常 靜，張曉剛，金玉芬，吳麗霞，于 庭*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130041;2.北京英諾特生物技術(shù)有限公司；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院)

柯薩奇病毒B組(CoxB)是單股正鏈小RNA病毒，是呼吸道感染的主要病原體之一。根據(jù)血清型，該B組病毒可分為B1、B2、B3、B4、B5、B6六種類型，主要侵犯免疫力底下的圍生兒，可引起腦膜炎，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等多種疾病，亦是引起病毒性心肌炎的主要病原體之一，占病毒性心肌炎誘因的20%-25%，病情嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。CoxB傳染源為病人及隱性感染者，可經(jīng)口、呼吸道、腸道傳播或胎兒宮內(nèi)傳染。多流行于夏、秋季節(jié)，一般呈散發(fā)或地區(qū)性暴發(fā)流行[1,2]。目前常規(guī)檢測(cè)手段是病毒分離、血清抗體檢測(cè)、核酸檢測(cè)，而間接免疫熒光法被認(rèn)為是除病毒分離法以外的金標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明，在CoxB感染的早期，人體內(nèi)產(chǎn)生的IgM抗體可持續(xù)存在數(shù)周。故此特異性抗體的出現(xiàn)可以作為CoxB的急性期或持續(xù)期感染診斷的重要指標(biāo)之一[3]?？乖难兄茖?duì)應(yīng)用間接免疫熒光法檢測(cè)CoxB-IgM的特異性和靈敏性尤為重要，為了臨床能夠更加方便，高效的診斷CoxB感染，本文運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，制備并優(yōu)化CoxB抗原片，結(jié)合間接免疫熒光法對(duì)臨床樣本的CoxB-IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其性能和應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1菌種

來(lái)源于北華大學(xué)生命科學(xué)研究中心提供的柯薩奇病毒B組分離株。

1.2細(xì)胞

北京協(xié)和醫(yī)院提供的人源Hep-2細(xì)胞。

1.3血清

(1)沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院2016年9月-2017年7月收治的CoxB感染患者的血清。其中陽(yáng)性血清43例，陰性血清555例。

(2)VIRION(U.S.),INC.(簡(jiǎn)稱“VIRION”)的柯薩奇病毒IgG試劑盒(ELISA法)，在間隔2周后檢測(cè)的IgG抗體水平呈4倍升高的血清樣本，確認(rèn)為急性感染樣本，共30例。

(3)應(yīng)用北京貝爾生物工程有限公司(簡(jiǎn)稱“北京貝爾”)的柯薩奇B組病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，按照試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)30例急性感染樣本，選擇應(yīng)用于本試驗(yàn)的內(nèi)控陽(yáng)性血清1、2。陽(yáng)性血清1：S/CO值為5.5，陽(yáng)性血清2：S/CO值為1.2。再用該試劑盒檢測(cè)健康人的血清，選擇應(yīng)用于本試驗(yàn)的內(nèi)控陰性血清1、2。陰性血清1：S/CO值為0.08，陰性血清2：S/CO值為0.04。

(4)交叉反應(yīng)血清：30份肺炎支原體(MP)陽(yáng)性血清(CoxB陰性)，30份肺炎衣原體(CP)陽(yáng)性血清(CoxB陰性)，均來(lái)自于沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院。

1.4儀器與試劑

Qiagen公司的病毒RNA提取試劑盒。北京貝爾的柯薩奇B組病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)。VIRION的柯薩奇病毒IgG試劑盒(ELISA法)。

1.5抗原片的制備

1.5.1毒株鑒定 取病毒培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞上清210 μl于1.5 ml無(wú)菌管中，按照Qiagen公司的病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取基因組，并加入1 μl(40U)RNA酶抑制劑RNasin，混勻后于-70℃保存?zhèn)溆?。作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。

在NCBI上搜索該病毒序列，根據(jù)Sequence ID:gbAF160095.1序列選擇保守區(qū)(301-480)設(shè)計(jì)兩條引物：(F：ACAGAACCAGTTAAGGATG；R：TAAGGTAGTCGGGCCACACACC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選用上游引物F，在全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行單向測(cè)序，得到的結(jié)果與基因庫(kù)比對(duì)，鑒定毒株。

1.5.2抗原片的制備 將經(jīng)鑒定的毒株用含有2%胎牛血清的DMEM(細(xì)胞維持液)將病毒稀釋到10-3。在生長(zhǎng)良好的Hep-2單層細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)接種適量CoxB[4]。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)一定程度時(shí)，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液后,滴加1 ml在蓋玻片上，37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，用0.01M PBS浸洗一次，晾干，用無(wú)水乙醇-20℃過夜固定。風(fēng)干后即為制備好的CoxB抗原片。

