張 杰，黃伯彥，門海濤△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科 400016;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤中心，成都 610041)

內(nèi)皮抑素(endostatin)可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮抗腫瘤新生血管生成的作用，從而抑制腫瘤生長。筆者團(tuán)隊在前期研究中成功構(gòu)建內(nèi)皮抑素重組腺病毒(Ad-hE)，發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠通過尾靜脈注射Ad-hE后，血清中內(nèi)皮抑素的水平可較長時間保持在高水平，腫瘤內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖明顯減弱，腫瘤生長受到顯著抑制[1]。但據(jù)報道，腫瘤患者在面對“癌癥”診斷時，大多數(shù)會有長期的負(fù)性情緒而處于一種“慢性應(yīng)激”狀態(tài)[2]，促進(jìn)以去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)為代表的壓力相關(guān)激素釋放[3]。NE可以激活β-腎上腺素受體(β-adrenergic receptor,β-AR)后上調(diào)乏氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)等因子表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移等，而NE的這些效應(yīng)可以用β-AR阻斷劑普萘洛爾(propranolo)進(jìn)行阻斷[4-6]。本研究擬通過構(gòu)建荷瘤小鼠慢性束縛應(yīng)激模型，探索慢性應(yīng)激對Ad-hE效療的影響，并試圖探討其中可能存在的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Hyclone公司；NE購自美國Sigma-Aldrich公司；普萘洛爾購自Enzo公司；兔抗鼠HIF-1α、兔抗鼠CD31抗體購自美國Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；冰凍切片包埋劑(OCT)購自瑞士Leica公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞LL/2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞匯合率在70%～80%左右時進(jìn)行細(xì)胞傳代、擴(kuò)增，按5×104/孔將LL/2細(xì)胞接種于六孔板，于37 ℃，5% CO2孵箱中孵育過夜。過夜后細(xì)胞已貼壁，此時將細(xì)胞上清液棄去并替換為不含血清的DMEM新鮮培養(yǎng)基，再次孵育過夜。次日吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將不含血清的DMEM培養(yǎng)基按以下分組加入相應(yīng)試劑后分別處理各組細(xì)胞：(1)單純細(xì)胞培養(yǎng)基(Control組)；(2) 10 μmol/L NE(NE組)；(3) 10 μmol/L普萘洛爾(Prop組)；(4) 10 μmol/L NE+10 μmol/L普萘洛爾(NE+Prop組)。普萘洛爾在加入NE前1小時加入，每孔液體總量控制在2 mL。處理48 h后收集細(xì)胞上清液，用于ELISA檢測。提取細(xì)胞蛋白用于Western blot檢測。

1.2.2HIF-1α蛋白檢測 細(xì)胞經(jīng)上述處理48 h后棄去上清液并提取總蛋白，Nanodrop超微量分光光度計測量蛋白濃度，配置好十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠倒入制膠器具，待自然凝固后上層加入SDS-PAGE濃縮膠，將梳子插入濃縮膠。待膠體凝固后拔出梳子，將膠體盛放于電泳緩沖液，加入制備好的蛋白進(jìn)行電泳。濃縮膠80 V電泳，當(dāng)?shù)鞍组_始分離時調(diào)整電壓為120 V，蛋白分離后停止電泳。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，轉(zhuǎn)膜電壓條件100 V 90 min。5%脫脂牛奶封閉蛋白，兔抗鼠HIF-1α抗體4 ℃孵育過夜。第2天TBST清洗條帶后，室溫孵育羊抗兔二抗2 h，再次用TBST清洗條帶。加入化學(xué)發(fā)光顯影液后立即于化學(xué)發(fā)光成像儀下曝光，觀察NE及普萘洛爾對細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響。

1.2.3荷瘤小鼠慢性束縛應(yīng)激模型的建立及分組 采用4～6周雌鼠C57BL/6，均購自四川大學(xué)華西實驗動物中心。本研究中動物實驗通過華西醫(yī)院動物實驗倫理審查，所有關(guān)于小鼠實驗操作均嚴(yán)格遵循四川大學(xué)動物倫理委員會動物倫理學(xué)原則。培養(yǎng)中的LL/2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、離心后，用無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整數(shù)量為5×106/mL，將100 μL細(xì)胞懸液接種于小鼠右側(cè)背部皮下。待小鼠皮下可捫及結(jié)節(jié)后將小鼠分組，每組5只分別接受：(1)Ad-hE治療(Ad-hE組)；(2)Ad-hE聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激(Ad-hE+Res組)；(3)Ad-hE聯(lián)合β-AR阻斷劑普萘洛爾(Ad-hE+Prop組)；(4)Ad-hE聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激及普萘洛爾阻斷(Ad-hE+Prop+Res組)。Ad-hE劑量為1×109/PFU，尾靜脈注射。慢性束縛應(yīng)激方式為小鼠固定于束縛管中可自由呼吸但身體無法移動，每天2 h。普萘洛爾處理劑量為每天1 μmol/100 g，腹腔注射，其余組則腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)。每3天用游標(biāo)卡尺記錄皮下腫瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積 (mm3)=長徑×短徑2×0.52。21 d后麻醉小鼠并斷頸處死，留取血清妥善保存用于ELISA檢測。剝離皮下腫瘤組織、稱質(zhì)量、包埋于OCT妥善保存用以制備切片及免疫組織化學(xué)檢測。

