李雪君，孫計(jì)平，婁亞男，平文麗，孫 煥，丁燕芳，崔 紅

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所/黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 許昌 461000;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002)

甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS)是目前公認(rèn)的應(yīng)用最廣泛且效果較明顯的一種高效、穩(wěn)定的化學(xué)誘變劑。EMS誘變不需要遺傳轉(zhuǎn)化，可使DNA分子形成較多的點(diǎn)突變，對(duì)染色體損傷輕且不容易導(dǎo)致畸變，因而被廣泛用于突變體的創(chuàng)造[1]。EMS誘變既是對(duì)種質(zhì)資源的創(chuàng)新，又是挖掘新基因的強(qiáng)有力工具，加速育種進(jìn)程的同時(shí)也推動(dòng)功能基因組學(xué)的發(fā)展。近年來，EMS誘變效果的影響因素、后代的篩選與鑒定及其在農(nóng)作物新品種選育等方面的研究取得了較大進(jìn)展[2]。目前，EMS誘變?cè)诙喾N作物育種中取得顯著成就，如玉米[3]、小麥[4]、水稻[5]、花生[6-7]、芝麻[8]、大豆[9-10]、紅小豆[11]、苦蕎[12]、茄子[13]等。煙草上通過EMS誘變突變體的研究主要集中在PVY抗性[14]、耐低鉀[15-16]、抗干旱[17]、抗主要病蟲害突變體材料的鑒定方法[18]等方面，對(duì)不同香韻突變材料的篩選研究應(yīng)用尚未見報(bào)道。

香韻是用來描述發(fā)香物質(zhì)或加香制品所帶來的某種香氣的韻調(diào)[19]，煙葉的香韻是指煙葉煙氣所表現(xiàn)出的某種香氣韻調(diào)[20]。目前煙葉中所發(fā)現(xiàn)的香韻有干草香、清甜香、正甜香等15種。其中干草香是烤煙本香，其余各香韻在不同香型煙葉中的分布不同[21]。煙葉不同香韻的表現(xiàn)受產(chǎn)地[21-27]、氣象[28]、區(qū)域環(huán)境[29]等因素的影響，但其本質(zhì)是與煙葉和煙氣中的相關(guān)香氣成分的種類和含量密切相關(guān)。每一類香氣成分的香韻基本不變，針對(duì)不同香氣成分含量，篩選不同香韻的株系，對(duì)豐富煙草類型具有重要意義。

煙草葉面腺毛具有較強(qiáng)的分泌能力[30]，腺毛分泌物不僅對(duì)煙株抗性具有積極作用，與煙葉香氣品質(zhì)和風(fēng)味形成也密切相關(guān)[31]。煙葉腺毛發(fā)育狀況好、密度高，腺毛分泌物多，其香氣飽滿、醇厚、濃郁[32]。前期，以腺毛密度為主要指標(biāo)對(duì)中煙100 EMS突變體進(jìn)行了初步篩選[33]，在此基礎(chǔ)上，對(duì)EMS誘變材料后代進(jìn)行特征香氣成分研究，以期鑒定出不同香韻的突變材料，為特香型煙草新品系的篩選提供材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用0.8% EMS處理中煙100裸種，處理后的致死率在50%左右。種子正常萌發(fā)成苗后，按照優(yōu)質(zhì)煙葉栽培規(guī)程進(jìn)行大田種植，單株留種，收獲M2代種子2 000余份。對(duì)M2代EMS誘變株進(jìn)行初步的室內(nèi)篩選，獲得了29份腺毛密度相對(duì)較高的突變材料，以中煙100為對(duì)照(CK)，進(jìn)行田間種植，進(jìn)一步做相關(guān)指標(biāo)鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 腺毛密度觀測(cè) 參照劉貫山等[33]的方法，利用Motic顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。

1.2.2 葉面分泌物的提取檢測(cè) 參考楊永霞等[34]的方法提取鮮煙葉葉面成分，加入1 mL內(nèi)標(biāo)(2.020 mg/mL蔗糖八乙酸酯和2.542 mg/mL正十七烷醇的混合溶液)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，硅烷化處理后采用GC/MS進(jìn)行分析。

