張慧慧，王 佩，何茂旭，裴 越，付 莉*

(1.臨沂市婦女兒童醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 臨沂276000；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科,吉林 長(zhǎng)春130041)

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率居第三位，死亡率居首位，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制一直是臨床研究探索的重點(diǎn)。Nur77屬于孤兒受體超家族，該家族有3 個(gè)成員：Nur77、Nurr1和 Nor-1。研究發(fā)現(xiàn)，Nur77對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)是把雙刃劍，既能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，又能導(dǎo)致其凋亡。而其在決定細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出不同的作用主要依賴于其在線粒體或細(xì)胞核的不同定位。Nur77廣泛表達(dá)于各種組織，在肺癌、胃癌、結(jié)腸癌和橫紋肌肉瘤等腫瘤中常過(guò)度表達(dá)[1-3]，但在卵巢癌中Nur77是否過(guò)度表達(dá)，以及Nur77在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用還是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，目前尚無(wú)定論。本研究利用免疫組化法檢測(cè)Nur77在卵巢癌組織中的表達(dá)，分析卵巢癌組織中Nur77的表達(dá)與患者的臨床手術(shù)分期及術(shù)后3年生存率之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料

本實(shí)驗(yàn)所有卵巢組織標(biāo)本均選自吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科2012年至2013年住院患者的手術(shù)標(biāo)本存檔蠟塊，共60例。所有組織切片標(biāo)本均已由同一病理科醫(yī)生重新閱片確認(rèn)。本研究分為4組，卵巢癌組：卵巢上皮性癌組織30例，其中漿液性囊腺癌21例，黏液性囊腺癌9例；交界性卵巢腫瘤組：交界性卵巢上皮性腫瘤10 例；良性卵巢腫瘤組：良性卵巢上皮性腫瘤10例；正常卵巢組：正常卵巢組織10例。卵巢癌組病理分級(jí)：高分化5例，中分化6例，低分化15例，未分化4例；卵巢癌組手術(shù)—病理分期(按FIGO 2013標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ期11例，Ⅱ期5例，Ⅲ期11例，Ⅳ期3例；其中盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例。

1.2主要試劑

兔抗人多克隆抗體購(gòu)自abcam 生物技術(shù)有限公司，免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中衫金橋公司。

1.3方法

采用免疫組化法檢測(cè)孤兒核受體Nur77在卵巢癌組織中的表達(dá)及定位。每批切片均設(shè)陰性對(duì)照，陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。蘇木素復(fù)染。Nur77抗原修復(fù)采用檸檬酸緩沖液煮沸冷卻法。兔抗人Nur77抗體工作濃度為1∶120。染色方法按免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4圖像采集分析方法

數(shù)碼顯微鏡捕捉免疫組化圖片(jpg格式)。利用IPP6.0軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞：陽(yáng)性細(xì)胞百分比記分按視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)的比例記分，≤5%、5%-25%、26%-50%、51%-75%、>75%分別記分為0、1、2、3、4分。著色強(qiáng)度記分：按陽(yáng)性細(xì)胞著色(顏色)無(wú)、弱(淡黃)、中(棕黃)、強(qiáng)(棕褐)分別記分為 0、1、2、3 分。 結(jié)果判定：本實(shí)驗(yàn)中每張切片隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野均進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分與著色強(qiáng)度記分，上述兩種記分結(jié)果相加，0-1分為陰性(-)；2-3分為弱陽(yáng)性(+)；4-5分為陽(yáng)性(++)；6-7分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用 SPSS 19.0 軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)和Fisher 確切概率檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。若P>0.05，則表明不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；若P<0.05，則表明存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1四組卵巢組織中Nur77的表達(dá)情況

本實(shí)驗(yàn)研究表明Nur77表達(dá)主要定位于細(xì)胞核中，少量表達(dá)于細(xì)胞漿中，呈均勻的棕黃色、棕褐色顆粒狀或片狀分布。且Nur77主要表達(dá)在卵巢癌組及交界性卵巢腫瘤組中，在良性卵巢腫瘤組和正常卵巢組中，多數(shù)呈陰性表達(dá)，或者微弱的表達(dá)。Nur77在卵巢癌組的陽(yáng)性表達(dá)率為70.00%，明顯高于其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，交界性卵巢腫瘤組的陽(yáng)性表達(dá)率雖然高于良性卵巢腫瘤組及正常卵巢組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1) 。