1.2.4ELISA 將上述收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液、小鼠血清加入ELISA試劑盒中的板條，加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，封閉反應(yīng)孔，于37 ℃孵箱孵育90 min。洗滌液洗板5次后加入生物素化抗體，37 ℃孵箱孵育60 min。洗板5次后加入酶結(jié)合工作液，37 ℃孵箱避光孵育30 min。再次洗板5次后加入顯色底物37 ℃孵箱避光孵育15 min，加入終止液于酶標(biāo)儀450 nm檢測光密度(OD450 nm)值。以O(shè)D值作縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線，計算細(xì)胞上清液及小鼠血清中VEGF水平。該試驗嚴(yán)格按其說明書操作步驟進(jìn)行。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31 包埋于OCT的腫瘤組織于冰凍切片機(jī)中制備約5 μm厚冰凍切片，采用4 ℃丙酮固定切片，0.3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶。孵育兔抗鼠CD31一抗及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗， DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明切片、樹膠封片。于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個視野計數(shù)微血管數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1慢性應(yīng)激對Ad-hE抗腫瘤生長的影響 Ad-hE+Res組小鼠在慢性應(yīng)激21 d后的腫瘤體積達(dá)到了(2 513.02±357.78)mm3，而Ad-hE、Ad-hE+Prop及Ad-hE+Prop+Res組小鼠的腫瘤體積分別為(207.65±35)、(275.08±25.09)、(696.84±126.63)mm3，將各時間點腫瘤體積進(jìn)行重復(fù)測量方差分析后顯示Ad-hE+Res組小鼠的腫瘤體積明顯大于其他組(P<0.01)。Ad-hE+Res組小鼠的腫瘤質(zhì)量在慢性應(yīng)激21 d后為(0.70±0.13)g，而Ad-hE、Ad-hE+Prop及Ad-hE+Prop+Res組小鼠的腫瘤質(zhì)量則分別為(0.11±0.03)、(0.10±0.02)、(0.24±0.06)g，Ad-hE+Res組小鼠的腫瘤質(zhì)量明顯大于其他組(P<0.01)。而接受慢性應(yīng)激時予以Prop進(jìn)行干預(yù)(Ad-hE+Prop+Res組)，雖然腫瘤體積及腫瘤質(zhì)量仍大于Ad-hE組(P=0.021、0.017)及Ad-hE+Prop組(P=0.031、0.012)，但卻明顯小于Ad-hE+Res組(P<0.01)。

2.2慢性應(yīng)激對Ad-hE抗腫瘤新生血管生成的影響 Ad-hE+Res組小鼠的皮下腫瘤內(nèi)微血管數(shù)量為72.33±6.20，明顯多于其他組(Ad-hE、Ad-hE+Prop及Ad-hE+Prop+Res組分別為11.00±2.00、9.33±2.16、32.17±3.31，P<0.01)，Ad-hE+Prop+Res組小鼠的腫瘤內(nèi)微血管數(shù)雖然多于Ad-hE組(P<0.01)及Ad-hE+Prop組(P<0.01)，卻明顯小于Ad-hE+Res組(P<0.01)。見圖1。

A：Ad-hE組；B:Ad-hE+Res組；C;Ad-hE+Prop組；D：Ad-hE+Prop+Res組

圖1慢性束縛應(yīng)激促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管生成

2.3慢性應(yīng)激對VEGF分泌的影響 Ad-hE+Res組小鼠的血清VEGF水平為(195.00±17.70)ng/mL，明顯高于Ad-hE、Ad-hE+Prop及Ad-hE+Prop+Res組，分別為[(70.00±5.70)、(70.60±11.15)、(121.00±9.41)ng/mL，P<0.01)]，Ad-hE+Prop+Res組小鼠的VEGF水平高于Ad-hE組(P<0.01)及Ad-hE+Prop組(P<0.01)，但依然小于Ad-hE+Res組(P<0.01)。而體外試驗中，Control、NE、Prop及NE+Prop各組的細(xì)胞上清液中VEGF水平分別為(45.60±5.32)、(183.20±7.12)、(46.80±6.83)pg/mL及(48.00±5.01)pg/mL，NE組LL/2細(xì)胞上清液中VEGF的水平顯著高于其他各組(P<0.01)，NE+Prop則與Control組(P=0.546)和Prop組(P=0.762)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4NE對HIF-1α表達(dá)的影響 LL/2細(xì)胞經(jīng)NE處理48 h后，采用Western blot檢測細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)。NE組HIF-1α表達(dá)高于其他各組(Control、NE、Prop、NE+Prop組分別為583.67±9.45、968.33±21.5、577.00±14.42、568.67±4.51)，Prop可以在蛋白表達(dá)水平抑制NE的作用，見圖2。