1.2.3 中性香氣成分的提取和檢測(cè) 提取方法和GC/MS檢測(cè)參照冀浩等[35]的相關(guān)研究。參照李偉等[36]對(duì)中性致香物質(zhì)的分類方法，把33種中性致香物質(zhì)分為五大類：類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、棕色化反應(yīng)產(chǎn)物、苯丙氨酸類降解產(chǎn)物、類西柏烷類降解產(chǎn)物、新植二烯。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變后代煙草各株系的腺毛密度

對(duì)M2代突變體葉片表面腺毛密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)部分突變株腺毛密度有較大改變，結(jié)果如圖1所示。腺毛密度高于中煙100(CK)的有27份，其中MC-29、SX-19、MC-67、MC-70、SX-3A、SX-18、MC-8、SX-7等8份材料極顯著高于CK，以MC-29最高，達(dá)到96.3個(gè)/mm2；SX-14、SX-5、SX-11等10份材料顯著高于CK，其余材料與CK差異不顯著。

2.2 EMS誘變后代煙草各株系的葉面分泌物含量

煙草葉面腺毛豐富，分泌旺盛，腺毛分泌物是煙草葉面化學(xué)成分的重要組成部分?？緹熛倜置谖镏饕俏靼赝轭惗苹衔?、糖脂、烷烴類等，其中，西柏烷類化合物不僅是煙葉重要的香氣前體物質(zhì)，對(duì)驅(qū)避蚜蟲、防御病毒侵襲以及應(yīng)對(duì)干旱、紫外照射等逆境脅迫也有積極作用。由圖2可見，SX-3、SX-3A、MC-67、MC-30、MC-1等5份材料的腺毛分泌物中西柏烷類化合物含量較高，較CK均增加100%以上，其中以SX-3的增幅最大，達(dá)188.9%。腺毛分泌物中西柏烷類化合物含量低于CK的材料有5份，分別為SX-6、MC-46、SX-5、MC-2、SX-11。其余材料的西柏烷類化合物含量均高于CK，增幅介于0～100%。

葉面腺毛分泌物總量較CK增加100%以上的有SX-3、SX-3A、MC-67，其中以SX-3的增幅最高，達(dá)164.45%，SX-3A增幅為143.64%；MC-29、SX-5、MC-46、SX-11和MC-2等5份材料的腺毛分泌物總量低于CK，其余21份材料的腺毛分泌物總量均高于CK，增幅介于0～100%。

*、**分別表示在0.05、0.01水平上的差異顯著性

圖2 EMS誘變后代煙草不同株系的葉面分泌物含量變化

2.3 EMS誘變后代煙草各株系的中性香氣物質(zhì)含量

2.3.1 中性香氣物質(zhì)總量 煙草香味由多種具有特定香味特征的成分共同決定，而中性致香物質(zhì)是評(píng)價(jià)煙葉質(zhì)量的核心內(nèi)容，其含量可作為評(píng)價(jià)煙葉口感特性的參考指標(biāo)。由圖3可見，EMS誘變后代株系的香氣物質(zhì)總量高于CK的僅有9個(gè)株系，較為突出的是MC-29、SX-17和SX-19，分別比CK高出51.28%、29.66%和23.26%,其他6個(gè)株系的香氣物質(zhì)總量略高于CK；其余20個(gè)株系的香氣物質(zhì)總量均低于CK。