1.6抗原片制備條件的優(yōu)化

1.6.1感染細(xì)胞病變程度的選擇 CoxB接種到Hep-2細(xì)胞單層后，觀察細(xì)胞病變的程度，分別選擇細(xì)胞病變15%、25%、35%時(shí)，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，分別滴到蓋玻片上，每張蓋玻片滴加1 ml，制成抗原片，并與吸附劑，稀釋液及熒光素標(biāo)記的二抗組成檢測(cè)試劑，利用在不同細(xì)胞病變程度下研制的試劑分別對(duì)陽(yáng)性血清1、2，陰性血清1、2進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.2CoxB細(xì)胞含量的選擇 當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)一定程度時(shí)，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分別取濃度為105、106、107/ml的細(xì)胞懸液1 ml制備抗原片，利用抗原片制備成檢測(cè)試劑，并分別對(duì)陽(yáng)性血清1、2，陰性血清1、2進(jìn)行檢測(cè)[5,6]。

1.7間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)

選擇上述抗原片制備的最佳條件制備抗原片，與吸附劑，稀釋液及熒光素標(biāo)記的二抗組成檢測(cè)試劑，對(duì)收集的樣本進(jìn)行檢測(cè)。

將25 μl血清與等體積吸附劑混合后，1 000 rpm離心10 min。取吸附后血清樣本40 μl加入到160 μl樣本稀釋液中，混勻，取15 μl血清進(jìn)行檢測(cè)。第二抗體使用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人IgM抗體，樣本在經(jīng)過熒光染色后，置于熒光顯微鏡下觀察。陽(yáng)性結(jié)果顯示CoxB細(xì)胞的細(xì)胞核、胞漿或胞膜出現(xiàn)綠色熒光，陰性結(jié)果顯示CoxB的細(xì)胞呈紅色。

1.8臨床樣本的檢測(cè)

1.8.1對(duì)比試驗(yàn) 利用研制的試劑，與北京貝爾的柯薩奇B組病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)同時(shí)對(duì)收集的598例血清進(jìn)行檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書執(zhí)行。將兩種方法檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，用SPSS17.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8.2急性感染試驗(yàn) 利用研制的試劑對(duì)30例急性感染樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.3交叉反應(yīng)試驗(yàn) 利用研制的試劑對(duì)30份MP-IgM陽(yáng)性血清，30份CP-IgM陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1毒株鑒定結(jié)果

圖1是以上游引物F：ACAGAACCAGTTAAGGATG為測(cè)序引物，進(jìn)行單向測(cè)序后，用NCBI-Blast進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果。因單向擴(kuò)增自身的特點(diǎn)，擴(kuò)增之初的序列不穩(wěn)定，故選取稍后位置堿基序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示score為219 hits，identities值為118/118(100%)，gaps為0/118(0%),表明該毒株為柯薩奇病毒B組。

圖1 單項(xiàng)擴(kuò)增序列比對(duì)結(jié)果

2.2抗原片制備條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1細(xì)胞病變的選擇結(jié)果 結(jié)果顯示當(dāng)細(xì)胞感染25%時(shí)消化細(xì)胞滴制備的檢測(cè)試劑，內(nèi)控血清的陽(yáng)性和陰性結(jié)果的較好。見表1。

表1 CoxB感染細(xì)胞病變程度的選擇

注：++：陽(yáng)性；+：弱陽(yáng)性；-:陰性。

2.2.2CoxB細(xì)胞含量的選擇結(jié)果 見表2。試驗(yàn)中選擇了3個(gè)細(xì)胞濃度105/ml、106/ml、107/ml，結(jié)果顯示在一個(gè)蓋玻片上滴加病變細(xì)胞1 ml時(shí)，病變細(xì)胞濃度為106/ml密度的檢測(cè)結(jié)果較好(圖2)。

表2 CoxB抗原片細(xì)胞含量的選擇

注：++：陽(yáng)性；+：弱陽(yáng)性；-:陰性。

圖2 CoxB細(xì)胞含量的選擇結(jié)果

2.3臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

2.3.1對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)對(duì)臨床598例樣本檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種方法共同檢出陽(yáng)性42例，陰性552例。有3例北京貝爾的試劑盒檢測(cè)呈陰性，新研制的試劑檢測(cè)呈陽(yáng)性。1例北京貝爾的試劑盒檢測(cè)呈陽(yáng)性，新研制的試劑檢測(cè)呈陰性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算，兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性符合率為97.67%，陰性符合率為99.46%，總體符合率99.33%，Kappa值為0.951。說(shuō)明新研制的試劑與已上市試劑盒檢測(cè)具有較高的一致性。見表3。

