黃 申，霍夢杰，錢玉梅，魏 濤，賈春曉，何春雨，楊 峰，樊新順，毛多斌*

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450003; 2.河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司，河南 許昌 461000)

西柏烯類化合物是煙草中一類重要的香味前體物質(zhì)，主要存在于煙葉表面腺毛分泌物中[1]，目前已發(fā)現(xiàn)的該類化合物有52種[2]，其中西柏三烯-4,6-二醇(CBT)含量較高，占煙葉表面總類脂物的50%[3]。在煙草陳化和調(diào)制過程中西柏烯類物質(zhì)發(fā)生降解[4-5]，產(chǎn)生的香味化合物數(shù)量超過60種，茄酮、茄呢呋喃、降茄二酮等煙草香味成分都是西柏烯降解產(chǎn)物[6-7]。由此可見，該類化合物的降解轉(zhuǎn)化對煙草香味的產(chǎn)生具有十分重要的作用。充分利用該類化合物的降解產(chǎn)香作用，對于改善再造煙葉品質(zhì)及使用價(jià)值、增加其香氣和安全性具有重要價(jià)值。

再造煙葉是以煙末、煙葉碎片和低次煙葉等為原材料，通過不同的加工工藝制成的再生產(chǎn)品[8-9]，有利于降焦減害，已作為卷煙填充料被應(yīng)用于卷煙產(chǎn)品中[10]。但再造煙葉存在香氣量不足、雜氣重和口感差等吸味缺陷，影響了其在卷煙產(chǎn)品中的使用效果和添加量。國內(nèi)通常的做法是采用添加劑進(jìn)行改善，目前應(yīng)用較多的添加劑是煙草以及天然植物提取物，這些提取物一般通過水、醇提取或分子蒸餾得到，添加后對卷煙質(zhì)量的改善程度有限，且存在一定的安全隱患。因此，如何安全有效地提高再造煙葉的內(nèi)在品質(zhì)已成為煙草行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，通過生物產(chǎn)香的方法提高再造煙葉的香氣量和香氣質(zhì)越來越受到行業(yè)內(nèi)的重視?；诖耍訡BT為唯一碳源，篩選得到1株高效降解CBT產(chǎn)香的菌株，并將其應(yīng)用到再造煙葉濃縮液中，以提高再造煙葉的香氣量和香氣質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 樣品與培養(yǎng)基

1.1.1 煙葉樣品 在國家煙草專賣局河南省三門峽煙葉種植基地采集不同品種的初烤后片煙樣品：7478、AC102、中煙206、AC89、秦?zé)?6、QY201、CC27、貴煙6號、Y077、Y056、金神農(nóng)1號、中煙100、AC55、AC194、7529、Y106、Y074、PVH1452、云煙27、AC71。

1.1.2 試劑及儀器 CBT自制，純度≥98%；主要儀器：Agilent 6890a/5975c GC-MS色譜聯(lián)用儀(Agilent公司)、J6-MI冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)、搖床(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，QYC-211)、生化培養(yǎng)箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DPX-9052B-2)、超聲波細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝生物科技有限公司，JY92-IIDN)、電子天平(賽多利科學(xué)儀器有限公司，BSA323S)、分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，MS205DU)。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基1：KNO31.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、CBT 0.3 g/L。固體發(fā)酵培養(yǎng)基：在發(fā)酵培養(yǎng)基1的基礎(chǔ)上加入2 g/L瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基2：在發(fā)酵培養(yǎng)基1的基礎(chǔ)上加入麥芽糖2 g/L。

