張明多 閆云峰 莊須翠 張玉慧 王爭明 李德鵬 李麗琴 宋現(xiàn)濤 呂樹錚

趙全明

研究表明，炎癥貫穿動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展的全過程[2]。噻唑烷二酮類(thiazolidinediones, TZDs)藥物可能通過抗炎發(fā)揮降低血栓事件率的作用[3]。TZDs是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)激活劑，不僅可以調(diào)節(jié)血糖濃度，而且它還能抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。核素分子成像是一種功能和代謝成像方式，能夠檢測出病變組織炎癥，目前已用于動脈粥樣硬化領(lǐng)域的研究。氟代脫氧葡萄糖(18F-FDG)PET/ CT在獲得功能代謝顯像數(shù)據(jù)的同時又可獲得形態(tài)學(xué)的資料，使得PET/CT應(yīng)用于斑塊炎性程度及抗炎藥物治療效果評估成為可能。本實驗以改良的康斯坦丁兔為動脈粥樣硬化和易損斑塊動物模型，吡格列酮對模型進行干預(yù)，以PET/CT作為監(jiān)測工具, 探討吡格列酮是否具有降低斑塊破裂率，改善斑塊易損性的作用及可能機制。

材料與方法

1.動物模型 20只雄性新西蘭大耳白兔(北京市海淀區(qū)興旺動物養(yǎng)殖場，許可證號：SCXK(京)2006-0006)，動物體質(zhì)量約(3.0±0.5)kg。抽簽法隨機分為兩組：對照組(n=10)和藥物組(吡格列酮，n=10)。兩組給予高脂飼料喂養(yǎng)2周后, 用改良的Phinikaridou方法[6]行主動脈內(nèi)膜球囊拉傷術(shù)制作動脈粥樣硬化斑塊模型。此后對照組動物給予間斷高脂飼料喂養(yǎng)16周，藥物組動物在高脂飼料的基礎(chǔ)上服用吡格列酮(10 mg·kg-1·d-1)直至實驗結(jié)束。實驗動物的處置嚴格遵守首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會相關(guān)條例規(guī)定。

2.破裂誘發(fā)實驗 兩組動物于球囊拉傷術(shù)后第16周 (蛇毒0.15mg/kg腹膜下注射30min后，經(jīng)兔耳緣靜脈注射組胺0.02 mg/kg) 間隔24h，進行2次藥物誘發(fā)斑塊破裂實驗。

318F-FDG PET/CT顯像及影像融合 共進行二次PET/CT掃描：第一次于喂養(yǎng)第8周球囊拉傷術(shù)后造模完成時(實驗中期掃描)；第二次于第18周藥物誘發(fā)試驗前(實驗晚期掃描)。實驗動物于顯像前夜禁食、水。顯像當(dāng)日根據(jù)體重予以靜脈麻醉(3%的戊巴比妥鈉，劑量為1～1.5mL/kg)。再分別經(jīng)靜脈予以18F-FDG，劑量為1mCi/kg。給藥后180分鐘后將兔仰臥位固定于兔臺上進行普通CT定位平掃，后PET三維圖像采像10min。完成后以歐乃派克10mL(按照1∶1稀釋) 0.4mL/s進行CT血管造影掃描(160mA,120kV)。將PET圖像和CT圖像在PET/CT后處理工作站中利用軟件進行圖像融合，并測量各層面顯影動脈的不同節(jié)段的FDG標(biāo)準化攝取值(standard uptake value，SUV)。具體方法是參照主動脈上左腎動脈起始部，分別向上下方標(biāo)記，每3.75mm為一層面，向上至主動脈弓，向下至髂動脈分叉，根據(jù)主動脈直徑，劃定包含全部主動脈橫斷面的圓形感興趣區(qū)域，由工作站軟件根據(jù)注射18F-FDG劑量，代謝時間和動物體質(zhì)量自動生成所選區(qū)域的平均標(biāo)準化攝取值(SUVmean)和最大標(biāo)準化攝取值(SUVmax)。進行SUV后期統(tǒng)計時，每相鄰兩個層面SUVmean的平均值代表每一動脈段標(biāo)本的SUVmean，每兩個層面SUVmax的較大者代表每一動脈段標(biāo)本的SUV max。

4.離體標(biāo)本病理染色及組織學(xué)測量 PET/CT活體顯像完成后，注射過量的戊巴比妥鈉處死試驗動物。參照主動脈上左腎動脈起始部為標(biāo)志，由上到下方向每7.5mm為一節(jié)段分為若干標(biāo)本，以備病理送檢。進行離體標(biāo)本的大體病理觀察和記錄后，將每一長度為7.5mm的兔主動脈標(biāo)本垂直于動脈橫截面方向分為兩個各為均分為3.75mm的節(jié)段留取標(biāo)本，對所有動脈段進行石蠟包埋切片以及 HE 染色 巨噬細胞 RAM-11 染色以及新生血管 CD-31免疫組化染色。

