袁素素，秦武灑，張瑋瑋，王財(cái)成，葉秀娟

(福建農(nóng)林大學(xué),福建 福州 350002)

傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用，對(duì)地球環(huán)境和人體健康都造成了極大的危害，從天然產(chǎn)物中尋找新的抗菌藥物成為解決這一難題的途徑之一，近年來(lái)抗菌蛋白在農(nóng)業(yè)上的潛在應(yīng)用價(jià)值越來(lái)越被人們關(guān)注[1]?？咕鞍资巧矬w在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中為了抵御病菌的侵害而產(chǎn)生的，目前，在很多植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)抗菌蛋白的存在[2-3]。Chan等[4]從褐色蕓豆中分離出一種分子質(zhì)量約為5.4 ku的抗菌蛋白，能夠有效抑制落花生球腔菌的生長(zhǎng)；Ye等[5]從紅色甘藍(lán)中純化出一種分子質(zhì)量約為30 ku的蛋白質(zhì)，也對(duì)落花生球腔菌有抑制活性；Wang等[6]從地衣芽孢桿菌中分離出一種抗菌蛋白，其分子質(zhì)量約為55 ku，能夠抑制黃瓜霜霉病菌的生長(zhǎng)，在葉片噴灑這種抗菌蛋白，能夠有效抑制致病菌的侵染。抗真菌蛋白按其結(jié)構(gòu)或功能可分為以下幾類(lèi)：幾丁質(zhì)酶、類(lèi)幾丁質(zhì)酶蛋白、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、類(lèi)親環(huán)素蛋白、脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、防衛(wèi)素、類(lèi)防衛(wèi)素、葡聚糖酶、凝集素、脂轉(zhuǎn)移蛋白、過(guò)氧化物酶、蛋白酶抑制劑、核糖體失活蛋白等[7]。

紫菜薹(BrassicacampestrisL.var.purpureaBaileysh)是十字花科蕓薹屬植物，別名紅菜薹、紅油菜薹等。紫菜薹在蔬菜生產(chǎn)和消費(fèi)中占有重要地位，在長(zhǎng)江中下游流域和華南地區(qū)種植較多，是湖北省冬春季的主要特產(chǎn)蔬菜。紫菜薹莖和葉的色素中富含花色苷類(lèi)物質(zhì)，具有抗氧化、抗突變、抗癌、抗炎癥及抗病毒等多種生物活性[8-10]，目前關(guān)于紫菜薹的研究主要集中在栽培、分子遺傳以及生態(tài)學(xué)方面[11-13]，而對(duì)其種子中抗菌蛋白的研究報(bào)道較少。為此，以紫菜薹種子為研究對(duì)象，純化抗菌蛋白并對(duì)其抑菌活性和穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究，旨在純化出抗菌效果較好的抗菌蛋白，進(jìn)而開(kāi)發(fā)為替代化學(xué)農(nóng)藥的一種抗菌藥物，為解決傳統(tǒng)農(nóng)藥在長(zhǎng)期使用中產(chǎn)生的問(wèn)題提供一種方法。

1 材料和方法

1.1 供試材料

茄病鐮刀菌(Fusariumsolanif)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、煙草炭疽病菌(Colletotrichummicotianae)、芭樂(lè)炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、落花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)、蘋(píng)果黑腐皮殼菌(Valsamali)、凸臍蠕孢菌(Exserohilummonoceras)和灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)共9種供試植物病原真菌，均由福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與生物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

紫菜薹種子購(gòu)買(mǎi)于湖北省武漢市九頭鳥(niǎo)種業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 紫菜薹種子抗菌蛋白的純化

稱(chēng)取250 g干凈的紫菜薹種子，用1 L 10 mmol/L NH4OAc緩沖溶液(pH值4.5)浸泡，置于4 ℃冰箱24 h，用豆?jié){機(jī)磨成勻漿，8 000 r/min離心20 min，取上清液依次按以下步驟純化紫菜薹種子抗菌蛋白。