1.2 方法

1.2.1 CBT降解菌的篩選[11]稱取不同品種的初烤后片煙葉樣品5 g，剪碎后放入盛有100 mL無菌水的三角瓶中，浸泡過夜，移取1 mL至100 mL LB培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，得到菌源。取1 mL菌源到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基1中，培養(yǎng)4～6 d，根據(jù)GC-MS檢測結(jié)果，挑選CBT降解菌，再從中移取1 mL進(jìn)行梯度稀釋，以不同濃度梯度在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布。將涂布好的平板放于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4 d，挑選出形態(tài)較好、有透明圈產(chǎn)生的單菌落，反復(fù)劃線進(jìn)行分離純化，直到平板上無雜菌落出現(xiàn)。將純化出的單菌落接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基1中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)2～4 d，采用GC-MS分析檢測發(fā)酵液，最終篩選具有降解CBT能力的菌株。

1.2.2 CBT降解產(chǎn)物的分析檢測[12]

1.2.2.1 CBT標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用萬分之一電子分析天平準(zhǔn)確稱取CBT 11.09 mg，用色譜級二氯甲烷溶解，并定容到100 mL容量瓶中，得到一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液 0.1、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL，用色譜級二氯甲烷分別定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即得到含有不同質(zhì)量濃度梯度的CBT標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)所得數(shù)據(jù)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=2.464 17×106x-5.056 8×107(R2=0.999 62)。

1.2.2.2 CBT降解產(chǎn)物的萃取 量取培養(yǎng)完成后的CBT降解菌發(fā)酵液30 mL，10 000 r/min離心20 min，取上清液與等體積的二氯甲烷在分液漏斗中進(jìn)行萃取，緩緩搖晃，使兩相混合均勻，靜置10 min后，收集下層有機(jī)相，重復(fù)以上步驟3次，合并有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥，靜置過夜，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷后，加入1 mL色譜純二氯甲烷溶解，過0.45 μm有機(jī)系濾膜后，用GC-MS分析檢測。

1.2.2.3 檢測條件 色譜條件：HP-5 MS 5% Phenyl Methyl Silox(型號為30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；高純氦氣作載氣，流速為1 mL/min；程序升溫：初始溫度為50 ℃，保持4 min，然后以2 ℃/min的升溫速度升至240 ℃結(jié)束；不分流；進(jìn)樣量為1 μL；GC-MS采用全掃模式。質(zhì)譜條件：傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度為280 ℃，四極桿溫度150 ℃；電離方式為電子轟擊(EI)，電子能量為70 eV；溶劑延遲時(shí)間為8 min；掃描質(zhì)量范圍：35～550 m/z 。

1.2.2.4 CBT降解率的測定與計(jì)算 根據(jù)GC-MS測定結(jié)果計(jì)算CBT的降解率。計(jì)算公式為：

CBT降解率=CBT減少量/原有CBT含量×100%。

1.2.3 CBT降解菌的鑒定[13]

1.2.3.1 CBT降解菌形態(tài)特征鑒定 將所篩選的CBT降解菌接種于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72 h后在油鏡下觀察菌落和菌種形態(tài)，進(jìn)行形態(tài)特征鑒定。

1.2.3.2 16S rRNA序列擴(kuò)增、測序及系統(tǒng)發(fā)育分析 用細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取目標(biāo)菌株基因組DNA，PCR反應(yīng)引物為16S rDNA序列通用引物5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：Taq酶 (5 U/μL) 0.2 μL、上下游引物 (10 μmol/L)各0.5 μL、10×Buffer (10 μmol/L) 2.5 μL、DNA模板(50 ng/μL) 0.5 μL、dNTP(10 μmol/L) 1 μL、dH2O 19.8 μL。DNA序列在生工生物工程(上海)股份有限公司測定。系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用Neighbor-Joining 法進(jìn)行1 000 次步長計(jì)算。

1.2.3.3 CBT降解曲線的測定 將篩選的CBT降解菌單菌落接入LB培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，然后按1%的濃度接種到發(fā)酵培養(yǎng)基1中，分別測定培養(yǎng)6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、80、88 h發(fā)酵液的CBT降解率，并測定不同時(shí)段發(fā)酵液的OD600。

