李 波，方志堅(jiān)

(齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院/抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米是東北地區(qū)種植的主要作物，其播種面積和總產(chǎn)量均較高[1]。早春低溫冷害形成該區(qū)域特有的生態(tài)氣候條件，對作物種子生活力產(chǎn)生不良影響[2]。玉米是溫度敏感型作物，對溫度條件要求較高，耐受冷害能力較弱。因此，北方玉米種植區(qū)玉米產(chǎn)量不可避免地受到春播低溫的影響[3-4]。近年來，關(guān)于玉米低溫冷害以及緩解低溫冷害對玉米生產(chǎn)的影響方面已有研究。低溫脅迫的玉米植株，葉片光合系統(tǒng)受到抑制，植株的正常生長發(fā)育受到影響[5-6]。針對玉米遭遇低溫冷害的現(xiàn)象，可以通過加入適宜濃度的外源物質(zhì)[7]、噴施冠菌素(COR)[8]、加入外源脯氨酸(Pro)和甜菜堿(GB)[9]等方法進(jìn)行緩解。但以往這些研究主要集中在不同品種玉米種子萌發(fā)、幼苗生長和生理生化方面。在玉米不同的生長階段，低溫對營養(yǎng)生長和生殖生長均產(chǎn)生不同程度的影響[10]，因低溫引起玉米葉片超微結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。另外，選育耐冷性較強(qiáng)的品種或自交系，探索提高玉米種子抗(耐)冷能力的技術(shù)體系，是應(yīng)對早春低溫冷害的有效措施。不同品種對低溫的耐受能力不同，其幼苗生理特性往往不同。鑒于此，研究了不同玉米自交系幼苗的耐低溫能力，并對耐低溫能力不同的玉米自交系的抗逆生理特性進(jìn)行初步探討，以篩選適宜東北地區(qū)春季早播的耐低溫玉米自交系，同時為培育耐低溫玉米新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以黑龍江省畜牧研究所提供的91份玉米自選自交系種子為材料，具體編號和名稱見表1。

表1 玉米自交系材料及編號

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低溫處理 采用0.1% HgCl2對玉米種子進(jìn)行消毒，然后均勻播種在裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽內(nèi)，每天定期觀察和統(tǒng)計(jì)出苗率，待幼苗長到3葉1心期，將部分幼苗移入培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫處理：3 ℃處理5 d，3次重復(fù)，每次重復(fù)20株幼苗，之后在25 ℃人工氣候箱中恢復(fù)生長3 d后，計(jì)算其相對存活率，并根據(jù)相對存活率對玉米自交系的耐低溫等級進(jìn)行分類。

選擇不同耐低溫等級玉米自交系種子6份，在裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽內(nèi)培養(yǎng)至3葉1心期后，移入7 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，25 ℃人工氣候箱恢復(fù)生長3 d，選取功能葉片用于生理生化指標(biāo)測定和透射電鏡切片的制作。

1.2.2 生理生化指標(biāo)測定 對不同耐低溫等級的玉米自交系幼苗進(jìn)行8項(xiàng)生理指標(biāo)的測定[11]：可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法，可溶性糖、丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法，脯氨酸含量測定采用茚三酮法，相對電導(dǎo)率測定采用電導(dǎo)法，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法，過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外吸收法，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑光化還原法，各指標(biāo)測定均重復(fù)3次。

1.2.3 透射電鏡切片的制作 選擇耐低溫能力強(qiáng)弱不同的2個自交系，取幼苗葉片(3葉1心期中間葉片)中部，切割成2～4 mm小塊→2.5%戊二醛固定2 h→0.1 mol/L磷酸液沖洗30 min→2%四氧化鋨固定2 h→蒸餾水沖洗30 min→30%、50%、70%、80%乙醇4 ℃脫水各15 min→90%、95%乙醇室溫各15 min→100%乙醇和100%環(huán)氧丙烷室溫各20 min→環(huán)氧丙烷和環(huán)氧樹脂3∶1、1∶1、1∶3分別滲透1 h、2 h、2 h→60 ℃恒溫箱聚合36 h→1 μm半薄切片→醋酸雙氧鈾染色30 min→超薄切片→日立H-7650型透射電鏡觀察和拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用分析軟件Excel 2003、SPSS 17.0對所測指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，比較8項(xiàng)生理生化指標(biāo)的差異及其顯著性。

通過8項(xiàng)指標(biāo)的低溫處理與對照的測定值計(jì)算抗寒系數(shù)，再利用抗寒系數(shù)計(jì)算隸屬值，應(yīng)用隸屬函數(shù)法對玉米自交系抗逆性進(jìn)行綜合評價[12-13]。