圖3 EMS誘變后代煙草不同株系中性香氣物質(zhì)總量變化

2.3.2 苯丙氨酸類降解產(chǎn)物 煙草中苯丙氨酸的代謝轉(zhuǎn)化是影響香味的重要過程之一。苯丙氨酸類致香物質(zhì)可使煙草增加類似花香的香味，其代謝產(chǎn)物苯甲醇、苯乙醇可增加煙氣的花香、櫻桃香、杏仁香及皂香香味[37]；苯甲醛與苯乙醛可以改善卷煙吃味，與煙香協(xié)調(diào)、增加煙草的自然風(fēng)味，具有掩蓋雜氣刺激的作用[38-39]。由圖4可見，不同株系之間苯丙氨酸類降解產(chǎn)物的含量差異較大，大部分材料高于CK，低于CK的有9份材料。MC-70苯丙氨酸類降解產(chǎn)物的總量較CK增加最多，達(dá)到94.39%，其次為SX-18，較CK增加78.73%。這2個(gè)株系對(duì)苯丙氨酸類降解產(chǎn)物含量的提高效果較為明顯。此外，MC-9、MC-30、SX-8等3個(gè)株系的丙氨酸類降解產(chǎn)物含量較CK提高均達(dá)50%以上，也是3個(gè)較好的材料。苯甲醛和苯乙醛含量較CK增幅較大的株系為SX-8和SX-17，其中，SX-8分別比CK增加165.87%和195.82%，SX-17分別比CK增加85.86%和155.17%。有21個(gè)株系糠醛含量增加，但增加幅度均小于29%。初步認(rèn)為MC-70、SX-18、SX-8、SX-17這4份材料可以作為類似花香香韻類型的煙草突變材料。

圖4 EMS誘變后代煙草不同株系的苯丙氨酸類降解產(chǎn)物含量變化

2.3.3 棕色化反應(yīng)產(chǎn)物 由圖5可見，不同株系之間棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量差異較大。除7個(gè)株系的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量低于CK，其余株系的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量均高于CK，以SX-7增幅最大，為47.92%，其次是SX-13(41.99%)；SX-8、SX-13的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物中3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮的含量較CK增加非常多，分別達(dá)141.21%、124.7%。

圖5 EMS誘變后代煙草不同株系的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量變化

2.3.4 類胡蘿卜素降解產(chǎn)物 類胡蘿卜素是煙葉中重要的香氣前提物質(zhì)。Gao等[40]分析認(rèn)為，濃香型烤煙的特征香氣成分可能與類胡蘿卜素的降解產(chǎn)物相關(guān)。由圖6可見，與CK相比，類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量增加的材料較多，但增幅基本都在40%以下。SX-8、MC-29、SX-17、SX-13、SX-12等材料的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量增幅相對(duì)較高，其中尤以SX-8、MC-29增幅較高，分別達(dá)38.69%、38.67%。因此，可以將SX-8、MC-29作為篩選濃香型風(fēng)格突出的材料。

類胡蘿卜素降解產(chǎn)物中的氧化異佛爾酮具有甜味、紫羅蘭酮味。SX-14、MC-1等2份材料的氧化異佛爾酮含量較高，較CK分別增加340.23%、232.68%，可以作為紫羅蘭酮香韻的突變材料。香葉基丙酮能夠增加濃度、青味，該物質(zhì)含量較CK增加100%以上的材料有4個(gè)，分別是SX-8、SX-12、SX-13、MC-8。內(nèi)酯類一般具有特殊香味，二氫獼猴桃內(nèi)酯在吸食煙草時(shí)可以起到消除刺激性的作用，SX-8和SX-13的二氫獼猴桃內(nèi)酯含量較CK分別增加132.60%和133.73%。β-環(huán)檸檬醛具有甜味，可以增加濃度和刺激。MC-67的β-環(huán)檸檬醛含量較CK增加172.96%，其他材料增加很少，大部分較CK降低。

圖6 EMS誘變后代煙草不同株系的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量變化

2.3.5 類西柏烷類降解產(chǎn)物 茄酮是類西柏烷類降解產(chǎn)物中十分重要的香氣成分，具有青香、草香及甜香，香氣較持久，可以與多種香氣較好地協(xié)調(diào)，能賦予煙草醇和的特殊香氣[37]。由圖7可見，與CK相比，大部分材料的類西柏烷類降解產(chǎn)物含量降低，僅有4個(gè)材料較CK增加，其中MC-67、SX-18分別增加65.05%、26.81%，可以作為青香、草香香韻的突變材料。

