滕 露，倪志勇，于月華

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

NF-Y(核因子Y，也被稱為CBF或血紅素激活蛋白)是成員較多的轉(zhuǎn)錄因子之一，普遍存在于高等真核生物中，通過結(jié)合CCAAT元件參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)[1]。NF-Y由3個蛋白質(zhì)家族的單個亞基組成，即NF-YA亞基(又名HAP2或CBF-B)、NF-YB亞基(HAP3或CBF-A)和NF-YC亞基(HAP5或CBF-C)[2]。這3個亞基在酵母和哺乳動物中均為單基因編碼，但在植物中每個亞基都由多個基因編碼[3]，這表明在植物中各種蛋白質(zhì)具有比其他生物更復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，每個NF-Y亞基都有自己獨特的高度保守的核心區(qū)域[4]，幫助植物形成靈活的、多功能的轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)，以適應(yīng)復(fù)雜多樣的環(huán)境條件[5]。許多研究表明，NF-Y基因家族成員眾多，不同成員在植物不同的發(fā)育過程中調(diào)節(jié)相應(yīng)的生物學(xué)功能，如抑制水稻(Oryza)OsHAP3基因的表達(dá)導(dǎo)致葉綠體退化，使光合作用相關(guān)基因表達(dá)量下調(diào)[6]。大豆GmNF-YA3在擬南芥中的過表達(dá)通過激活脫落酸(ABA)應(yīng)答基因，增強了擬南芥的抗旱性，提高了對外源ABA的敏感性[7]。楊樹PdNF-YB7過表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱能力[8]。此外，微陣列分析顯示，擬南芥AtNF-YA5通過調(diào)節(jié)多種干旱和氧化誘導(dǎo)型基因改善耐旱性[9]。

目前，很多植物的基因組已經(jīng)完成了測序，全基因組范圍挖掘NF-Y基因家族成員，從進(jìn)化角度分析NF-Y的功能報道很多。全基因組分析發(fā)現(xiàn)，雙子葉植物擬南芥中有10個NF-YA基因、13個NF-YB基因和13個NF-YC基因[10]，通過定量PCR發(fā)現(xiàn)，2個成員(AtNF-YB9和AtNF-YB6)具有調(diào)控植物胚胎發(fā)育的功能[11]，AtNF-YB9在植物胚胎發(fā)育過程中作為光信號和激素信號的一個調(diào)控樞紐起作用[12]。擬南芥的4個NF-YA成員(AtNF-YA1、AtNF-YA5、AtNF-YA6和AtNF-YA9)過表達(dá)會影響雄配子及種子的發(fā)育[13]。3個表達(dá)于維管束的NF-YC成員(AtNF-YC3、AtNF-YC4和AtNF-YC9)參與了光周期依賴性的開花調(diào)控過程[14]。全基因組分析發(fā)現(xiàn)，大豆中有20個NF-YA、39個NF-YB、27個NF-YC[15]。在單子葉植物水稻中，已鑒定了10個NF-YA基因、11個NF-YB基因和13個NF-YC基因[6]。水稻OsHAP3E通過調(diào)控分生組織的形態(tài)發(fā)生參與到營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育過程中[16]。水稻的3個NF-YB成員(OsNF-YB2、OsNF-YB3和OsNF-YB4)調(diào)控許多光合作用相關(guān)的基因[6]。在小麥中已鑒定出10個NF-YA基因、11個NF-YB基因和14個NF-YC基因。小麥中的5個NF-YC成員(TaNF-YC5、TaNF-YC8、TaNF-YC9、TaNF-YC11和TaNF-YC12)受光信號調(diào)控[3]。同樣，也從大麥、番茄等植物中鑒定出了NF-Y基因家族成員。

鷹嘴豆是一種高營養(yǎng)價值的豆科作物，是第二大食用豆類，富含多種蛋白質(zhì)、維生素、異黃酮等生理活性物質(zhì)，具有良好的醫(yī)療保健功能，其耐干旱、貧瘠的特點使其成為農(nóng)作物抗性改良的重要基因資源。目前，鷹嘴豆測序已經(jīng)完成，為全基因組家族分析提供了序列基礎(chǔ)[17]。研究植物基因組中NF-Y基因的分布、基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)模式，對于進(jìn)一步研究其在植物生長發(fā)育及抗性中的功能具有重要意義[18]。鑒于此，從鷹嘴豆全基因組中查找鑒定可能的NF-Y轉(zhuǎn)錄因子家族基因成員，并通過生物信息學(xué)分析方法，從序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹、基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、染色體分布以及miRNA的靶位點預(yù)測等方面，分析該家族成員的結(jié)構(gòu)和功能，為NF-Y基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

