聯(lián)合處理導致MDA-MB-468細胞內(nèi)Bax蛋白和細胞質(zhì)細胞色素C表達顯著上升，而Bcl-2蛋白和線粒體細胞色素C表達顯著下調(diào)(圖3B)。

2.4MK-2206與順鉑協(xié)同抑制MDA-MB-468細胞增殖 MK-2206與順鉑的半數(shù)有郊劑量(50% effective dose，ED50)、ED75和ED90時的CI值分別為0.65±0.05、0.64±0.07 和0.63±0.08 ，均小于1，見圖4。

A：Annexin V/PI雙染法進行細胞凋亡分析;B：Western blot檢測MDA-MB-468細胞內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達和細胞質(zhì)、細胞線粒體內(nèi)細胞色素C水平

圖3 MK-2206和順鉑聯(lián)合應(yīng)用對MDA-MB-468細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響

A：MK-2206和順鉑在ED50、ED75和ED90時的CI；B：MK-2206和順鉑聯(lián)合應(yīng)用的CI值分布圖(CompuSyn2.0軟件分析)

圖4 MK-2206和順鉑聯(lián)合應(yīng)用抑制MDA-MB-468細胞增殖的協(xié)同效應(yīng)分析

3 討 論

大量研究表明，Akt作為一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用，其可通過下游信號蛋白分子mTOR、P21等調(diào)控細胞增殖、凋亡自噬和能量代謝，是近年來抗腫瘤研究的重要靶點[11]。如前所述，Akt蛋白激酶的過度活化也是導致三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。2016年以來，MA等[12]將Akt抑制劑MK-2206與雌激素受體抑制劑fulvestrant聯(lián)合用于ER陽性和Her-2陰性乳腺癌的臨床研究，發(fā)現(xiàn)可有效促進fulvestrant誘導的ER陽性和Her-2陰性乳腺癌細胞凋亡，但將MK-2206與芳香化酶抑制劑Anastrozole聯(lián)合用于ER陽性和Her-2陰性乳腺癌臨床研究并未取得良好的治療效果[13]。

順鉑是目前臨床廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)抗三陰性乳腺癌化療藥物之一，但毒副作用較大且長期應(yīng)用易導致化療抵抗效應(yīng)產(chǎn)生[14]。本研究首先觀察了MK-2206對人三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MK-2206能夠抑制人三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞增殖，同時較低濃度(2 μmol/L)MK-2206可顯著抑制Akt磷酸化水平并顯著促進順鉑對MDA-MB-468細胞的增殖抑制作用。

研究表明，Akt激酶活化時發(fā)生473位絲氨酸和308蘇氨酸磷酸化，而通過將這兩個位點的氨基酸突變成天冬氨酸能夠模擬Akt磷酸化，從而獲得組成性活化的Akt用于其功能研究[15]。為分析MK-2206是否通過抑制Akt磷酸化發(fā)揮作用，實驗中在MDA-MB-468細胞中過表達組成性活化的Akt，然后首先檢測了Akt磷酸化對順鉑抗細胞增殖作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達組成性活化的Akt可將順鉑對MDA-MB-468細胞的IC50上調(diào)，拮抗其對MDA-MB-468細胞的增殖抑制作用。進一步以2 μmol/L MK-2206與順鉑聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，MK-2206能夠促進順鉑對人三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞的增殖抑制作用，但過表達組成性活化的Akt可部分逆轉(zhuǎn)這一作用。這一結(jié)果表明，MK-2206通過抑制Akt磷酸化促進順鉑對MDA-MB-468細胞的增殖抑制。

AnnexinV/PI細胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，2 μmol/L MK-2206不能誘導MDA-MB-468細胞凋亡，但能夠顯著促進順鉑誘導的MDA-MB-468細胞凋亡。通過進一步檢測MDA-MB-468細胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，MK-2206能夠顯著促進順鉑誘導的Bax蛋白表達下調(diào)和Bcl-2蛋白表達上調(diào)，同時其也促進了順鉑誘導的線粒體膜內(nèi)側(cè)細胞色素C發(fā)生細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。由于Akt激酶活性過度活化是腫瘤細胞拮抗細胞凋亡的重要因素，MK-2206抑制Akt激酶磷酸化是其促進順鉑誘導細胞凋亡的主要原因。進一步進行藥物聯(lián)合效應(yīng)分析顯示，MK-2206和順鉑能夠在較低的作用濃度下(ED50)顯示出抗MDA-MB-468細胞增殖的藥物協(xié)同作用。這一結(jié)果提示，使用MK-2206抑制Akt有望降低順鉑抗三陰性乳腺癌治療的有效濃度，從而減少順鉑的毒副作用和化療耐藥的發(fā)生。

綜上所述， MK-2206通過抑制Akt激酶促進順鉑誘導的線粒體途徑細胞凋亡，并與順鉑通過藥物協(xié)同作用抑制MDA-MB-468細胞增殖。上述研究表明，MK-2206與順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有潛在的抗三陰性乳腺癌臨床應(yīng)用價值。