表1 各組卵巢組織中Nur77表達(dá)的比較

* P1、P2、P3為卵巢癌組與交界性卵巢腫瘤組、良性卵巢腫瘤組和正常卵巢組進(jìn)行比較，P<0.05。

2.2Nur77的表達(dá)與卵巢癌臨床病理參數(shù)分期的關(guān)系

在卵巢癌組中，Ⅰ-Ⅱ期及Ⅲ-Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為50.00%、92.86%，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明Nur77的陽(yáng)性率隨著臨床分期增加而增加(見(jiàn)表2)。

表2 Nur77陽(yáng)性表達(dá)率與卵巢上皮性癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3Nur77的表達(dá)強(qiáng)度與患者術(shù)后3年復(fù)發(fā)死亡率的關(guān)系

在卵巢癌組中，Nur77陽(yáng)性的患者術(shù)后3年復(fù)發(fā)死亡率為80.95%，明顯高于Nur77陰性的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但患者術(shù)后3年的復(fù)發(fā)死亡率與Nur77的表達(dá)強(qiáng)度之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 Nur77的表達(dá)強(qiáng)度與患者術(shù)后3年復(fù)發(fā)死亡率的關(guān)系

*P1為卵巢癌組織中Nur77表達(dá)陰性與陽(yáng)性的患者術(shù)后3年復(fù)發(fā)死亡率的比較 P2為卵巢癌組織中Nur77陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度間的患者術(shù)后3年復(fù)發(fā)死亡率的比較

3 討論

Nur77定位于12q13染色體上，基因全長(zhǎng)為2699bp，由NR4A1編碼，Nur77與Nurr1及Nor-1組成孤兒核受體亞家族。這些核受體家族成員是具有高度同源性的核轉(zhuǎn)錄因子，與核受體超家族成員具有共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。在癌組織或腫瘤細(xì)胞中 Nur77受到異常激活，往往呈現(xiàn)高水平的表達(dá)、亞細(xì)胞定位發(fā)生改變、以及復(fù)雜的翻譯后修飾等表征[4]。當(dāng)Nur77定位于細(xì)胞核時(shí)，作為核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)細(xì)胞的增殖過(guò)程；而當(dāng)細(xì)胞受到凋亡因子刺激時(shí)，Nur77從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至線粒體，與Bc1-2相互作用，引起細(xì)胞色素C的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Nur77的高水平表達(dá)是許多腫瘤賴以存活、增殖、惡性轉(zhuǎn)化的前提條件[5]。Lee等[6]研究證實(shí)，約80%的胰腺癌組織中Nur77高表達(dá)，而正常的胰腺組織中僅有20%表達(dá)Nur77。并且當(dāng)內(nèi)源Nur77被敲除后，胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)被抑制，細(xì)胞內(nèi)的生存因子也會(huì)下調(diào)。Kollurid等[7]的研究證實(shí)，在肺癌細(xì)胞系H460和Calu-6中，Nur77能夠在表皮生長(zhǎng)因子、血清等促有絲分裂刺激物作用下強(qiáng)烈地表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源Nur77質(zhì)粒時(shí)，細(xì)胞周期進(jìn)程會(huì)加速，同時(shí)S/G 2期的細(xì)胞數(shù)目也會(huì)增加，而抑制內(nèi)源Nur77表達(dá)水平時(shí)則明顯抑制H460細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，Nur77還具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞內(nèi)Nur77呈現(xiàn)高水平表達(dá)。同時(shí)，在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中，當(dāng)Nur77結(jié)合到基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9，MMP9)啟動(dòng)子上，激活MMP9轉(zhuǎn)錄，會(huì)加速癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。To等[9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Nur 77在低氧環(huán)境下誘導(dǎo)表達(dá)水平增強(qiáng)時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲及表層上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程也會(huì)同時(shí)增強(qiáng)。由此我們推測(cè)，孤兒核受體Nur77有可能與卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：Nur77在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)明顯高于交界性卵巢上皮性腫瘤、良性卵巢上皮性腫瘤及正常卵巢組織，而且，卵巢上皮性癌中，Nur77表達(dá)水平隨著臨床病理分期的增加而增加。但Nur77的陽(yáng)性表達(dá)率與卵巢癌組織的病理分型、分化程度以及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。此外，隨訪發(fā)現(xiàn)Nur77陽(yáng)性的患者術(shù)后3年的復(fù)發(fā)死亡率明顯增加。提示Nur77可能與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

Nur77在卵巢腫瘤方面的研究尚處于起步階段，本文對(duì)于Nur77與卵巢腫瘤的關(guān)系僅僅只是初步探討，研究結(jié)果提示孤兒核受體Nur77很可能是促進(jìn)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因子。今后，我們還要進(jìn)一步深入研究，探討Nur77促進(jìn)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。