鷹嘴豆(Cicerarietinum)全基因組序列下載于NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)的NF-Y基因信息來源于植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB database(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)。

1.2 NF-Y基因家族成員鑒定

使用擬南芥NF-Y的氨基酸序列進(jìn)行比對，在鷹嘴豆全基因組序列中鑒定NF-Y基因家族成員，根據(jù)在擬南芥中的同源基因，命名鷹嘴豆NF-Y基因家族成員。從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得各個序列的染色體定位信息，將染色體定位信息整理成表格，利用表格篩選功能，刪除全基因組序列中染色體定位相同的基因，去掉重復(fù)序列，再通過DNAMAN 8.0軟件對NF-Y蛋白氨基酸序列進(jìn)行分子質(zhì)量、等電點預(yù)測。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建及蛋白質(zhì)保守序列比對分析

通過CLUSTALX軟件對鷹嘴豆和擬南芥NF-Y蛋白進(jìn)行多序列比對分析，分析結(jié)果使用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)生成NF-Y蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，校驗參數(shù)Bootstrap重復(fù)1 000次。采用DNAMAN 8.0生物學(xué)軟件進(jìn)行保守域序列比對分析。

1.4 鷹嘴豆NF-Y基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

根據(jù)鷹嘴豆NF-Y基因的cDNA序列，從數(shù)據(jù)庫中得到對應(yīng)的內(nèi)含子和外顯子長度以及分布信息，利用Gene Structure Display Server(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線分析鷹嘴豆NF-Y基因家族的基因結(jié)構(gòu)。利用MEME(http://meme-suite.org)在線程序?qū)椬於筃F-Y基因家族的保守基序進(jìn)行分析，預(yù)測鷹嘴豆NF-Y家族蛋白質(zhì)的保守基序(Motif)，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

1.5 miRNA169的靶位點預(yù)測

在psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/)網(wǎng)站中選擇靶位點預(yù)測欄目，將41條鷹嘴豆NF-Y基因家族成員的基因序列提交至系統(tǒng)進(jìn)行miRNA169靶位點預(yù)測，參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鷹嘴豆NF-Y基因家族成員鑒定

為了鑒定鷹嘴豆NF-Y基因，使用擬南芥NF-Y的氨基酸序列進(jìn)行比較，將鷹嘴豆與擬南芥中相似性高的序列作為同系進(jìn)行命名(表1)。利用MEGA 5.0和DNAMAN 8.0軟件，對鷹嘴豆NF-Y基因家族41個成員的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NF-Y基因家族的41個成員分為8個NF-YA、22個NF-YB和11個NF-YC。根據(jù)鷹嘴豆基因位置信息，在7條(Ca1—Ca7)染色體上定位了38個NF-Y基因，1號和4號染色體上基因最多，都含有8個NF-Y成員，其次是7號染色體，含有7個基因，2號染色體上分布最少,另外還有3條序列未定位到染色體上。蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量最大的是CarNF-YC2蛋白，為104.364 0 ku，最小的是CarNF-YC5蛋白，為12.598 6 ku。鷹嘴豆NF-Y蛋白中CarNF-YC2含有924個氨基酸殘基，CarNF-YC5僅有114個氨基酸殘基。鷹嘴豆NF-Y基因家族41個成員編碼的蛋白質(zhì)等電點介于4.185 1～10.319 1(表1)。

表1 鷹嘴豆NF-Y基因家族成員信息

續(xù)表1 鷹嘴豆NF-Y基因家族成員信息

2.2 鷹嘴豆NF-Y家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序及系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了解鷹嘴豆41個NF-Y基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及生物學(xué)功能，構(gòu)建鷹嘴豆與擬南芥NF-Y蛋白家族成員進(jìn)化樹(圖1)。由圖1可見，Car/AtNF-YA可以分成6類(Ⅰ—Ⅵ)，分別由6、1、3、3、1、4種蛋白質(zhì)組成；Car/AtNF-YB可以分成4類(Ⅰ—Ⅳ)，分別由21、8、2、4種蛋白質(zhì)組成；Car/AtNF-YC亞基可以分成3類(Ⅰ—Ⅲ)，分別由17、4、4個蛋白質(zhì)組成(圖1)。

鷹嘴豆NF-Y基因基序鑒定結(jié)果(圖2)顯示，共鑒定到3個保守基序，分別為Motif1、Motif2和Motif3，其中Motif1、Motif2在CarNF-YB和CarNF-YC亞家族中均有分布，而Motif3僅分布在CarNF-YA亞家族中。同一分類的NF-Y轉(zhuǎn)錄因子基本上含有相同的保守基序。對鷹嘴豆NF-Y家族成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，NF-Y基因家族成員大部分由1～5個內(nèi)含子和1～6個外顯子組成，其中18個成員只有1個外顯子，外顯子比較長的是CarNF-YC2和CarNF-YC3，分別為1 660 bp和782 bp，少數(shù)序列如CarNF-YB9和CarNF-YC6等僅含有外顯子結(jié)構(gòu)(圖2)。