1.2.4 CBT降解菌在再造煙葉中的應(yīng)用

1.2.4.1 菌制劑及酶制劑的制備 將篩選的CBT降解菌單菌落接入LB培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，制得種子液，然后按1%的濃度接種到LB培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液即為菌制劑。菌制劑于10 000 r/min下離心10 min得到菌體，利用PBS(用量為菌體濕質(zhì)量的10～15倍)重懸后超聲破碎(超聲條件：功率60%、超聲時(shí)間30 min、工作2 s停4 s)，離心除去上清液得到細(xì)胞碎片，PBS(用量為LB培養(yǎng)基的10%)重懸后即為酶制劑。

1.2.4.2 菌制劑及酶制劑的應(yīng)用 取30 mL再造煙葉濃縮液加入到100 mL三角瓶中，接種5%的菌制劑，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h；取30 mL再造煙葉濃縮液加入到100 mL三角瓶中，添加5‰的酶制劑在30 ℃、150 r/min條件下轉(zhuǎn)化24 h。分別將菌制劑和酶制劑處理后的再造煙葉濃縮液加入到分液漏斗中，并加入等體積的二氯甲烷進(jìn)行分液萃取，重復(fù)此步驟3次，合并有機(jī)相。加入無水硫酸鈉靜置過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷后，加入1 mL色譜純二氯甲烷溶解，過0.45 μm有機(jī)系濾膜后，采用GC-MS分析檢測發(fā)酵(轉(zhuǎn)化)前后再造煙葉濃縮液中的香味物質(zhì)，檢測條件同1.2.2.3。

1.2.4.3 菌制劑和酶制劑處理對再造煙葉評吸效果的影響 分別將菌制劑發(fā)酵和酶制劑轉(zhuǎn)化的再造煙葉濃縮液涂布到基片后制絲，添加到樣品煙支中，以未經(jīng)發(fā)酵和轉(zhuǎn)化的再造煙葉濃縮液涂布制絲的樣品煙支為對照(CK)，由15人組成的評煙組對其進(jìn)行品鑒。

2 結(jié)果與分析

2.1 CBT降解菌的分離、篩選與鑒定

2.1.1 菌株的分離與篩選 從初烤后煙葉中篩選到1株降解CBT的菌株H3-1，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基1中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用GC-MS法測定其對CBT的降解能力。結(jié)果(圖1)顯示，菌株H3-1具有降解CBT的能力。

①為發(fā)酵前峰圖；②為發(fā)酵后峰圖

2.1.2 菌株H3-1的形態(tài)鑒定 將菌株H3-1接種于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72 h后，在100倍油鏡下觀察其形態(tài)特征，如圖2所示，菌體大小為0.6～0.8 μm×1.5～2.0 μm，呈細(xì)桿狀，無鞭毛，在固體發(fā)酵培養(yǎng)基平板上為黃色圓斑狀。

圖2 菌株H3-1菌落及細(xì)胞形態(tài)

2.1.3 菌株H3-1的16S rDNA 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 利用細(xì)菌16S rDNA特征性引物對菌株H3-1基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1 497 bp目的序列。通過在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast同源性分析，發(fā)現(xiàn)菌株H3-1與新鞘氨醇桿菌(Novosphingobiumsp)的同源性在99%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果(圖3)表明，菌株H3-1與新鞘氨醇桿菌聚為一類。基于形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定菌株H3-1為新鞘氨醇桿菌。

圖3 菌株H3-1基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.1.4 CBT降解曲線 從圖4可以看出，培養(yǎng)20 h后，新鞘氨醇桿菌H3-1快速增長，進(jìn)入對數(shù)期；隨著培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長，該菌從培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)物質(zhì)不斷進(jìn)行繁殖，菌株數(shù)量不斷增加，至培養(yǎng)50 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期；CBT的降解曲線與菌株的生長曲線大致呈負(fù)相關(guān)，在菌體快速生長期，CBT的降解最快。整體看，發(fā)酵0～30 h內(nèi)CBT含量急劇下降，發(fā)酵30 h時(shí)CBT的降解率達(dá)到 85.85%，30 h后趨于平衡。