抗寒系數(shù)=低溫處理測定值/對照測定值；

隸屬函數(shù)值計(jì)算公式：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；反隸屬函數(shù)值計(jì)算公式：R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；式中，Xi為指標(biāo)測定值，Xmin、Xmax分別為某項(xiàng)指標(biāo)的最小值和最大值。將耐低溫能力隸屬值進(jìn)行累加求出平均數(shù)：X=ΣU(Xi)/n，X為所求平均抗性的隸屬值。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對玉米自交系幼苗相對存活率的影響

由圖1可見，91份玉米自交系幼苗在3 ℃低溫處理后相對存活率差異極大，在同一低溫脅迫處理下，相對存活率最高為83.33%，最低為0。依據(jù)低溫脅迫下玉米幼苗的相對存活率，對91份玉米自交系的耐低溫等級進(jìn)行分類，共分6級(表2)，其中，11號自交系幼苗相對存活率為83.33%，為91份材料中耐低溫能力極強(qiáng)的自交系；其次為12、16、33、34、36、83號自交系，對低溫有強(qiáng)耐性，幼苗相對存活率分別為78.57%、74.07%、75.86%、71.43%、72.00%、62.96%；耐低溫能力中強(qiáng)的自交系7份，分別為5、8、35、41、42、78、81號自交系，幼苗相對存活率分別為50.00%、50.00%、50.00%、45.45%、41.18%、46.15%、41.6%。此3類玉米自交系共14個，耐低溫能力較強(qiáng)，占供試自交系的15.38%；其他自交系幼苗相對存活率均低于50%，且91份材料中有45份自交系幼苗相對存活率為0，占49.45%，為不耐低溫的自交系。

圖1 低溫脅迫下玉米自交系幼苗的相對存活率

耐低溫等級相對存活率/%材料數(shù)/份自交系編號極強(qiáng)100～80111強(qiáng)79～60612、16、33、34、36、83中強(qiáng)59～4075、8、35、41、42、78、81 弱39～1322、3、4、6、7、9、10、13、18、20、21、22、24、25、26、29、30、32、44、47、48、50、52、53、56、57、60、66、68、70、80、89不耐0451、14、15、17、19、23、27、28、31、37、38、39、40、43、45、46、49、51、54、55、58、59、61、62、63、64、65、67、69、71、72、73、74、75、76、77、79、82、84、85、86、87、88、90、91

根據(jù)表1中的耐低溫等級分類結(jié)果，選擇6份耐低溫等級不同的玉米自交系，分別為11、33、35、6、1、46號自交系，經(jīng)7 ℃低溫脅迫后，比較幼苗葉片的生理特性差異。

2.2 不同耐低溫等級玉米自交系的生理特性及其耐低溫綜合評價

2.2.1 可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量 由圖2可見，低溫脅迫下6份玉米自交系幼苗葉片的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量均有不同程度的增加，46、1、35、6、33、11號自交系的可溶性糖含量分別為對照的1.29、1.09、1.41、1.27、1.52、1.45倍，且以11號自交系的可溶性糖含量最多；可溶性蛋白含量分別為對照的1.17、1.28、1.41、1.24、1.51、1.47倍，且以33號自交系可溶性蛋白含量最多；脯氨酸含量分別為對照的1.11、1.29、1.35、1.30、1.43、1.51倍，脯氨酸積累量最多的為11號自交系?？梢姡蜏孛{迫促進(jìn)玉米自交系可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的積累，但不同耐低溫等級玉米自交系的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸積累程度不同，耐低溫能力強(qiáng)的自交系3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增幅加大。

不同小寫字母表示同一處理下不同自交系在0.05水平上差異顯著，下同

2.2.2 MDA含量和相對電導(dǎo)率 MDA含量和相對電導(dǎo)率的變化反映低溫對膜引起的膜脂過氧化作用。由圖3可見，低溫脅迫下，46、1、35、6、33、11號玉米自交系幼苗葉片的相對電導(dǎo)率分別為對照的1.19、1.29、1.10、1.12、1.11、1.10倍，MDA含量分別為對照的1.37、1.45、1.32、1.24、1.21、1.23倍，其中，以11號玉米自交系的相對電導(dǎo)率和MDA含量最低。從MDA含量和相對電導(dǎo)率的變化分析，耐低溫能力強(qiáng)的玉米自交系葉片細(xì)胞膜的損傷比較小，而耐低溫能力差的自交系葉片細(xì)胞膜損傷比較大。