用10 mmol/L NH4OAc緩沖溶液(pH值4.5)平衡SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析柱(5 cm×20 cm)，將上述上清液進(jìn)行上樣，上樣結(jié)束后，繼續(xù)用10 mmol/L NH4OAc緩沖溶液(pH值4.5)對(duì)未吸附的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗滌，至280 nm吸光度值(OD280 nm)為0。然后分別用含有0.2、0.5、1.0 mol/L NaCl的10 mmol/L NH4OAc緩沖溶液(pH值4.5)洗脫，在280 nm下檢測(cè)吸光度，同時(shí)依次進(jìn)行吸收峰收集。以芭樂(lè)炭疽病菌為指示菌，運(yùn)用紙片擴(kuò)散法對(duì)各個(gè)洗脫組分進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，將具有活性的組分用蒸餾水透析，冷凍干燥得活性蛋白干粉。

用10 mmol/L NH4OAc緩沖液(pH值4.5)平衡Mono STM5/50GL強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析柱，流速為1 mL/min，將上一步的活性蛋白干粉溶解在相同的緩沖液中(質(zhì)量濃度不超過(guò)50 mg/mL)，上樣量為1 mL，上樣結(jié)束后，繼續(xù)用10 mmol/L NH4OAc緩沖液(pH值4.5)對(duì)未吸附的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗滌，至OD280 nm為0。然后采用0～1 mol/L的鹽梯度對(duì)吸附蛋白進(jìn)行洗脫，同時(shí)進(jìn)行吸收峰收集，以芭樂(lè)炭疽病菌為指示菌，運(yùn)用紙片擴(kuò)散法對(duì)各個(gè)峰收集組分進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，將具有活性的組分用蒸餾水透析，冷凍干燥得到活性蛋白干粉。

用20 mmol/L NH4HCO3緩沖液(pH值9.2)平衡SuperdexTM75 10/300GL層析柱，流速為0.5 mL/min，將上一步的活性蛋白干粉溶解在相同的緩沖液中(質(zhì)量濃度不超過(guò)5 mg/mL)，上樣量為100 μL，上樣結(jié)束后，繼續(xù)用20 mmol/L NH4HCO3緩沖液(pH值9.2)洗脫，同時(shí)對(duì)吸收峰進(jìn)行收集。以芭樂(lè)炭疽病菌為指示菌，運(yùn)用紙片擴(kuò)散法對(duì)各個(gè)峰收集組分進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，將具有活性的組分用蒸餾水透析，冷凍干燥得到活性蛋白干粉樣品，即為紫菜薹種子抗菌蛋白樣品。

1.3 抗菌蛋白的抑菌活性檢測(cè)

運(yùn)用紙片擴(kuò)散法[3]，將植物病原真菌預(yù)先接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)至菌落直徑為3 cm時(shí)，將已經(jīng)滅菌的濾紙片(直徑6 mm)放置在距離菌落邊緣0.5 cm處，用移液槍在濾紙片上加待測(cè)樣品溶液15 μL，繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)半月形，觀察并記錄抑菌結(jié)果。

1.4 抗菌蛋白的SDS-PAGE分析

運(yùn)用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析，依次配制15%分離膠、4%濃縮膠，按預(yù)定的次序加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(Marker)和紫菜薹種子抗菌蛋白樣品，開(kāi)始用30 V恒壓電泳，待蛋白質(zhì)條帶進(jìn)入分離膠時(shí)，增加電壓至80 V，待蛋白質(zhì)條帶距離分離膠底部1 cm時(shí)關(guān)閉電源。取出電泳凝膠，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，2～3 h后用含10%冰乙酸(V/V)和10%甲醇(V/V)的脫色液進(jìn)行脫色。

1.5 抗菌蛋白的穩(wěn)定性檢測(cè)

1.5.1 pH值穩(wěn)定性 分別配制pH值為1、2、3、11、12、13的PBS緩沖液，同時(shí)用PBS緩沖液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白樣品溶液。取6個(gè)離心管，在每個(gè)離心管中加入50 μL抗菌蛋白樣品溶液，冷凍干燥后，分別向離心管中加入上述不同pH值的PBS緩沖液50 μL，靜置30 min。以PBS緩沖液(pH值7.4)為陰性對(duì)照，以未處理的抗菌蛋白樣品溶液為陽(yáng)性對(duì)照(CK)，用芭樂(lè)炭疽病菌作為指示菌，通過(guò)紙片擴(kuò)散法檢測(cè)抗菌蛋白樣品溶液的抑菌活性。

