劉 勇，劉 燕，王星星，趙許朋，楊 丹，胡茂飛

(1.貴陽(yáng)學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550005； 2.中國(guó)科學(xué)院 地球化學(xué)研究所 環(huán)境地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550002； 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

頭花蓼(PolygonumcapitatumBuch.-Ham.ex D.Don)又名石莽草、四季紅等，為蓼科蓼屬多年生草本植物，主要分布于貴州、四川、云南等地，是中國(guó)西南地區(qū)的特色苗藥之一，其主要藥用成分沒(méi)食子酸具有酸化尿液等作用，對(duì)泌尿系統(tǒng)疾病頗具療效[1-3]。頭花蓼為貴州省著名的道地藥材，近年來(lái)貴州威門(mén)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的熱淋清顆粒是以此藥材開(kāi)發(fā)的用于治療尿路感染的特效藥[4-5]。然而，在頭花蓼栽培過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其連作障礙問(wèn)題一直比較突出，對(duì)其種植產(chǎn)量和藥用成分品質(zhì)影響較大，成為制約當(dāng)?shù)卦摦a(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素[6-8]。

化感自毒作用指植物根系分泌、莖葉等淋溶以及殘?bào)w腐解等過(guò)程釋放出的次生代謝產(chǎn)物(化感物質(zhì))，對(duì)自身或種內(nèi)其他植物產(chǎn)生危害的現(xiàn)象[9-10]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，地黃、當(dāng)歸、人參等許多中藥材連作障礙與化感自毒作用有關(guān)[11-14]。中藥材的化感物質(zhì)除了根系分泌、莖葉等淋溶產(chǎn)生外，也通過(guò)自然凋落的殘?bào)w或收獲后遺留的殘茬經(jīng)微生物腐解產(chǎn)生[15-16]。目前頭花蓼連作障礙成因還不清楚，其腐解液引起的化感自毒作用尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，制備頭花蓼整株好氧、厭氧腐解液，采用生物學(xué)試驗(yàn)分析2種腐解液對(duì)其種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，為頭花蓼連作障礙的成因分析及防治措施制定提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2016年4月于貴州省威門(mén)藥業(yè)股份有限公司頭花蓼種植基地分別采集生長(zhǎng)旺盛的新鮮頭花蓼整株、根際土壤及頭花蓼種子若干。

1.2 頭花蓼整株腐解液制備

將新鮮頭花蓼整株(含根、莖、葉)用無(wú)菌蒸餾水清洗干凈，瀝干水分，剪碎混勻，準(zhǔn)確稱(chēng)量100.0 g置于燒杯中，并加入根際土壤10.0 g(土壤樣品在室溫條件下風(fēng)干，研細(xì)后，過(guò)孔徑為450 μm的篩子，用于提供微生物)，定期加入蒸餾水維持至110 mL體積，室溫下敞口好氧培養(yǎng)。采用同樣的方法對(duì)頭花蓼和根際土壤進(jìn)行前處理并置于玻璃瓶中，加入110 mL蒸餾水后排出瓶?jī)?nèi)空氣，室溫下封口厭氧培養(yǎng)。60 d后抽濾得到頭花蓼好氧、厭氧腐解原液(1 000 mg/mL)，并進(jìn)一步稀釋得到5、10、50、100、250、500 mg/mL的2種腐解培養(yǎng)液，冷藏備用。

1.3 種子萌發(fā)試驗(yàn)

取3 000粒頭花蓼種子置于燒杯中，35 ℃溫水浸泡24 h，挑選籽粒飽滿(mǎn)的種子，置于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿、濾紙均滅菌)。每個(gè)培養(yǎng)皿擺放40粒，加入不同質(zhì)量濃度的2種腐解液5 mL至濾紙濕潤(rùn)飽和，3次重復(fù)，用蒸餾水作對(duì)照(CK)。置于人工培養(yǎng)箱(22 ℃、12 h光照和12 h黑暗)中培養(yǎng)，每2 d加蒸餾水和1 d加對(duì)應(yīng)腐解液確保皿內(nèi)濾紙濕潤(rùn)飽和，連續(xù)培養(yǎng)27 d，每天觀察、統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù)，直到持續(xù)3 d不再有新種子發(fā)芽為止，用直尺測(cè)量種子胚根(芽)長(zhǎng)。

1.4 幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)

種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束后，每皿選取發(fā)芽良好的種子，去掉皿蓋繼續(xù)培養(yǎng)10 d使幼苗生長(zhǎng)，用直尺測(cè)量幼苗根(芽)長(zhǎng)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%[17]。

發(fā)芽抑制率=(1-發(fā)芽種子數(shù)/對(duì)照組發(fā)芽種子數(shù))×100%，負(fù)值為促進(jìn)，正值為抑制[18]。