圖3 低溫脅迫下玉米自交系幼苗的MDA含量和相對電導(dǎo)率

2.2.3 POD、CAT、SOD活性 由圖4可見，低溫脅迫提高了46、1、35、6、33、11號玉米自交系的3種抗氧化酶活性，POD活性分別為對照的1.29、1.28、1.56、1.38、1.79、1.64倍，CAT活性分別為對照的1.31、1.59、1.67、1.52、2.13、1.79倍，SOD活性分別為對照的1.15、1.11、1.24、1.43、1.45、1.96倍，且POD、CAT、SOD活性均以11號自交系最高。不同耐低溫等級自交系通過促進(jìn)這3種抗氧化酶活性的增加，來抵御低溫對幼苗的傷害，耐低溫能力強(qiáng)的自交系3種抗氧化酶活性均較高。

圖4 低溫脅迫下玉米自交系幼苗的POD、CAT、SOD活性

2.2.4 耐低溫綜合評價 對上述8項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行抗寒系數(shù)和隸屬值的計(jì)算，避免單個指標(biāo)出現(xiàn)的偶然性。根據(jù)抗寒系數(shù)(表3)計(jì)算各指標(biāo)的隸屬值(表4)。分析排序后的綜合評價值，綜合隸屬值越大，其耐低溫能力越強(qiáng)。6份玉米自交系耐低溫能力強(qiáng)弱為：11>33>35>6>46>1。

表3 6份玉米自交系幼苗8項(xiàng)生理指標(biāo)的抗寒系數(shù)

表4 6份玉米自交系幼苗8項(xiàng)生理指標(biāo)的隸屬值

2.3 低溫脅迫對玉米自交系葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

葉綠體是光合作用的場所，其內(nèi)基粒整齊垛疊在一起，膜面積越大，光合能力越強(qiáng)。低溫等逆境脅迫對玉米自交系細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)具有一定的影響。逆境脅迫下，葉綠體結(jié)構(gòu)受損，基粒溶解，基粒片層結(jié)構(gòu)解體，細(xì)胞膜受損，造成光合作用受阻，細(xì)胞膜受損，細(xì)胞代謝紊亂，從而影響作物的正常生長。由于受自交系幼苗低溫脅迫功能葉片和種子數(shù)量的限制，選擇耐低溫能力強(qiáng)(33號)和弱(46號)自交系，觀測葉片超微結(jié)構(gòu)(圖5)，對照玉米自交系葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為規(guī)則，葉綠體外膜清晰，內(nèi)部基粒片層排列整齊，葉綠體內(nèi)含有大量淀粉粒，部分葉綠體互相靠近，聯(lián)合在一起。線粒體均勻分布在細(xì)胞邊緣，呈橢圓形，雙層膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部嵴較豐富；低溫脅迫處理的玉米自交系葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)均發(fā)生不同程度的改變，主要體現(xiàn)在相鄰細(xì)胞間隙變大，葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，淀粉粒數(shù)量增加，出現(xiàn)巨型淀粉粒、類囊體膜膨脹疏松、基粒消失、葉肉細(xì)胞整體變大等現(xiàn)象。耐低溫能力強(qiáng)的玉米自交系葉片結(jié)構(gòu)變化較小，但也出現(xiàn)輕微的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，葉綠體結(jié)構(gòu)比較完整，葉綠體外膜清晰，內(nèi)部基質(zhì)片層排列整齊并含有大量淀粉粒。耐低溫能力弱的玉米自交系葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化較大，細(xì)胞嚴(yán)重變形，質(zhì)壁分離嚴(yán)重，葉綠體膜遭到破壞，局部破裂，基質(zhì)外滲，葉綠體中淀粉粒大量增加，內(nèi)部基質(zhì)片層排列混亂，基質(zhì)空間增大，基粒類囊體膨脹，發(fā)生扭曲等現(xiàn)象。

A和E分別為46號自交系低溫處理和對照的葉片細(xì)胞(2 500×)，B和F分別為46號自交系低溫處理和對照的葉片細(xì)胞間隙(5 000×)，K和P分別為46號自交系低溫處理和對照的葉綠體結(jié)構(gòu)(10 000×)，L和Q分別為46號自交系低溫處理和對照的葉綠體結(jié)構(gòu)(20 000×)；C和G分別為33號自交系低溫處理和對照的葉片細(xì)胞(2 500×)，D和H分別為33號自交系低溫處理和對照的葉片細(xì)胞間隙(5 000×)，M和R分別為33號自交系低溫處理和對照的葉綠體結(jié)構(gòu)(10 000×)，N和S分別為33號自交系低溫處理和對照的葉綠體結(jié)構(gòu)(20 000×)；CW.細(xì)胞壁； Chl.葉綠體； GL.基粒片層； SL.基質(zhì)片層； OG.嗜鋨顆粒； SG.淀粉粒； CM.葉綠體膜； Cr.嵴