5.病理學(xué)分析 使用NIS-Elements AR Analysis病理圖像分析系統(tǒng)采集圖像，利用該軟件分別測量每一載玻片上動脈段中內(nèi)斑塊面積及血栓形成情況。其中斑塊面積=內(nèi)彈力膜構(gòu)成的環(huán)形面積-管腔面積。血栓形成情況的計算：以1.5cm將所有實驗動物主動脈進行分段，分別計算藥物組和對照組中血栓形成的動脈段數(shù)量，未形成血栓的動脈段數(shù)量。圖像采用NIS-Elements AR Analysis軟件測量斑塊內(nèi)陽性細胞積分光密度值及內(nèi)膜面積積分值，并計算巨噬細胞密度值(巨噬細胞密度值=陽性細胞積分光密度值/內(nèi)膜面積積分值)。然后計算每只動物巨噬細胞密度的平均值。計算整個血管壁10×10倍視野內(nèi)新生血管數(shù)量，然后計算每只動物新生血管數(shù)量的總和。

6.血脂及炎癥因子檢測 于第8 周、18 周抽取血液樣本，用生化試劑盒檢測血糖、血脂、hs-CRP，用ELISA試劑盒檢測血清MMP-9。

7.統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 16.0軟件包。Levene’s 檢驗驗證方差齊性，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗。計數(shù)資料采用數(shù)量或百分比表示，采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.實驗動物死亡情況 參與實驗的20只動物中，共有13只動物在最終的安樂死前死亡，其中藥物組死亡6只，對照組死亡7只。在實驗的20只動物中，3只動物在球囊拉傷腹主動脈手術(shù)過程中死亡。高脂飼料喂養(yǎng)過程中，5只死于高膽固醇血癥、肝中毒，2只死于嚴重營養(yǎng)不良并發(fā)感染。藥物誘發(fā)過程中，2只死于肺水腫。1只死于急性血栓閉塞。共8只實驗動物(藥物組4只，對照組4只)進行了病理分析，7只實驗動物(藥物組4只，對照組3只)于第二次PET/CT顯像后處死，病理結(jié)果證實，實驗藥物組4只動物有血栓形成；對照組3只動物有血栓形成。

表1 實驗動物生化檢測結(jié)果

注：MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；與基線相比，*P<0.05；與對照組相比，?P<0.05

2.實驗動物血清學(xué)分析結(jié)果 檢測結(jié)果見表1?；€數(shù)據(jù)顯示藥物組及對照組兩組間和組內(nèi)空腹血糖、胰島素、TC、TG、hs-CRP及MMP-9檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。高脂喂養(yǎng)18周后，對比基線水平，藥物組及對照組血清TC均有顯著提高。藥物組及對照組血清MMP-9水平也均有顯著提高。藥物組MMP-9顯著低于對照組MMP-9水平。藥物組高敏CRP也顯著低于對照組hs-CRP水平。治療后兩組間TC水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組間體質(zhì)量、血清胰島素及血糖均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果提示高脂喂養(yǎng)能促進兔動脈粥樣硬化進展，吡格列酮干預(yù)能降低血清MMP-9濃度。

3.18F-FDG PET/CT體外活體顯像及影像融合 中期掃描如圖1所示，藥物組CTA可見動脈管壁光滑，管腔未見充盈缺損，PET圖像未見明顯放射性濃聚，PET/CT融合圖像顯示更加直觀明確(圖1A)。對照組CTA可見動脈管壁略不規(guī)則，管腔可見少量充盈缺損，但水平位CTA上未見明顯充盈缺損；冠狀位及水平位PET圖像及PET/CT融合圖像上可見少量放射性攝取，提示早期動脈粥樣硬化斑塊形成(圖1B箭頭處所示)。晚期掃描如圖3所示，藥物組與中期掃描比較類似，血管均較正常(圖2A)。對照組主動脈管壁走形不規(guī)則，管腔有不同程度的狹窄，造影上可見造影劑有明顯的偏心性充盈缺損，提示有血栓形成；PET圖像中可見局灶性放射性攝取，融合后的PET/CT圖像可直觀明確地顯示主動脈區(qū)有充盈缺損和放射性攝取(圖2B箭頭處所示)。

