姬勁銳 鎬振選 劉 靜 韓文杰 劉恒亮

激酶非催化的C-葉域蛋白質1(kinase non-catalytic C-lobe domin containing 1，KNDC1) 是最新發(fā)現(xiàn)的蛋白，其功能與(ras guanyl-nucleotide exchange factor,RasGEF)活性相關，在很多信號轉導通路的中扮演重要角色[1]。前期研究表明very-KIND的RasGEF活性通過c-JUN氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1, JNK1)和/或細胞外信號調控激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)，經由Ras-Raf-MAPK通路誘導微管關聯(lián)蛋白2(recombinant microtubule associated protein 2,MAP2)的磷酸化，MAP2磷酸化后與微管結合的活性增加，可以促進神經細胞樹突的長度增加，研究還發(fā)現(xiàn)抑制或敲低very-KIND的表達可以促進培養(yǎng)中的小腦顆粒細胞和海馬神經元的樹突生長，這表明其作為一種信號分子在發(fā)育過程中調控或者抑制神經元樹突生長[2-3],研究表明，敲除KNDC1能延緩人內皮細胞衰老[4]。然而，KNDC1過表達對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)功能的影響和分子機制尚不清楚。本研究通過構建KNDC1腺病毒表達載體，轉染HUVECs，產生KNCD1過度表達的HUVECs，進而探討其對HUVECs衰老的影響及分子機制。

材料與方法

1.細胞和試劑 臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為本實驗室從新生兒臍靜脈中分離。KNDC1腺病毒(Santa Cruz Biotechnology公司)。ECM培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Invitrogene公司)。胎牛血清(PAA公司)。β一半乳糖苷酶染色試劑盒(上海碧云天公司)。青霉素、鏈霉素(華北制藥)。SOD、GPx 檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)?？筀NDC1、抗β-actin(Santa Cruz Biotechnology 公司)。兔及鼠二抗(Cell Signaling Technology)。Trizol(Invitrogene公司)。RT-PCR試劑盒(TAKARA公司)。PCR引物(深圳華大基因)。

2. 細胞獲取和培養(yǎng) 人臍靜脈內皮細胞在無菌條件下從北京醫(yī)院新生兒臍帶中分離后用含5%胎牛血清的M199培養(yǎng)基(HyClone 公司)在37.5℃、5% CO2孵箱(Thermo 公司)中傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細胞為0代(P0)，然后第一代為1代(P1)。傳代數(shù)定義為隨后的傳代次數(shù)。培養(yǎng)基每2或3d更換一次，待細胞生長鋪滿培養(yǎng)基80%～90%時以0.125%胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。待細胞傳代6次后被接種在6孔培養(yǎng)板上。這項研究是由北京醫(yī)院倫理委員會批準進行。所有參與者監(jiān)護人均簽署知情同意書。

3. 腺病毒轉染 KNDC1腺病毒交由上海Geneway生物科技公司合成。將第六代人臍靜脈內皮細胞分為三組：①空白對照組；②陰性對照組，人臍靜脈內皮細胞轉染空白腺病毒；③K30/60/90，實驗組，人臍靜脈內皮細胞轉染30/60/90 pfu/cell腺病毒載體。

4. RNA表達分析 內皮細胞經上述處理后，用TRIZOI試劑提取每組細胞總RNA后通過qPCR檢測內皮細胞的KNDC1的mRNA的表達。檢測過程中以GAPDH作為內部參考，通過比較循環(huán)閾值(CT)計算相關mRNA的表達水平。CT值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)。因此每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)存在負性關系，即起始拷貝數(shù)越多，CT值越小，使用Sequence Detector System software version 2.1進行數(shù)據(jù)分析。

5. SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色 ECM培養(yǎng)基中的第6～10代內皮細胞用于實驗，內皮細胞被轉染不同濃度的KNDC1腺病毒后，孵育48h后，吸除細胞培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖0.9氯化鈉溶液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗2次后在室溫下用固定液固定15min。除去固定液后，用PBS沖洗3次，每次3min，并用含40 mmol檸檬酸，磷酸鈉等組成的工作液染色，然后將在37°C下培養(yǎng)10h，用普通光學顯微鏡下觀察并拍照：當細胞處于衰老狀態(tài)時，細胞胞漿呈藍色者，即為β-半乳糖苷酶染色陽性，然后計算出的細胞染色陽性總數(shù)占總細胞數(shù)的百分率，即為β-半乳糖苷酶染色陽性率。實驗共重復3次。