圖2 去甲腎上腺素上調(diào)LL/2細(xì)胞HIF-1α表達(dá)

3 討 論

實體瘤的發(fā)生發(fā)展離不開新生血管生成，“抗腫瘤新生血管能夠抑制實體瘤生長”這一理論已經(jīng)得到公認(rèn)。然而，以血管生成抑制劑的代表貝伐單抗(Bevacizumab)為例，單藥抗新生血管治療在動物實驗上取得了成功，在臨床試驗中的療效卻并不令人滿意，需要聯(lián)合化療等直接針對腫瘤細(xì)胞的治療手段才可能有效。這提示存在著某些有別于實驗動物的因素，可能影響了腫瘤患者抗新生血管治療的療效。

與實驗動物不同，大多數(shù)患者在面對“癌癥”診斷或治療的時候往往會處于慢性應(yīng)激狀態(tài)，甚至有部分患者會覺得心理壓力的影響比軀體癥狀的影響更大[2]。研究已經(jīng)證實慢性應(yīng)激會促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而誘導(dǎo)腫瘤新生血管生成則是其中一個機(jī)制[5,7]。其中，NE被認(rèn)為是與腫瘤相關(guān)的最重要的應(yīng)激相關(guān)激素(SRH)之一，也被認(rèn)為可以用于哺乳動物上模擬慢性應(yīng)激的效應(yīng)[8]。故慢性應(yīng)激應(yīng)該是腫瘤患者抗腫瘤治療療效欠佳的影響因素之一。筆者團(tuán)隊前期研究證實慢性應(yīng)激可以刺激腫瘤細(xì)胞分泌VEGF進(jìn)而影響小分子靶向藥物舒尼替尼的療效[3]。本研究試圖驗證慢性應(yīng)激是否同樣可以影響Ad-hE的抗腫瘤效果。如結(jié)果所示，在Ad-hE治療的LL/2移植瘤模型中，慢性應(yīng)激使小鼠腫瘤負(fù)荷增加，血清中VEGF水平增高，腫瘤組織中微血管密度增多。這說明慢性應(yīng)激的確可以影響Ad-hE的抗腫瘤療效。

據(jù)報道，β-AR作為HIF-1α的上游信號，激活后可以通過誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)VEGF的分泌[6,9]。筆者團(tuán)隊的研究也證明荷瘤小鼠接受慢性應(yīng)激后，外周血及腫瘤組織中的VEGF分泌均增加[3]。本研究中LL/2細(xì)胞經(jīng)NE處理后，HIF-1α的蛋白表達(dá)明顯增加，而一旦預(yù)先使用β-AR阻斷劑普萘洛爾處理，其表達(dá)水平則與對照組類似，這也證明了NE可以通過激活β-AR進(jìn)而上調(diào)HIF-1α。由于HIF-1α已經(jīng)證實可以刺激VEGF的分泌，故筆者推測β-AR-HIF-1α-VEGF是參與慢性應(yīng)激影響Ad-hE療效的一條信號通路。

慢性應(yīng)激的動物模型較多，本研究采用的是已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動物研究的慢性束縛應(yīng)激模型，該模型作為經(jīng)典的慢性應(yīng)激模型，已經(jīng)證實可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)NE和VEGF水平的增高，可以引發(fā)小鼠的焦慮樣行為[3,10]。慢性應(yīng)激對腫瘤而言，可以通過多種途徑減弱機(jī)體抗腫瘤免疫的能力[11]，還能通過誘導(dǎo)腫瘤新生血管生成導(dǎo)致腫瘤生長、侵襲[7]，甚至還有研究表明慢性應(yīng)激也是導(dǎo)致腫瘤耐藥的一大因素[12]。另外，越來越多的證據(jù)表明，NE作為慢性應(yīng)激狀態(tài)下釋放的主要激素，還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[6,13]。由此可見，慢性應(yīng)激對機(jī)體的影響是多方面的。而且，在本研究中的體內(nèi)試驗部分，β-AR 拮抗劑普萘洛爾雖然起了一定阻斷作用，但卻沒有完全拮抗慢性應(yīng)激的作用。然而在體外試驗中，NE可以明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞VEGF的分泌，普萘洛爾則可以完全抑制這種效應(yīng)。這意味著β-AR信號通路只是參與其中的一個環(huán)節(jié)，也提示慢性應(yīng)激涉及多種壓力相關(guān)激素，本研究中所探討的機(jī)制也可能只是其中的一條信號通路。

總的來說，本研究在荷瘤小鼠身上驗證了慢性應(yīng)激可以促進(jìn)腫瘤生長、誘導(dǎo)腫瘤新生血管生成，削弱Ad-hE抗腫瘤作用的療效。并結(jié)合體外研究初步探討了β-AR-HIF-1α-VEGF是涉及其中的一條信號通路。本研究也提示腫瘤患者的社會心理壓力是臨床工作中不可忽視的一部分，對腫瘤患者及時的心理干預(yù)可能對其良好的預(yù)后有著重要的作用。