4.實驗動物18F-FDG攝取的比較和評估 與中期掃描相比，藥物組內(nèi)晚期掃描SUVmean值明顯降低[(0.62±0.21)vs.(0.55±0.19),P=0.008]。與此相反，對照組內(nèi)晚期掃描SUVmean值明顯升高[(0.61±0.15)vs.(0.91±0.20),P<0.000]。另外，兩組間基線掃描SUVmean值差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(0.62±0.21)vs.(0.61±0.15),P=0.523]。SUVmax值的情況和SUVmean值類似。藥物治療組SUV mean呈現(xiàn)下降趨勢，而對照組SUV mean呈現(xiàn)上升趨勢，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(藥物組降低0.07±0.27；對照組升高0.31±0.28),P<0.001](圖3A)。同樣，藥物治療組與對照組SUV max改變得出了相似的結(jié)果(圖3B)。

圖1 實驗動物中期掃描表現(xiàn) A：藥物組；B：對照組

圖2 實驗動物晚期掃描表現(xiàn) A：藥物組；B：對照組

圖3 藥物組及對照組實驗晚期SUV改變值對比 ΔSUV,晚期掃描減去中期掃描SUV值；A:ΔSUVmean，B:ΔSUVmax；* P<0.05

5.動脈粥樣硬化斑塊組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)結(jié)果：實驗兔主動脈產(chǎn)生了AHA分型的各類動脈粥樣硬化斑塊。其中藥物組4只，對照組3只實驗動物有血栓形成。藥物組的75個主動脈段中11個有血栓形成，對照組的51個主動脈段中20個有血栓形成，兩組兔的動脈斑塊血栓形成率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(15 %vs. 39 %,P=0.002)，藥物組明顯低于對照組。與對照組相比，藥物組斑塊面積小[(18.00±2.30)vs.(29.00±9.30),P<0.001]、巨噬細胞密度低[(8.80±3.94)vs.(30.13±4.19),P<0.001]、新生血管計數(shù)少[(16.50±3.09)vs.(31.00±6.11),P<0.05]，均提示吡格列酮能降低斑塊的炎性細胞聚集，降低斑塊新生血管數(shù)量，增加斑塊的穩(wěn)定性(圖4～6)。

圖4 兩組間斑塊面積對比圖A:兔主動脈HE染色顯示藥物組及對照組斑塊面積；B:兩組間對比顯示：* P<0.05，對照組具有較大的斑塊面積。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(×100)

圖5 兩組間巨噬細胞密度對比圖A:兔主動脈RAM-11免疫組化染色顯示藥物組及對照組斑塊巨噬細胞密度：免疫組化染色后，巨噬細胞在內(nèi)皮細胞下大量聚集，位置表淺，被著色為黃棕色或褐色圓形細胞，對照組褐色深染，具有較多巨噬細胞；B:兩組間對比顯示：*P<0.05，對照組具有較大的斑塊巨噬細胞密度。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(×100)

圖6 兩組間新生血管計數(shù)對比圖A:兔主動脈CD31免疫組化染色顯示藥物組及對照組斑塊新生血管；B:兩組間對比顯示：對照組具有較多的斑塊新生血管形成。* P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(×400)

討 論

根據(jù)本次實驗的兔主動脈標(biāo)本進行病理學(xué)分析顯示：本實驗中兔主動脈產(chǎn)生了AHA分類的各型斑塊。本實驗在制造動脈粥樣硬化易損斑塊以及血栓形成模型上結(jié)果比較滿意，為PET/CT監(jiān)測吡格列酮對動脈粥樣硬化易損斑塊的作用及其機制的研究提供了適宜的研究對象。

眾多研究表明，以18FDG為示蹤分子的PET/CT顯像技術(shù)可用于定性和定量的檢測動脈粥樣硬化斑塊炎癥和評估抗動脈硬化藥物對動脈粥樣硬化的治療作用。多項動物實驗顯示動脈18F-FDG局部聚集度和相應(yīng)部位的組織病理學(xué)切片測量的巨噬細胞密度之間有很強的相關(guān)性。Rudd等[7]進行的首次前瞻性臨床研究結(jié)果表明，癥狀性頸動脈粥樣硬化斑塊患者局部18F-FDG攝取較對側(cè)無癥狀頸動脈顯著升高。此外，切除的離體頸動脈斑塊的放射自顯影證實FDG在斑塊巨噬細胞豐富的部位聚集。

在我們的研究中，我們利用PET/CT分別于實驗中期和實驗晚期測定兔主動脈斑塊SUV值以對斑塊局部炎癥狀態(tài)及發(fā)展進行評估以觀察不同實驗階段兩組內(nèi)部兔動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展變化以及同一實驗階段內(nèi)兩組間兔斑塊發(fā)展的差異。我們發(fā)現(xiàn)，中期掃描顯示對照組早期動脈粥樣硬化斑塊形成。晚期掃描顯示對照組提示有血栓形成；PET圖像中可見放射性攝取。組內(nèi)前后匹配對比：與中期掃描相比，藥物組內(nèi)晚期掃描SUV值明顯降低。與此相反，對照組內(nèi)晚期掃描SUV值明顯升高，兩組間基線掃描SUV值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。藥物治療組SUV mean呈現(xiàn)下降趨勢，而對照組SUV mean呈現(xiàn)上升趨勢，統(tǒng)計學(xué)差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。這些發(fā)現(xiàn)進一步明確FDG攝取增加反映了炎癥程度，同時也表明，PET/CT顯像在檢測動脈粥樣硬化斑塊炎癥中的價值，這與先前的研究結(jié)果是一致的[8-10]。