發(fā)芽速率=N1+(N2-N1)/2+…+(Nt-Nt-1)/t，其中，Nt為t日內(nèi)種子發(fā)芽率[19]。

發(fā)芽勢(shì)=(發(fā)芽高峰期種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%，表征種子發(fā)芽快慢與活力強(qiáng)弱[18]。

發(fā)芽指數(shù)GI=∑(Gt/Dt)，Gt為第t天種子發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)種子發(fā)芽天數(shù)[20]。

活力指數(shù)VI=∑(Gt/Dt)×Sx，其中，Sx為種苗平均總長(zhǎng)度[21]。

化感指數(shù)RI=1-C/T，其中，C為對(duì)照組各指標(biāo)平均值，T為腐解液培養(yǎng)時(shí)各指標(biāo)平均值。RI>0為促進(jìn)，RI<0為抑制[22]。

綜合化感指數(shù)M：各處理的化感指數(shù)RI值相加求和為M值，M>0 為促進(jìn)，M<0為抑制，絕對(duì)值大小表征作用強(qiáng)弱[23]。

采用Excel 2010、SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)，采用Sigmaplot 10.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽表觀特征

由表1可知，頭花蓼好氧、厭氧2種腐解液對(duì)其種子最終發(fā)芽數(shù)、日均發(fā)芽數(shù)、胚根長(zhǎng)等均有一定抑制作用，出現(xiàn)種子胚根(芽)傾倒、腐爛癥狀。隨著好氧腐解液質(zhì)量濃度升高(5～500 mg/mL)，種子最終發(fā)芽數(shù)由18粒降至7粒，日均發(fā)芽數(shù)由1.1粒降至0.5粒，胚根長(zhǎng)由1.4 cm降至0.6 cm，(胚)根芽比由1.2降至0.4，胚芽長(zhǎng)與對(duì)照組差異不顯著。隨著厭氧腐解液質(zhì)量濃度升高(5～500 mg/mL)，種子最終發(fā)芽數(shù)由22粒降至8粒，日均發(fā)芽數(shù)由1.4粒降至0.5粒，胚根長(zhǎng)由1.6 cm降至0.5 cm，胚芽長(zhǎng)由2.4 cm降至0.7 cm，(胚)根芽比與對(duì)照組差異不顯著。

表1 2種腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽表觀特征

注：同一種腐解液處理下不同字母代表差異性顯著(P<0.05)，下同。

2.2 腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽率、發(fā)芽速率

隨著頭花蓼好氧、厭氧腐解液質(zhì)量濃度升高(5～500 mg/mL)，種子發(fā)芽率分別由45.0%降至18.3%、55.8%降至20.8%，其中好氧、厭氧腐解液質(zhì)量濃度分別≤10 mg/mL、≤50 mg/mL時(shí)，種子發(fā)芽率與對(duì)照組差異不顯著，質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高時(shí)種子發(fā)芽率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，2種腐解液質(zhì)量濃度相同時(shí)好氧腐解液處理下種子發(fā)芽率均值總體偏低(圖1a)。好氧、厭氧腐解液質(zhì)量濃度均≤50 mg/mL時(shí)，種子發(fā)芽速率與對(duì)照組差異不顯著，但高質(zhì)量濃度時(shí)種子發(fā)芽速率分別降至對(duì)照組的1/3、1/4。2種腐解液質(zhì)量濃度均≤100 mg/mL時(shí)，厭氧腐解液處理下發(fā)芽速率普遍略高于好氧腐解液處理，而質(zhì)量濃度>100 mg/mL時(shí)相反(圖1b)。

不同小寫(xiě)字母代表不同腐解液處理之間差異顯著(P<0.05),下同圖1 2種腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽率和發(fā)芽速率

2.3 腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽抑制率

好氧腐解液質(zhì)量濃度≤250 mg/mL時(shí)，種子發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照組差異不顯著，但質(zhì)量濃度為500 mg/mL時(shí)發(fā)芽勢(shì)降至12.5%；厭氧腐解液質(zhì)量濃度≤50 mg/mL時(shí)，種子發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照組差異不顯著，隨著質(zhì)量濃度升高，種子發(fā)芽勢(shì)降至4.2%(圖2a)。2種腐解液處理下種子發(fā)芽抑制率均為正值，且隨著質(zhì)量濃度升高種子發(fā)芽抑制率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，其中好氧腐解液處理下由17.8%增至67.2%，厭氧腐解液處理下由0增至62.4%(圖2b)。

圖2 2種腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽抑制率

2.4 腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)