1.5.2 熱穩(wěn)定性 用PBS緩沖液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白樣品溶液，取5個(gè)離心管各加入50 μL抗菌蛋白樣品溶液，分別在40、50、60、70、80 ℃處理30 min后，用紙片擴(kuò)散法，以芭樂(lè)炭疽病菌為指示菌檢測(cè)抗菌蛋白樣品溶液的抑菌活性。

1.5.3 金屬陽(yáng)離子穩(wěn)定性 用無(wú)菌水配制濃度為100 mmol/L的Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、K+、Cr3+溶液，用PBS緩沖液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白樣品溶液。取50 μL抗菌蛋白樣品溶液分裝在11個(gè)離心管中，冷凍干燥后，分別向離心管中加入50 μL上述離子溶液和無(wú)菌水，其中加入無(wú)菌水為對(duì)照組(CK)，室溫放置1 h，以芭樂(lè)炭疽病菌為指示菌，用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)抗菌蛋白樣品溶液的抑菌活性。

1.5.4 表面活性劑穩(wěn)定性 用無(wú)菌水配制200 mmol/L的SDS溶液和2%(V/V)的吐溫(Tween 80)溶液，用PBS緩沖液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白樣品溶液。取3個(gè)1.5 mL的離心管，以體積比1∶1分別加入抗菌蛋白樣品溶液和表面活性劑溶液(或無(wú)菌水)，其中加入無(wú)菌水為對(duì)照組(CK)，室溫放置1 h，以芭樂(lè)炭疽病菌為指示菌，用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)抗菌蛋白樣品溶液的抑菌活性。

1.5.5 有機(jī)溶劑穩(wěn)定性 分別配制20%(V/V)的甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇、丙酮溶液，用PBS緩沖液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白樣品溶液。取5個(gè)1.5 mL的離心管，以體積比1∶1分別加入上述有機(jī)溶劑和抗菌蛋白樣品溶液，另取1個(gè)離心管，以體積比1∶1加入抗菌蛋白樣品溶液和無(wú)菌水為對(duì)照(CK)，室溫放置1 h，以芭樂(lè)炭疽病菌為指示菌，用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)抗菌蛋白樣品溶液的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菜薹種子抗菌蛋白的純化結(jié)果

將紫菜薹種子上清液上樣于SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析柱，對(duì)吸附蛋白進(jìn)行鹽梯度洗脫，得到SP1、SP2、SP3共3個(gè)吸收峰組分(圖1A)，抑菌活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SP2吸收峰組分對(duì)芭樂(lè)炭疽病菌具有抑制活性(圖2)。

圖1 紫菜薹種子抗菌蛋白的純化結(jié)果

將SP2吸收峰組分上樣于Mono STM5/50GL強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，得到MS1和MS2共2個(gè)吸收峰組分(圖1B)，抑菌活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MS1吸收峰組分對(duì)芭樂(lè)炭疽病菌有抑菌活性(圖2)。將MS1吸收峰組分上樣于SuperdexTM75 10/300GL層析柱，得到SUP1、SUP2、SUP3共3個(gè)吸收峰組分(圖1C)，抑菌活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SUP2吸收峰組分對(duì)芭樂(lè)炭疽病菌具有抑制活性(圖2)。對(duì)SUP2吸收峰組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(圖1D)，結(jié)果表明，從紫菜薹種子分離的抗菌蛋白為單一條帶，分子質(zhì)量約為13 ku，與十字花科植物山葵葉片中WjAMP-1抗菌蛋白的分子質(zhì)量(15 ku)大小相近[14]。蘿卜種子抗菌蛋白(9 ku)[15]和油菜種子campesin抗菌蛋白(9.4 ku)[16]比紫菜薹種子抗菌蛋白的分子質(zhì)量稍小。Lin等[17]從菜薹中純化出分子質(zhì)量為5.7 ku的brassiparin抗菌蛋白，分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于紫菜薹種子抗菌蛋白，因而二者不是同一種抗菌蛋白。