圖4 菌株H3-1的生長曲線與CBT的降解曲線

2.2 不同碳源對新鞘氨醇桿菌H3-1降解CBT產(chǎn)物的影響

采用GC-MS法檢測新鞘氨醇桿菌H3-1對CBT的降解產(chǎn)物并結(jié)合化合物保留指數(shù)法(RI)分析揮發(fā)性香氣物質(zhì)及降解產(chǎn)物含量。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基僅以CBT為唯一碳源時(shí)，CBT的降解產(chǎn)物為金合歡醛；在發(fā)酵培養(yǎng)基中再加入2 g/L麥芽糖時(shí)，在發(fā)酵液中檢測到茄酮。不同碳源造成新鞘氨醇桿菌H3-1對CBT的降解產(chǎn)物不同，推測可能是碳源發(fā)生了變化，導(dǎo)致菌體某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生了變化。

2.3 新鞘氨醇桿菌H3-1在再造煙葉中的應(yīng)用

2.3.1 添加菌制劑的再造煙葉濃縮液中揮發(fā)性物質(zhì)的變化 采用GC-MS法對菌制劑發(fā)酵前后的再造煙葉濃縮液進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)檢測，發(fā)現(xiàn)約有20種成分的含量在發(fā)酵后得到明顯提升，其中有13種成分的結(jié)構(gòu)可以確定，分別為苯甲醇、2-乙?；量?、甲基麥芽酚、苯乙醇、2-乙基-3-甲基馬來酰亞胺、甲基環(huán)戊酮、茄酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、4-羥基-β-二氫大馬酮、9-羥基-4,7-巨豆三烯酮、4-(3-羥基丁基)-3,5,5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮、葉綠醇以及棕櫚酸，上述成分較發(fā)酵前都有不同程度的提高(表1)，其中，含量超過5%的分別是9-羥基-4,7-巨豆三烯酮、葉綠醇和棕櫚酸，較發(fā)酵前分別提高2.44倍、3.07倍和1.50倍；甲基麥芽酚、苯乙醇、2-乙基-3-甲基馬來酰亞胺、甲基環(huán)戊酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯在發(fā)酵前未檢測到，但發(fā)酵后出現(xiàn)；值得注意的是，茄酮含量比發(fā)酵前提高了52.2%。

表1 H3-1菌制劑發(fā)酵前后再造煙葉濃縮液中揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化

注：—代表未檢出。

2.3.2 添加酶制劑的再造煙葉濃縮液中揮發(fā)性物質(zhì)的變化 采用GC-MS法對酶制劑轉(zhuǎn)化前后的再造煙葉濃縮液進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)檢測，發(fā)現(xiàn)約有10種成分的含量在轉(zhuǎn)化后得到明顯提升，其中有4種成分的結(jié)構(gòu)可以確定(表2)，分別為苯甲醇、2-乙?；量⒈揭掖?、2,3-二氫苯并呋喃，上述4種香味物質(zhì)較轉(zhuǎn)化前有明顯提高，其中，苯甲醇、2,3-二氫苯并呋喃含量分別提高3.61、1.10倍。

2.3.3 菌制劑和酶制劑處理對再造煙葉評吸效果的影響 從表3可以看出，菌制劑發(fā)酵的再造煙葉樣品和酶制劑轉(zhuǎn)化處理的再造煙葉樣品評分較CK都有所提高，分別較CK提高了0.8、0.6分。

表2 H3-1酶制劑轉(zhuǎn)化前后再造煙葉濃縮液中揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化