好氧、厭氧腐解液質(zhì)量濃度均≤50 mg/mL時(shí)，種子發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照組差異不顯著，分別介于11.2～12.3、12.8～14.9，隨著質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高，種子發(fā)芽指數(shù)分別逐漸下降至4.1、2.5(圖3a)。好氧腐解液處理下除在100、500 mg/mL時(shí)種子活力指數(shù)較小(分別僅為19.2、9.1)，其余質(zhì)量濃度下與對(duì)照組差異不顯著，介于32.3～47.0。厭氧腐解液質(zhì)量濃度≤10 mg/mL時(shí)，種子活力指數(shù)與對(duì)照組差異不顯著，介于49.3～55.3，隨著質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高種子活力指數(shù)下降趨勢(shì)明顯，最低僅為3.1(圖3b)。

圖3 2種腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)

2.5 腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)RI和綜合化感指數(shù)M

由表2可知，好氧腐解液處理下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的RI值以及綜合化感指數(shù)M值均為負(fù)值，隨著質(zhì)量濃度升高RI和M的絕對(duì)值呈增加趨勢(shì)。厭氧腐解液處理下，質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)種子發(fā)芽率RI值為0，質(zhì)量濃度≤10 mg/mL時(shí)種子發(fā)芽勢(shì)RI值為正值，質(zhì)量濃度≤50 mg/mL時(shí)發(fā)芽指數(shù)RI值為正值，質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高時(shí)，各指標(biāo)RI值以及綜合化感指數(shù)M值均為負(fù)值且其絕對(duì)值不斷增加。

表2 2種腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽化感指數(shù)

2.6 腐解液處理下頭花蓼幼苗生長(zhǎng)表觀特征

頭花蓼2種腐解液對(duì)幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的影響，且高質(zhì)量濃度時(shí)幼苗根(芽)傾倒、腐爛加劇(表3)。好氧腐解液質(zhì)量濃度≤10 mg/mL時(shí)，幼苗根長(zhǎng)與對(duì)照組差異不顯著，隨著質(zhì)量濃度升高幼苗根長(zhǎng)降至1.0 cm；質(zhì)量濃度≤250 mg/mL時(shí)幼苗芽長(zhǎng)與對(duì)照組差異不顯著，但質(zhì)量濃度為500 mg/mL時(shí)幼苗芽長(zhǎng)降至1.6 cm；幼苗根芽比無(wú)明顯變化規(guī)律，介于0.4～0.7。厭氧腐解液處理下幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)總體略小于對(duì)照組，且具有先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)分別達(dá)最大值1.7 cm、2.9 cm，當(dāng)質(zhì)量濃度為500 mg/mL時(shí)分別僅為0.4 cm、1.8 cm；質(zhì)量濃度≤250 mg/mL時(shí)幼苗根芽比與對(duì)照組無(wú)顯著差異，當(dāng)質(zhì)量濃度為500 mg/mL時(shí)幼苗根芽比驟降至0.2。

表3 2種腐解液處理下頭花蓼幼苗生長(zhǎng)表觀特征

2.7 腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)各指標(biāo)相關(guān)性分析

頭花蓼好氧、厭氧腐解液處理下種子發(fā)芽率、發(fā)芽速率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等均與腐解液質(zhì)量濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，發(fā)芽抑制率與腐解液質(zhì)量濃度呈極顯著正相關(guān)；種子發(fā)芽率、發(fā)芽速率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)等指標(biāo)之間均呈極顯著正相關(guān)，而各指標(biāo)與發(fā)芽抑制率均呈極顯著負(fù)相關(guān)(表4、表5)。好氧腐解液處理下種子胚根長(zhǎng)、幼苗根長(zhǎng)與腐解液質(zhì)量濃度，種子(胚)根芽比與幼苗根長(zhǎng)，幼苗芽長(zhǎng)與根芽比，均呈極顯著負(fù)相關(guān)；種子胚根長(zhǎng)與幼苗根長(zhǎng)，種子(胚)根芽比與幼苗根芽比，均呈極顯著正相關(guān)；種子(胚)根芽比與腐解液質(zhì)量濃度呈顯著負(fù)相關(guān)；幼苗根長(zhǎng)與根芽比呈顯著正相關(guān)(表6)。厭氧腐解液處理下種子胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)及幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根芽比均與腐解液質(zhì)量濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，種子胚根長(zhǎng)與胚芽長(zhǎng)及幼苗根長(zhǎng)、根芽比，種子胚芽長(zhǎng)與幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)，幼苗根長(zhǎng)與芽長(zhǎng)、根芽比均呈極顯著正相關(guān)；種子胚根長(zhǎng)與幼苗芽長(zhǎng)，種子胚芽長(zhǎng)與幼苗根芽比呈顯著正相關(guān)，而種子胚芽長(zhǎng)與(胚)根芽比呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表7)。