圖2 柱層析各吸收峰組分的抑菌活性測(cè)定結(jié)果

2.2 紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌活性測(cè)定結(jié)果

用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)紫菜薹種子抗菌蛋白對(duì)植物病原真菌的抑制活性，結(jié)果顯示，紫菜薹種子抗菌蛋白對(duì)茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、煙草炭疽病菌、芭樂(lè)炭疽病菌、稻瘟病菌、落花生球腔菌、蘋(píng)果黑腐皮殼菌、灰葡萄孢菌共8種植物病原真菌的生長(zhǎng)具有抑制活性(圖3)，而對(duì)凸臍蠕孢菌的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制活性，說(shuō)明紫菜薹種子抗菌蛋白的抗菌譜比較廣。在十字花科其他植物中也純化出具有廣譜抗菌活性的抗菌蛋白，如蘿卜種子Rs-AFP1和Rs-AFP2抗菌蛋白[18]、油菜種子campesin抗菌蛋白[16]和山葵葉片WjAMP-1抗菌蛋白[14]。

CK：PBS緩沖溶液；1：落花生球腔菌；2：蘋(píng)果黑腐皮殼菌；3：稻瘟病菌；4：芭樂(lè)炭疽病菌；5：灰葡萄孢菌；6：尖孢鐮刀菌；7：煙草炭疽病菌；8：茄病鐮刀菌圖3 紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌活性測(cè)定結(jié)果

2.3 紫菜薹種子抗菌蛋白的pH值穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性

紫菜薹種子抗菌蛋白溶液經(jīng)過(guò)不同pH值條件處理，用于檢測(cè)抗菌蛋白的pH值穩(wěn)定性，結(jié)果表明，其在pH值1～3和11～13條件下處理后，仍對(duì)芭樂(lè)炭疽病菌具有較強(qiáng)的抑制活性(圖4A)，說(shuō)明紫菜薹種子抗菌蛋白在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境下穩(wěn)定性較好；紫菜薹種子抗菌蛋白樣品溶液經(jīng)過(guò)不同溫度條件處理，用于檢測(cè)抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明，其在40、50、60、70、80 ℃條件下處理后，對(duì)芭樂(lè)炭疽病菌仍然具有較強(qiáng)的抑制活性(圖4B)，說(shuō)明紫菜薹種子抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性較好。已有其他研究發(fā)現(xiàn)，油菜抗菌蛋白和芥藍(lán)種子抗菌蛋白也具有熱穩(wěn)定性和強(qiáng)酸強(qiáng)堿穩(wěn)定性[16-17,19]。

圖4 紫菜薹種子抗菌蛋白的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 紫菜薹種子抗菌蛋白的金屬陽(yáng)離子穩(wěn)定性

紫菜薹種子抗菌蛋白經(jīng)過(guò)不同金屬陽(yáng)離子處理后，用于檢測(cè)抗菌蛋白的金屬陽(yáng)離子穩(wěn)定性(表1)?？咕鞍自?00 mmol/L的金屬陽(yáng)離子條件下，Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Mg2+、K+、Cr3+8種金屬離子對(duì)其抑菌活性沒(méi)有明顯影響，而Ca2+、Mn2+處理后，抗菌蛋白的抑菌活性消失，由此可知，紫菜薹種子抗菌蛋白經(jīng)過(guò)大部分金屬陽(yáng)離子處理后，仍然對(duì)芭樂(lè)炭疽病菌具有抑制活性，因而紫菜薹種子抗菌蛋白的金屬陽(yáng)離子穩(wěn)定性較好。蘿卜種子抗菌蛋白R(shí)s-AFP1和Rs-AFP2在50 mmol/L的K+條件下，抑菌活性也保持穩(wěn)定[18]，而山葵葉片WjAMP-1抗菌蛋白在Ca2+、K+、Mg2+存在時(shí)，抑菌活性銳減[14]，由此可知，不同的抗菌蛋白對(duì)金屬離子的耐受性不同。