圖7 EMS誘變后代煙草不同株系的類西柏烷類降解產(chǎn)物含量變化

2.3.6 新植二烯 新植二烯為煙葉中重要的萜烯類化合物，其本身不僅具有一定的香氣，而且可分解轉(zhuǎn)化形成低分子香味成分，是煙草中重要的香味成分[37]。新植二烯可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為具有清香氣息的低分子香氣質(zhì)量成分，如植物呋喃等，對(duì)形成烤煙的清香氣息具有積極影響[41]。由圖8可見，與CK相比，EMS誘變后代不同株系的新植二烯含量減少的居多，僅有10份材料高于CK，MC-29的新植二烯含量最高，較CK增加57.54%，SX-17和SX-19的新植二烯含量比CK增加20%以上；其他幾個(gè)株系新植二烯含量高于CK，但與CK相差不大。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，MC-29是一個(gè)比較特殊的材料，其腺毛密度在所有材料中最高，葉面分泌物較低(低于CK)，但新植二烯含量非常高，香氣物質(zhì)總量最高，可以作為高新植二烯含量的突變材料。清香型煙葉主體香韻中清甜香和青香香韻與新植二烯含量呈極顯著正相關(guān)[42]，MC-29可以作為清香香韻的材料之一。

圖8 EMS誘變后代煙草不同株系的新植二烯含量變化

總的來看，MC-29、SX-17、SX-19等3個(gè)株系的香氣物質(zhì)含量較高；MC-70、SX-18等2份材料的苯丙氨酸類降解產(chǎn)物含量較高，較CK增加72%以上，是提高苯丙氨酸類降解產(chǎn)物含量很好的材料，MC-9、MC-30的增幅也達(dá)到50%以上；MC-67類西柏烷類降解產(chǎn)物含量較CK增加達(dá)到60%以上，對(duì)提高該類物質(zhì)含量是很好的材料；SX-7、SX-13棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量和MC-29新植二烯含量較CK增幅均達(dá)40%以上。因此，針對(duì)香氣物質(zhì)含量，篩選得到的較好材料有MC-29、SX-17、SX-19、MC-67、SX-18、MC-70。

3 結(jié)論與討論

腺毛密度和葉面分泌物含量在不同煙草基因型間存在顯著差異，葉面分泌物含量與腺毛密度呈極顯著正相關(guān)[43]。本研究中，突變體腺毛密度極顯著高于CK的有MC-29、SX-19、MC-67、MC-70、SX-3A、SX-18、MC-8、SX-7等8份材料，而葉面分泌物總量明顯高于CK的有SX-3、SX-3A、MC-67、MC-1、MC-30、SX-1等6份材料。與CK相比，MC-67和SX-3A兩個(gè)材料既具有較高的腺毛密度，又具有較高的葉面分泌物含量。葉面分泌物含量不僅與密度相關(guān)，還與腺毛分泌能力相關(guān)[34]，本研究中，MC-29雖然具有較高的腺毛密度，但其葉面分泌物含量低于CK。

棕色化反應(yīng)產(chǎn)物主要有糠醛、糠醇等，可使煙葉具有如面包香、堅(jiān)果香、甜香等特殊的香味[37]?？啡┚哂薪固翘鹣?、烘烤香氣，在該批突變材料中沒有找到糠醛含量增加大于25%的材料。這批材料是以腺毛密度為前提篩選出來的，因此推測(cè)，糠醛含量的增加可能與腺毛密度沒有太大的關(guān)系，有待進(jìn)一步篩選鑒定。

篩選葉面化學(xué)成分含量變化的突變體，在眾多的性狀和篩選指標(biāo)中根據(jù)腺毛密度開始進(jìn)行篩選是一種比較有效的方法。首先，腺毛密度易于觀察，可以在小苗期進(jìn)行，減少了大田種植的工作量；其次，腺毛密度和葉面分泌物、香氣物質(zhì)含量等密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，從葉面分泌物、中性香氣成分等指標(biāo)中篩選的優(yōu)良株系其腺毛密度均較高。

本研究初步篩選出MC-29、SX-17、SX-19等3個(gè)香氣物質(zhì)含量較高的株系，可以作為高香氣物質(zhì)的突變材料。篩選出的具有清香氣息的株系為MC-29、SX-17、SX-19，具有青草香、青香、青甜香香韻的株系為MC-67、SX-3A，類似花香氣韻的株系為MC-70、SX-18、SX-17、SX-8等，具有紫羅蘭香韻的株系為SX-14、MC-1等。不同香氣成分含量對(duì)煙葉香韻的影響較大，后代香氣成分含量表達(dá)的穩(wěn)定性和相關(guān)成分的突變機(jī)制等還有待進(jìn)一步研究。