表4 好氧腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽指標(biāo)相關(guān)性

注：**代表在0.01水平上極顯著相關(guān)，*代表在0.05水平上顯著相關(guān)，下表同。

表5 厭氧腐解液處理下頭花蓼種子發(fā)芽指標(biāo)相關(guān)性

表6 好氧腐解液處理下頭花蓼種子及幼苗(胚)根芽相關(guān)性

表7 厭氧腐解液處理下頭花蓼種子及幼苗(胚)根芽相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

中藥材連作障礙與其化感物質(zhì)的關(guān)系一直是目前的研究熱點(diǎn)?；形镔|(zhì)除根系分泌和莖、葉淋溶等作用產(chǎn)生外，自然凋落的殘?bào)w或收獲后遺留的殘茬經(jīng)土壤微生物分解產(chǎn)生的腐解液也是化感物質(zhì)的重要來(lái)源[9-10，24]。中藥材腐解液中的化學(xué)成分包含酚酸類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、醛類(lèi)、烴類(lèi)等物質(zhì)，并且隨著殘?bào)w時(shí)段及腐解方式等不同，其化學(xué)成分種類(lèi)與數(shù)量往往差異較大，會(huì)改變土壤pH值、電導(dǎo)率、有機(jī)質(zhì)、養(yǎng)分狀況、酶類(lèi)活性、微生物群落結(jié)構(gòu)等，進(jìn)而影響種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育等[25-29]。劉偉等[30]研究表明，丹參須根腐解產(chǎn)生辛酸、乙醛等一系列化感物質(zhì)，顯著改變丹參根際土壤環(huán)境，促使其連作障礙的形成。吳艷艷等[31]研究表明，廣藿香重茬土和枯葉腐解液使廣藿香幼苗葉片過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量發(fā)生明顯變化，這種變化反映了其對(duì)外界脅迫的響應(yīng)。張秋菊等[32]研究表明，細(xì)辛根系腐解液可能受土壤微生物影響，加重其毒性作用。

本研究中，頭花蓼整株通過(guò)好氧、厭氧2種方式產(chǎn)生的腐解液引起頭花蓼種子和幼苗(胚)根芽?jī)A倒、腐爛等現(xiàn)象，2種腐解液質(zhì)量濃度較低時(shí)未產(chǎn)生明顯的抑制作用，但種子和幼苗(胚)根長(zhǎng)、(胚)芽長(zhǎng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，表明2種腐解液使得種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)齊整度明顯變差。隨著腐解液質(zhì)量濃度升高至500 mg/mL，好氧、厭氧腐解液處理種子發(fā)芽率分別僅為18.3%、20.8%，發(fā)芽速率分別僅為對(duì)照組的1/3、1/4，發(fā)芽勢(shì)分別僅為12.5%、4.2%，發(fā)芽指數(shù)分別僅為4.1、2.5，活力指數(shù)分別僅為9.1、3.1，均遠(yuǎn)低于對(duì)照組，而發(fā)芽抑制率均為正值且分別高達(dá)67.2%、62.4%，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)的RI值及綜合化感指數(shù)M值大多為負(fù)值，且絕對(duì)值隨著腐解液質(zhì)量濃度升高增加趨勢(shì)明顯。另外，頭花蓼種子發(fā)芽或幼苗生長(zhǎng)中大多數(shù)指標(biāo)均與2種腐解液質(zhì)量濃度呈(極)顯著負(fù)相關(guān)，種子發(fā)芽抑制率與2種腐解液質(zhì)量濃度呈極顯著正相關(guān)，而其他大多數(shù)指標(biāo)之間呈(極)顯著正相關(guān)，說(shuō)明頭花蓼受到腐解液抑制作用后種子活力下降，進(jìn)而發(fā)芽率、發(fā)芽速率、(胚)根芽長(zhǎng)等顯著下降。

綜上，頭花蓼好氧、厭氧腐解液均具有明顯的化感自毒作用，很可能是引起其連作障礙的重要原因。2種腐解液中化感物質(zhì)鑒定及其關(guān)鍵物質(zhì)的致“毒”機(jī)制等尚有待進(jìn)一步研究。在頭花蓼栽培中，建議加強(qiáng)良好農(nóng)業(yè)規(guī)范(GAP)種植基地的科學(xué)規(guī)范化管理并積極做好連作障礙的預(yù)防，即頭花蓼收獲后及時(shí)清理土壤中的植株殘茬，連作前可通過(guò)深耕翻土與烈日暴曬達(dá)到土壤消毒目的，篩選培育抗逆性強(qiáng)的新型品種，采用多物種輪(間、套)作等農(nóng)藝手段避免連作障礙的發(fā)生。

致謝：感謝貴州威門(mén)藥業(yè)股份有限公司為本研究開(kāi)展提供便利。