相比CK，菌制劑發(fā)酵后的樣品有13種香氣成分得到不同程度的提高，突顯在評吸質(zhì)量中是香氣質(zhì)、香氣量、濃度和雜氣項(xiàng)得分都有不同程度的提高，其中以濃度提高最為明顯，為0.3分；與CK相比，酶制劑處理后的樣品在香氣質(zhì)、香氣量和雜氣項(xiàng)的得分都有提高，但與菌制劑處理后樣品相比，酶制劑轉(zhuǎn)化后的樣品濃度得分沒有得到提高，但雜氣得分提高了0.1分，推測原因可能是酶制劑在制備過程中去除了細(xì)胞質(zhì)組分(細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)成分含量較高)，提高了雜氣項(xiàng)得分。

表3 H3-1菌制劑和酶制劑對再造煙葉評吸效果的影響

3 結(jié)論與討論

CBT是煙草中重要的致香前體物，其氧化降解可產(chǎn)生茄酮、降茄二酮、茄尼呋喃等多種重要中性香味成分，上述成分可與煙香協(xié)調(diào)，醇和煙氣，增加煙草本香。但CBT的生物降解機(jī)制尚不明確，已有研究表明，新鞘氨醇桿菌YII-3可將CBT轉(zhuǎn)化為金合歡醛，經(jīng)過優(yōu)化，該菌發(fā)酵48 h對CBT的降解率為84.71%[14-15]。相比新鞘氨醇桿菌YII-3，本試驗(yàn)篩選出新鞘氨醇桿菌H3-1在發(fā)酵培養(yǎng)基1中發(fā)酵30 h時(shí)CBT降解率可達(dá)85.85%，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加麥芽糖時(shí)，發(fā)酵液中檢出茄酮。

由于原料來源多為煙末、煙葉碎片和低次煙葉，制得的再造煙葉雖然有利于降焦減害，但香氣量不足、雜氣重的缺陷卻阻礙了再造煙葉在行業(yè)內(nèi)的應(yīng)用[8-9]。為抑制再造煙葉中的雜氣、增加香氣量、改善香氣質(zhì)，以往的研究多采用加入人工香料、煙葉提取物、天然植物提取液以及天然植物提取物的發(fā)酵液等方法[16-19]，但效果不顯著，而且再造煙葉中外源香料的添加為后期卷煙產(chǎn)品的維護(hù)也帶來不便。

本試驗(yàn)將新鞘氨醇桿菌H3-1菌制劑添加到再造煙葉濃縮液中發(fā)酵后，濃縮液中苯甲醇、2-乙?；量?、甲基麥芽酚、苯乙醇、2-乙基-3-甲基馬來酰亞胺、甲基環(huán)戊酮、茄酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、4-羥基-β-二氫大馬酮、9-羥基-4,7-巨豆三烯酮、4-(3-羥基丁基)-3,5,5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮、葉綠醇以及棕櫚酸的含量提高；與以往研究相比，增加的香味物質(zhì)為煙草本香，不會對后期卷煙配方的維護(hù)帶來困難，而且煙草本香的增加可使再造煙葉應(yīng)用到高檔卷煙中。同時(shí)，評吸結(jié)果顯示，香氣質(zhì)、香氣量以及濃度都有不同程度的提升。

將新鞘氨醇桿菌H3-1酶制劑添加到再造煙葉濃縮液中轉(zhuǎn)化后，濃縮液中苯甲醇、2-乙?；量⒈揭掖家约?,3-二氫苯并呋喃的含量提高。評吸結(jié)果顯示，香氣質(zhì)和香氣量都提高了0.2分。由于酶制劑在制作過程中只保存了結(jié)合在細(xì)胞壁上的酶，細(xì)胞質(zhì)中大量的酶被丟棄，表現(xiàn)為評吸過程中濃度提升效果不及菌制劑處理樣品；與此同時(shí)，雜氣項(xiàng)得分較菌制劑處理樣品增加了0.1分，分析原因，可能是菌制劑處理樣品引入了較多的蛋白質(zhì)而引起的雜氣項(xiàng)得分較酶制劑處理樣品降低。