6. Westemblot檢測衰老相關蛋白 培養(yǎng)瓶中的內皮細胞被冷的PBS充分沖洗兩次，棄去PBS洗液，每瓶內皮細胞加120μL的蛋白裂解液(1mL RIPA裂解液加5μL蛋白酶抑制劑100mmol)，均勻滴入內皮細胞上，使用干凈的刮棒將蛋白裂解液分布均勻，將其于冰上，待裂解30min后收集細胞裂解液，放置離心機中在4℃條件下，以12 000r/min,離心20min，收集上清液后獲得胞漿蛋白。蛋白質濃度用BCA試劑盒使用Bio-Rad蛋白法測定。相同蛋白質量(30μg/泳道)用10% SDS-PAGE分離并轉移到PVDF薄膜上。短暫清洗后，將PVDF膜置于脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉30min，將PVDF膜分別放進以下新鮮配制的一個或多個1∶1 000稀釋原代兔抗體培養(yǎng)：KNDC1、p53、p-p53等。在4℃條件下,孵育原代抗體并與相應的山羊抗兔二抗體孵育1h。蛋白條帶用高性能的放射自顯影膠片觀察，化學發(fā)光試劑曝光后用凝膠成像分析系統(tǒng)分析。采用圖像分析系統(tǒng)對western印跡結果進行分析。

圖1P1～5 SA-β-gal染色細胞衰老情況;B:PCR檢測KNDC1的mRNA水平;C:western blot檢測KNDC1的表達水平,注:與P1比較,*P<0.05

7. 細胞抗氧化酶測定 體內的主要酶性抗氧化劑包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)。哺乳動物SOD有三種同工酶，存在于胞漿和細胞膜中的含銅與鋅超氧化物歧化酶(CuZn- Superoxide dismutase, CuZn-SOD)，線粒體基質中的含錳超氧化物歧化酶(Mn-Superoxide dismutase, Mn-SOD)以及分泌到細胞外的細胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase, EcSOD)。大部分EcSOD錨在細胞表面硫酸肝素蛋白聚糖和組織間隙機制，但也存在于細胞外液中。因為O2-難以穿過細胞膜，SOD同工酶主要在他們各自的部位發(fā)揮保護作用，催化O2-生成H2O2，再由過氧化氫酶催化生成水和氧氣，進而清除氧代謝產物對機體的毒害作用。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)主要是在胞漿和線粒體基質中，GPX系統(tǒng)是水溶性的，膜脂過氧化生成的磷脂氫過氧化物只在受到磷脂酶A2水解成游離的脂氫過氧化物后才能與之反應。如同SOD有EcSOD一樣，GPX也有細胞外谷胱甘肽過氧化物酶(extracellular glutathione peroxidase, EcGPX)，它不但能催化H2O2和烷氫過氧化物還原，還能催化磷脂氫過氧化物還原，它在保護細胞外液成份和細胞表面免受過氧化物損傷方面起重要作用。本實驗通過分光光度法檢測各組臍靜脈內皮細胞中SOD活性和GPX含量。

8.統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,三組比較采用單因素方差分析比較，兩組間比較采用SNK方法進行。 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. 體外培養(yǎng)的不同代次內皮細胞的改變 衰老細胞生長緩慢，具有典型的增大、扁平的形態(tài)特點。隨著細胞代齡的增加，SA-β-gal染色顯示衰老內皮細胞數(shù)目逐漸增多(圖1P1～5)。觀察KNDC1是否與正常細胞的衰老有關，人臍靜脈內皮細胞不同代次的KNDC1表達水平用qPCR和Western blot分析，結果示隨著人臍靜脈內皮細胞代次的增加，KNDC1轉錄水平(圖1-B)和表達水平升高(圖1-C)。

2.各組臍靜脈內皮細胞KNDC1轉錄與表達情況 為了進一步探討KNDC1與人臍靜脈內皮細胞衰老的關系，我們通過對第六代內皮細胞轉染KNDC1腺病毒后發(fā)現(xiàn)，實驗組內皮細胞KNDC1 mRNA水平較對照組增高239%～344% (P<0.05)。與之類似的是，KNDC1蛋白表達量也出現(xiàn)了顯著的增高(P<0.05)，并且呈現(xiàn)劑量反應性增高。①Werstern blot 顯示 KNDC1 在各劑量實驗組表達量均明顯增高。②與空白對照組及陰性對照組相比，30epu/cell、60epu/cell、90epu/cell KNDC1腺病毒實驗組KNDC1蛋白表達量分別增高了2.2、2.8及3.6倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。③30epu/cell、60epu/cell、90epu/cell KNDC1腺病毒實驗組KNDC1 mRNA表達量是空白對照組的2.4、2.6及3.4倍，與空白對照組比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