A、B、C分別為Car/AtNF-YA、Car/AtNF-YB、Car/AtNF-YC亞家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 鷹嘴豆NF-Y保守域序列比對分析

使用全長氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，鑒定鷹嘴豆NF-Y 3個亞基家族的結(jié)構(gòu)域，CarNF-YA蛋白具有1個NF-YB/NF-YC亞基相互作用結(jié)構(gòu)域和1個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。CarNF-YB蛋白包括2個NF-YC相互作用結(jié)構(gòu)域、1個NF-YA相互作用結(jié)構(gòu)域和1個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。CarNF-YC蛋白包括2個NF-YA相互作用結(jié)構(gòu)域、2個NF-YB相互作用結(jié)構(gòu)域和1個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖3—5)。

2.4 miRNA169的靶位點預(yù)測

通過psRNATarget網(wǎng)站在線預(yù)測鷹嘴豆NF-Y基因家族的miRNA169靶位點，結(jié)果顯示，只有NF-YA基因亞家族的成員中有6個CarNF-YA(CarNF-YA1/2/3/4/5/7)受miRNA169調(diào)控(圖6)，而NF-YB、NF-YC亞家族基因沒有該靶位點。

左為CarNF-Y基因家族進(jìn)化樹，中為CarNF-Y基因結(jié)構(gòu)，右為CarNF-Y保守基序

圖3 鷹嘴豆NF-Y家族中CarNF-YA蛋白保守域序列比對

圖4 鷹嘴豆NF-Y家族中CarNF-YB蛋白保守域序列比對

圖5 鷹嘴豆NF-Y家族中CarNF-YC蛋白保守域序列比對分析

圖6 CarNF-YA基因3′非翻譯區(qū)推測的miRNA169靶位點

3 結(jié)論與討論

NF-Y轉(zhuǎn)錄因子功能多樣，它們參與調(diào)節(jié)植物胚胎發(fā)育、光合作用、葉綠體發(fā)育和逆境響應(yīng)等重要生理過程。本研究通過對鷹嘴豆進(jìn)行全基因組生物信息學(xué)分析，共鑒定出41個鷹嘴豆NF-Y蛋白家族成員，包括8個NF-YA、22個NF-YB和11個NF-YC。系統(tǒng)進(jìn)化樹上位于一個分支的蛋白質(zhì)可能具有類似的生物學(xué)功能，之前的研究已經(jīng)鑒定了一些擬南芥NF-Y蛋白家族成員的生物學(xué)功能，如擬南芥NF-YA能夠抑制活性氧的積累從而激活A(yù)BA途徑的基因表達(dá)[19]。本研究利用模式植物擬南芥的NF-Y基因進(jìn)行同源比對分析，構(gòu)建了鷹嘴豆和擬南芥NF-Y蛋白家族成員進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)Car/AtNF-YA、Car/AtNF-YB和Car/AtNF-YC這3個亞家族各個成員在進(jìn)化樹上均表現(xiàn)出相近的親緣關(guān)系。Car/AtNF-YA可以分成6類，分別由6、1、3、3、1、4種蛋白質(zhì)組成；Car/AtNF-YB可以分成4類，分別由21、8、2、4種蛋白質(zhì)組成；Car/AtNF-YC亞基可以分成3類，分別由17、4、4個蛋白質(zhì)組成，據(jù)此可預(yù)測鷹嘴豆NF-Y轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能，為深入研究NF-Y轉(zhuǎn)錄因子家族的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

miRNA通過識別靶mRNA互補位點，切割靶mRNA或抑制其翻譯，調(diào)控基因的表達(dá)。研究表明，NF-YA亞基的編碼基因在轉(zhuǎn)錄后水平受miRNA169調(diào)控。例如，擬南芥AtNF-YA5受miRNA169負(fù)調(diào)控應(yīng)答干旱脅迫[9]，水稻miRNA169切割OsNF-YA8參與鹽脅迫應(yīng)答[20]。本研究通過miRNA靶位點預(yù)測，發(fā)現(xiàn)6個CarNF-YA(CarNF-YA1/2/3/4/5/7)受miRNA169調(diào)控，而CarNF-YB和CarNF-YC不受miRNA調(diào)控，暗示NF-YA基因可能存在更復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。