表1 紫菜薹種子抗菌蛋白的金屬陽(yáng)離子穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

注：+為有抑菌活性，-為無(wú)抑菌活性，下同。

2.5 紫菜薹種子抗菌蛋白的表面活性劑穩(wěn)定性

紫菜薹種子抗菌蛋白經(jīng)過(guò)表面活性劑SDS(200 mmol/L)和吐溫(2%)處理后，抑菌活性測(cè)定結(jié)果如圖5所示，可知抗菌蛋白仍然對(duì)芭樂(lè)炭疽病菌具有抑制活性，說(shuō)明表面活性劑對(duì)紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌活性沒(méi)有影響。

圖5 紫菜薹種子抗菌蛋白的表面活性劑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 紫菜薹種子抗菌蛋白的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

紫菜薹種子抗菌蛋白經(jīng)甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇、丙酮處理，用于檢測(cè)抗菌蛋白對(duì)有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性，結(jié)果如表2，可以看出，紫菜薹種子抗菌蛋白對(duì)甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇、丙酮5種有機(jī)溶劑穩(wěn)定。

表2 紫菜薹種子抗菌蛋白的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

在十字花科植物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種抗菌蛋白的存在，如油菜[16,19-20]、山葵[14]、芥藍(lán)[21]、蘿卜[18]、大白菜[22]、擬南芥[23]、花菜[24]等中的抗菌蛋白，但對(duì)紫菜薹種子抗菌蛋白的研究還較少。本試驗(yàn)選取紫菜薹種子作為研究材料，勻漿后將其上清液依次通過(guò)SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析柱、Mono STM5/50GL強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析柱和SuperdexTM75 10/300GL層析柱，分離得到一種天然的抗菌蛋白，采用SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，紫菜薹種子抗菌蛋白分子質(zhì)量約為13 ku，屬于小分子質(zhì)量的抗菌蛋白，與山葵WjAMP-1抗菌蛋白分子質(zhì)量(15 ku)相近[14]。然后對(duì)該抗菌蛋白的抑菌活性進(jìn)行初步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)8種植物病原真菌具有抑制活性，是一種廣譜抗菌蛋白。

為研究紫菜薹種子抗菌蛋白的潛在應(yīng)用價(jià)值，進(jìn)而測(cè)定了該抗菌蛋白的pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、金屬陽(yáng)離子穩(wěn)定性、表面活性劑穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性。結(jié)果表明，紫菜薹種子抗菌蛋白能夠耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿和高溫環(huán)境，除Mn2+、Ca2+以外的大多數(shù)金屬離子不影響紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌活性。此外，表面活性劑和有機(jī)溶劑對(duì)紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌活性也都無(wú)影響。因而可知，紫菜薹種子抗菌蛋白是一種抑菌活性穩(wěn)定、不易受環(huán)境影響、具有潛在應(yīng)用價(jià)值的抗菌蛋白。

十字花科植物抗菌蛋白對(duì)病原真菌具有較強(qiáng)的抑制活性。其中，紅色甘藍(lán)抗菌蛋白分子質(zhì)量約為30 ku，對(duì)落花生球腔菌的半抑制濃度(IC50)為5 μmol/L[5]；芥藍(lán)種子抗菌蛋白分子質(zhì)量為5.9 ku，對(duì)尖孢鐮刀菌、玉米小斑病菌、落花生球腔菌、蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的IC50分別為4.3、2.1、2.4、0.15 μmol/L[21]。結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)的抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性、金屬離子穩(wěn)定性等生物學(xué)活性，可知十字花科植物抗菌蛋白具有開(kāi)發(fā)為生物農(nóng)藥的潛在應(yīng)用價(jià)值。為了更好地開(kāi)發(fā)紫菜薹種子的應(yīng)用價(jià)值，還需要對(duì)紫菜薹種子抗菌蛋白的抑菌效果和機(jī)制展開(kāi)進(jìn)一步研究。