圖3 轉染KNDC1腺病毒后SA-β-gal染色情況 注：C 空白對照組；A 陰性對照組，轉染空白腺病毒；K30/60/90 實驗組， 轉染30/60/90epu/cell KNDC1腺病毒

圖2 KNDC1的轉錄水平與表達

3.各組內皮細胞β-半乳糖苷酶染色情況 KNDC1過表達能顯著促進人臍靜脈內皮細胞衰老，表明與對照細胞相比KNDC1過表達的細胞具有更高的SA-β-gal染色陽性率。本研究轉染30epu/cell空白腺病毒、30epu/cell、60epu/cell、90epu/cell KNDC1腺病毒作用于HUVECS 24h，隨著KNDC1腺病毒濃度的增加，衰老細胞比例逐漸增多(P<0.01)，顯出明顯的劑量依賴性，各組衰老細胞比例分別為(6.2±1.3)% (C), (8.2±0.3)% (A), (26.3±2.5)% (K30), (62.9±2.8)% (K60) and(55.3±5.8)% (K90)。三個實驗組衰老細胞比例均較空白對照組差異有統(tǒng)計學意義，實驗組60epu/cell組與30epu/cell組，差異有統(tǒng)計學意義，而與90epu/cell組，差異無統(tǒng)計學意義，因此下面實驗中KNDC1腺病毒實驗組均轉染60epu/cell KNDC1腺病毒，見圖3。

4.人臍靜脈內皮細胞KNDC1過表達對p53及磷酸化p53活性的影響 為了進一步探討在HUVECs衰老過程中相關衰老基因的參與，我們通過免疫印跡分析檢測其磷酸化形式的活化。我們發(fā)現(xiàn)p-p53作為細胞周期的一個重要的抑制劑，其表達顯著增加，也觀察到KNDC1腺病毒實驗組與空白對照組對比(244.3±19.5)vs.(113.5±9.0)，與空白對照組相比，KNDC1腺病毒實驗組內皮細胞p53表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，磷酸化p53較空白對照組有顯著性增高(P<0.05)這表明，p53通路可能是一個調節(jié)HUVECs衰老過程的重要中介。詳見圖4。

5.轉染KNDC1腺病毒對內皮細胞抗氧化酶SOD及GPx活性的影響 我們以前的研究表明，敲除KNDC1可通過降低細胞內活性氧(ROS)來延遲HUVECs衰老。在本實驗中我們驗證了實驗組和對照組SOD和GPx的變化，轉染KNDC1 24h后，內皮細胞內抗氧化酶活性均明顯降低，GPx活性為(0.82±0.062)，SOD活性為(0.84±0.079)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過這樣研究我們發(fā)放KNDC1過度表達的內皮細胞通過抑制細胞內抗氧化劑(SOD或Gpx)和刺激活性氧(ROS)的產生來顯著增加細胞衰老進程。詳見圖5。

圖4 人臍靜脈內皮細胞KNDC1過表達對P53及磷酸化p53活性的影響 注：C: 空白對照組；A: 陰性對照組，轉染空白腺病毒；K: 實驗組，轉染 60epu/cell KNDC1腺病毒

圖5 轉染KNDC1腺病毒對內皮細胞抗氧化酶SOD及GPx活性的影響注：C: 空白對照組；A: 陰性對照組，轉染空白腺病毒；K:實驗組，轉染60epu/ cell KNDC1腺病毒

討 論

增齡是冠狀動脈性疾病(CAD)的重要危險因素，而血管內皮細胞衰老在其發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[5]。衰老細胞表現(xiàn)出與衰老相關的β-半乳糖苷酶(SA-β-半乳糖苷酶)染色陽性、扁平細胞形態(tài)和基因表達模式等特征[6]。