3 結(jié)論與討論

3.1 低溫對玉米葉片滲透調(diào)節(jié)、膜透性和抗氧化能力的影響

植物在逆境環(huán)境下通過主動積累各種有機(jī)物來提高細(xì)胞液濃度，降低細(xì)胞滲透勢，提高細(xì)胞保水力，以適應(yīng)逆境脅迫的影響[14-16]。細(xì)胞內(nèi)合成的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等多種有機(jī)物質(zhì)是植物體內(nèi)最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。相關(guān)研究表明，低溫脅迫下，植物體內(nèi)的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量增加[17]，從而增強(qiáng)植物的抗逆境能力。本研究結(jié)果顯示，抗性強(qiáng)的玉米自交系較抗性差的自交系積累更多的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白，從而增強(qiáng)耐低溫能力。在所選擇的6份耐低溫能力不同的玉米自交系中，耐性強(qiáng)的自交系農(nóng)M6和WM40-2在低溫脅迫下這3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累更多。

植物在受到逆境脅迫時，膜透性發(fā)生改變，MDA含量和相對電導(dǎo)率增加[18-19]。因此，MDA含量和相對電導(dǎo)率的高低與細(xì)胞膜的傷害程度呈正相關(guān)。低溫能改變玉米幼苗葉片細(xì)胞的通透性，其變化大小受外界低溫強(qiáng)度和作用時間長短以及不同品種耐低溫能力不同影響。溫度越低，細(xì)胞膜損傷越嚴(yán)重，細(xì)胞膜透性越大。本研究中，低溫條件下，耐低溫能力強(qiáng)的玉米自交系農(nóng)M6和WM40-2滲透率較低，質(zhì)膜相對穩(wěn)定。

植物的低溫脅迫抗性與活性氧清除能力密切相關(guān)[20]，植物抗氧化酶活性大幅度增加可緩解活性氧帶來的傷害，提高植物抗逆性。玉米幼苗在低溫脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生改變，不同自交系耐低溫能力不同的部分原因是其抗氧化酶系統(tǒng)的差異，因此，低溫脅迫下SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性的變化可作為篩選玉米耐低溫自交系的重要指標(biāo)，本研究中，耐低溫能力強(qiáng)的玉米自交系這3種酶活性均較高。

為減少材料遺傳背景不同引起的誤差，真實(shí)地反映材料的耐低溫特性，通常采用多個性狀低溫下與常溫下的相對值作為評價指標(biāo)，避免應(yīng)用單一指標(biāo)評價材料的耐低溫能力。試驗(yàn)選擇6份不同耐低溫等級的玉米自交系幼苗，通過分析可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、MDA含量，相對電導(dǎo)率，POD、CAT、SOD活性8項(xiàng)生理生化指標(biāo)的隸屬值，得出6份玉米自交系的耐低溫能力強(qiáng)弱為農(nóng)M6>A15>A46>C3-3>南引37>澤玉119-1，與玉米幼苗相對存活率的耐低溫評價等級一致。

3.2 低溫對玉米葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

逆境對植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的影響[21]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫對玉米自交系葉片超微結(jié)構(gòu)的影響主要體現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和葉綠體結(jié)構(gòu)上，表現(xiàn)為葉綠體緊貼細(xì)胞壁分布，細(xì)胞間出現(xiàn)了輕微質(zhì)壁分離，葉綠體內(nèi)基粒雜亂無章，內(nèi)部其他片層的形成使類囊體片層發(fā)育受到阻礙，基粒垛疊不緊，內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時生成了大量淀粉粒，這與王雪英等[22]的研究結(jié)果相似。低溫脅迫導(dǎo)致葉片細(xì)胞葉綠體內(nèi)含出現(xiàn)大量淀粉粒，是因?yàn)榈蜏赜绊懥斯夂袭a(chǎn)物淀粉粒的運(yùn)輸，光合速率降低；同時，低溫脅迫下嗜鋨顆粒明顯多于對照，可以保持質(zhì)膜穩(wěn)定，影響植物抗逆性。低溫不僅增加淀粉粒數(shù)目，而且使淀粉粒變圓膨脹，當(dāng)?shù)矸哿ｓw積增大到一定程度時，對類囊體造成損傷，最終葉綠體膜脹破，葉綠體解體，葉片失去光合作用的能力，從而影響植株的正常生長，這與周勇輝等[23]和Li等[24]的研究結(jié)果相似。

綜上，低溫脅迫下，根據(jù)玉米相對幼苗存活率篩選所得耐低溫能力強(qiáng)的自交系為農(nóng)M6、WM40-2、C11-3、A15、A44、吉846/KL4-5、03-391。該類自交系在低溫下可積累較多的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸， 且POD、CAT、SOD活性提高，以降低對膜的傷害；同時其葉片超微結(jié)構(gòu)上變化較小。因此，生產(chǎn)上可以選擇耐低溫能力強(qiáng)的玉米自交系進(jìn)行配合，以提高玉米的耐低溫能力。