2.3.2急性感染試驗(yàn)結(jié)果 30例急性感染樣本中，利用研制的試劑檢測(cè)有28例呈IgM抗體陽(yáng)性。說(shuō)明新研制試劑盒具有較高的敏感性和特異性。見表4。

表3 598例臨床樣本的CoxB-IgM總體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

注：計(jì)算方法：陽(yáng)性符合率=A/(A+C)×100%；陰性符合率=D/(B+D)×100%；總符合率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%。

表4 30例CoxB急性感染試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3.3交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果 利用新研制的試劑分別對(duì)30例MP-IgM陽(yáng)性血清， 30例CP-IgM陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)， 結(jié)果顯示CoxB-IgM均呈陰性。說(shuō)明新研制的試劑不受其他病原體干擾，具有較好的特異性。見表5。

表5 30例MP-IgM陽(yáng)性血清，CP-IgM陽(yáng)性血清交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

柯薩奇病毒B組是呼吸道感染的常見病原體之一，病毒根據(jù)血清型可分為B1、B2、B3、B4、B5、B6，共6種類型?？梢鸩煌膊“X炎，肺炎病毒性心肌炎等。故臨床早期快速診斷對(duì)CoxB感染的預(yù)防和治療十分重要。

目前常規(guī)用于CoxB檢測(cè)的手段包括病毒分離、血清檢查、PCR檢測(cè)等。病毒分離是最傳統(tǒng)的診斷方法，被認(rèn)為是病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、陽(yáng)性率低，所以不適用于臨床檢測(cè)。PCR技術(shù)幾年來(lái)被應(yīng)用于CoxB感染的檢測(cè)，其具有較高的特異性和準(zhǔn)確性，但因其對(duì)設(shè)備和試劑的特殊需求使其醫(yī)療成本較高，不適合大范圍推廣使用[7]。

血清學(xué)常用方法是ELISA法和膠體金法，由于方法多選用基因工程抗原，其檢測(cè)敏感性和特異性較差，而我們利用的是CoxB組病毒在細(xì)胞內(nèi)分泌出的特異性抗原，有效的提高了檢測(cè)的敏感性和特異性，是臨床公認(rèn)的除了分離培養(yǎng)以外的金標(biāo)準(zhǔn)。

抗原片的制備是應(yīng)用間接免疫熒光法研制CoxB-IgM抗體檢測(cè)試劑的關(guān)鍵步驟，若抗原片制備過程中出現(xiàn)細(xì)胞脫落，細(xì)胞病變程度不夠等情況，都會(huì)影響抗體檢測(cè)的特異性和靈敏性。本實(shí)驗(yàn)室研制CoxB抗原片時(shí)，經(jīng)制備條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后，選細(xì)胞病變程度25%時(shí)制成細(xì)胞懸液，并取106/ml的細(xì)胞含量制作滴片為制備條件。經(jīng)對(duì)臨床598例樣本檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算，Kappa值高達(dá)0.951，說(shuō)明新研制的試劑與已上市試劑檢測(cè)具有較高的一致性；CoxB在30例MP陽(yáng)性血清,CP陽(yáng)性血清檢測(cè)中均呈陰性，說(shuō)明新研制的試劑具有較好的特異性；30例急性感染樣本中28例被檢測(cè)出CoxB-IgM呈陽(yáng)性，說(shuō)明該試劑對(duì)CoxB-IgM抗體檢測(cè)具有較好的靈敏性和特異性。在上述試驗(yàn)中，對(duì)比試驗(yàn)中與上市試劑盒檢測(cè)不相符的幾例樣本目前考慮為是因兩種不同檢測(cè)方法的區(qū)別而產(chǎn)生的差異，之后可經(jīng)過第三方試劑進(jìn)行驗(yàn)證。急性感染試驗(yàn)中，有2例未檢出IgM陽(yáng)性的原因可能是IgM抗體含量已經(jīng)在機(jī)體內(nèi)下降，轉(zhuǎn)化，不易檢出。亦或是該幾位患者為柯薩奇B組病毒其他血清型感染。

上述結(jié)果證明本實(shí)驗(yàn)室研制的抗原片，可根據(jù)間接免疫熒光法的原理,與吸附劑，稀釋液和FITC標(biāo)記的鼠抗人IgM抗體組合成檢測(cè)試劑，對(duì)CoxB感染患者的血清進(jìn)行定性檢測(cè)。其檢出效率與上市試劑相當(dāng)，且試劑的醫(yī)療成本低，操作方便，適合用于臨床初級(jí)診斷，能夠?yàn)镃oxB感染的早期診斷和治療提供可靠的依據(jù)。未來(lái)可考慮根據(jù)此方法制作其他呼吸道病原體抗原片，并進(jìn)一步研究和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)對(duì)呼吸道感染的早期診斷及篩查。