KNDC1作為一種新型RasGEF蛋白，已被認為是一個與細胞衰老相關蛋白[7]研究發(fā)現(xiàn)KNDC1過度表達抑制海馬神經元和小腦顆粒細胞樹突的生長，而敲除KNDC1可促進海馬神經元和小腦顆粒細胞樹突長度的增加[8]。然而，KNDC1對血管內皮細胞的調控功能和機制還不清楚。由于人臍靜脈內皮細胞在體外培養(yǎng)時的有限的分裂能力被用建立生物衰老模型[9]。因此，在本研究中，體外培養(yǎng)HUVECs作為生物衰老模型，觀察KNDC1對衰老的影響。因此，在本研究中，通過體外培養(yǎng)HUVECs建立生物衰老模型，觀察KNDC1對內皮細胞衰老的影響，探討其導致內皮細胞衰老的分子機制。在實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，短期內(24h)KNDC1腺病毒轉染HUVECs導致衰老。隨著傳代次數(shù)的增加，衰老的人臍靜脈內皮細胞的數(shù)量也增加(圖1-A)，SA-β-半乳糖苷酶染色陽性數(shù)量增加(圖2)，KNDC1 mRNA轉錄水平(圖1-B)和表達水平增加(圖1-C)。

為了進一步探討KNDC1對內皮細胞衰老影響，我們采用基因轉染技術，在實驗中通過同源重組法重組腺病毒獲得含有KNDC1基因腺病毒載體。然后將含KNDC1基因的腺病毒載體轉染人臍靜脈內皮細胞中。通過比較不同劑量KNDC1腺病毒轉染陽性率，我們發(fā)現(xiàn)，60pfu /cell組與90pfu /cell組陽性率相似，但是明顯高于30pfu /cell組。RT-PCR和Western blot顯示在24h后，KNDC1腺病毒載體組mRNA和蛋白的表達水平明顯高于空載體組和空白對照組，差異有顯著性(P<0.05，圖2)。據(jù)觀察，當轉染KNDC1腺病毒載體的內皮細胞KNDC1表達上調時，其細胞典型的形態(tài)較同代次的對照組發(fā)生顯著改變，包括：體積增大，多核化和更高的SA-β-gal染色陽性率。

KNDC1過表達導致對細胞生長調節(jié)密切相關基因(p-p53)表達的改變，這與之前的研究一致[10]。以前的研究證實p53是DNA損傷反應的調節(jié)因子，p53/p21被認為在過氧化氫誘導的細胞生長、休止和復制衰老中起作用[11]。轉錄因子p53無疑是抑制衰老的最重要的蛋白之一，其多個功能作用于維持基因組的完整性[12]，特定環(huán)境下執(zhí)行的特定生物反應包括短暫或永久性細胞周期阻滯到細胞死亡[13]。在這項研究中，Western blot實驗表明，轉染KNDC1腺病毒載體的內皮細胞，p53的表達無明顯變化，但是磷酸化p53顯著增加。據(jù)報道，p53蛋白穩(wěn)定性的調控主要是一些蛋白修飾，p53蛋白的磷酸化、乙?；蛄姿峄揎椌鸬椒€(wěn)定p53的作用[14]。因此磷酸化p53增高說明KNDC1通過調節(jié)p53蛋白修飾，增加功能性p53的表達量，繼而激活下游基因，而發(fā)揮致衰老作用[15]。

最近研究表明，p53通過調節(jié)能量代謝和氧化應激來發(fā)揮其抗增殖作用[16]。細胞內ROS水平的增加是與衰老相關的應激因子之一[17]。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，磷酸化p53水平增加，這將導致ROS的劑量依賴性增加產生。因此，p53通路的激活可能是對ROS誘導的DNA損傷的應答[18]。急性應激時，p53可以下調抗氧化酶的表達，如SOD和GPX，此外，p53還表現(xiàn)出促氧化的活性，可能會加劇細胞應激狀態(tài)下的氧化應激反應[19]。ROS也可以激活p53和啟動p53依賴的應激反應通路，如細胞周期阻滯，衰老和凋亡[20]。因此，p53和ROS正反饋循環(huán)促使應激細胞凋亡或衰老。此外，p53的活化引發(fā)一系列下游轉錄事件導致細胞生長抑制和衰老。這些結果表明，KNDC1過表達促進內皮細胞衰老，可能在細胞衰老的進展中起重要作用。p53被證明是一個誘導KNDC1相關細胞衰老的重要基因。

綜述所述，KNDC1過表達抑制人臍靜脈內皮細胞增殖，促進其衰老。關于作用機制，，KNDC1過表達通過啟動p53信號通路增加ROS表達。p53-ROS正反饋環(huán)在調控KNDC1介導的細胞衰老中發(fā)揮重要作用，通過增加磷酸化p53蛋白的表達，KNDC1促進p53表達并放大p53-ROS反饋環(huán)的作用，進而加速細胞衰老的進程。因此，KNDC1在介導細胞衰老過程中的完整信號通路應該繼續(xù)研究，這將為衰老相關疾病提供新的治療方向。