除了定性及定量的評價斑塊炎癥， PET / CT成像還可以評估抗動脈硬化藥物的作用。Tahara等[11]首次發(fā)現(xiàn)，低劑量的辛伐他汀能夠降低斑塊FDG攝取即降低了患者胸主動脈連續(xù)掃描SUV攝取值。在隨后的研究[12]中，其他他汀類藥物(例如阿托伐他汀)也表現(xiàn)出類似的降低FDG攝取的效應(yīng)。Vucic等[21]研究了吡格列酮對新西蘭兔的抗炎作用，研究結(jié)果顯示：FDG攝取在吡格列酮組保持穩(wěn)定，與此相反，對照組FDG攝取顯著提高。在我們的研究中，研究結(jié)果與之前的研究結(jié)果也較為一致[13]。

我們在此研究中發(fā)現(xiàn)：吡格列酮可以顯著降低動脈粥樣硬化兔斑塊破裂的發(fā)生率。斑塊炎癥程度的降低，F(xiàn)DG攝取值的下降，巨噬細胞密度的降低，新生血管計數(shù)的降低和血清炎癥標(biāo)記物的下降等可能是斑塊破裂率下降的部分機制。我們的研究證實了吡格列酮在降低斑塊炎癥中的價值，這與Vucic等[13]研究結(jié)果一致。此外，我們進一步探討了研究了斑塊炎癥程度的降低是否在機制上部分程度介導(dǎo)了吡格列酮治療所引起的斑塊破裂率的降低。Patel等[14]采用依折麥布在兔模型上也得到了類似的結(jié)果，他們通過依折麥布降低斑塊負荷，結(jié)晶化和炎癥水平觀察到了斑塊破裂和血栓形成的降低。

先前的研究表明，吡格列酮治療降低炎癥標(biāo)記物的表達，如血漿中的CRP和動脈壁的MMP-9，導(dǎo)致LDL受體基因敲除小鼠模型動脈粥樣硬化病變體積減小和炎癥水平的降低[15-17]。在人類中，TZDs類藥物也已經(jīng)顯示出對動脈粥樣硬化病變的保護作用和對心血管事件的降低作用[18]。TZDs類藥物減少2型糖尿病患者循環(huán)炎癥介質(zhì)水平，包括CRP，白細胞介素6(IL-6)，CD40L，纖維蛋白原，MMP-9和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)[19]。我們的研究中也已在觀察到類似的結(jié)果，藥物組高敏CRP、MMP-9顯著低于對照組。這表明吡格列酮穩(wěn)定斑塊的作用中降低促炎癥標(biāo)志物是一個重要方面。實驗中發(fā)現(xiàn)兩組之間的血糖水平?jīng)]有顯著差異。因此，吡格列酮對動脈粥樣硬化兔的抗炎作用機制獨立于其降血糖作用，這些結(jié)果與Mizoguchi 等[20]研究一致。

PPARγ也通過諸多免疫調(diào)節(jié)細胞如高度表達的巨噬細胞發(fā)揮抗炎作用。有證據(jù)顯示吡格列酮可通過核因子kappa-B(NF-κB)介導(dǎo)通路降低如炎性細胞滲出等炎性反應(yīng)[20]。在我們的研究中，吡格列酮組RAM-11染色巨噬細胞密度顯著低于對照組。這也與先前的研究相一致。有研究表明，人類主動脈新生血管與主動脈斑塊破裂獨立相關(guān)[21]。實驗性高膽固醇血癥豬模型冠狀動脈新生滋養(yǎng)血管能被他汀類藥物所抑制[22]。在人類患者進行強化血脂治療也可以顯著減少外膜新生血管。先前的研究已經(jīng)證實了吡格列酮對新血管形成的潛在作用。在本研究中我們的結(jié)果同樣顯示藥物組CD31標(biāo)記的新生血管計數(shù)較對照組顯著降低。

綜上所述，吡格列酮可以通過降低斑塊炎性程度以減少斑塊破裂率。PET/CT可有效進行成像監(jiān)測及評價動脈粥樣硬化斑塊的炎癥程度和評估抗動脈硬化藥物的作用。