趙 斌，吉志武，楊 帆，趙興旺，倪 健，于海濤,2*

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肛腸科,黑龍江 佳木斯154002；2.佳木斯大學(xué)大腸癌研究所,黑龍江 佳木斯154002)

結(jié)直腸癌屬于臨床上較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率，且發(fā)病早期具有較強(qiáng)的隱匿性，預(yù)后不良[1]。其中早期結(jié)直腸癌患者的5年生存率可達(dá)90%，而晚期與發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者5年生存率在15%以下[2]。因此，尋找一種有效的方式對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行早期診斷顯得尤為重要。其中富含亮氨酸重復(fù)單位的G蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr5)屬于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶基因之一，亦是結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞的一種分子標(biāo)志物，在結(jié)直腸癌中存在顯著表達(dá)[3]。而巨噬細(xì)胞游走抑制因子(MIF)屬于多生物功能細(xì)胞因子之一，在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。迄今為止，臨床上關(guān)于Lgr5和MIF在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)研究報(bào)道并不多見。本文通過研究Lgr5和MIF在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)及其臨床意義并進(jìn)行分析，旨在為臨床結(jié)直腸癌患者的診斷、治療提供新的靶點(diǎn)和思路，現(xiàn)作如下報(bào)道。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2015年9月至2017年9月我院收治的結(jié)直腸癌患者52例。其中男性患者30例，女性患者22例，年齡<60歲28例，≥60歲24例；臨床分期:Ⅰ-Ⅱ期31例，Ⅲ-Ⅳ期21例；分化程度：低分化19例，中高分化33例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例；腫瘤大?。骸? cm 15例，>3 cm 37例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均經(jīng)病理組織檢查確診為結(jié)直腸癌；(2)均符合2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)[5]制定的結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)入院前未接受任何抗腫瘤治療；(4)具有完整的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤或風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病者；(2)接受免疫抑制劑治療者。52例患者均簽署了知情同意書，我院倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)。

1.2研究方法均由手術(shù)常規(guī)留取標(biāo)本，經(jīng)由退水、石蠟包埋后制成組織切片。采用Evision免疫組織化學(xué)染色法對(duì)比結(jié)直腸癌組織以及癌旁組織中的Lgr5和MIF蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。其中Evision免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)試劑盒與DAB酶底物顯色試劑盒等一系列相關(guān)試劑均購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；Lgr5和MIF抗體均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。具體操作嚴(yán)格按照Evision免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以已知陽性對(duì)照片為陽性對(duì)照，以PBS替代一抗為陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果評(píng)定Lgr5和MIF蛋白表達(dá)陽性標(biāo)準(zhǔn)如下[6,7]：均著色于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色。采用雙盲法由兩名高年資的病理科醫(yī)生對(duì)切片進(jìn)行觀察分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)免疫組化積分法進(jìn)行評(píng)估：(1)染色強(qiáng)度：0分即為無色；1分即為淺黃色；2分即為棕黃色；3分即為黃褐色。(2)陽性細(xì)胞占比：0分即為陰性；1分即為陽性細(xì)胞數(shù)占比≤10%；2分即為陽性細(xì)胞數(shù)在11%-50%之間；3分即為陽性細(xì)胞數(shù)占比在51%-80%之間；4分即為陽性細(xì)胞數(shù)占比>80%。將染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞占比評(píng)分的乘積作為最后結(jié)果，其中積分0-2分記為陰性；3-4分記為弱陽性；5-6分記為陽性；>6分記為強(qiáng)陽性。

1.4觀察指標(biāo)比較結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中Lgr5和MIF表達(dá)情況，分析結(jié)直腸癌患者臨床病理特征與Lgr5和MIF表達(dá)的關(guān)系。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0軟件進(jìn)行檢測(cè)分析，采用“χ2”檢驗(yàn)，用“[n(%)]”表示計(jì)數(shù)資料。P值<0.05表明兩組數(shù)據(jù)對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中Lgr5和MIF表達(dá)情況對(duì)比

結(jié)直腸癌組織中Lgr5和MIF表達(dá)陽性率分別為65.38%(34/52)、80.77%(42/52)，均明顯高于癌旁組織的34.62%(18/52)、38.46%(20/52)(均P<0.05)。見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中Lgr5和MIF表達(dá)情況對(duì)比(例，%)

注：與癌旁組織相比，*P<0.05

2.2結(jié)直腸癌組織中Lgr5表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系分析

臨床分期為Ⅰ-Ⅱ期、分化程度為中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小為≤3 cm結(jié)直腸癌患者組織中Lgr5陽性率分別為51.61%(16/31)、51.52%(17/33)、54.55%(18/33)、26.67%(4/15)，均明顯低于臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小為>3 cm結(jié)直腸癌患者的85.71%(18/21)、89.47%(17/19)、84.21%(16/19)、81.08%(30/37)(P<0.05)。見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織中Lgr5表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系分析(例，%)

2.3結(jié)直腸癌組織中MIF表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系分析

臨床分期為Ⅰ-Ⅱ期、分化程度為中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小為≤3 cm結(jié)直腸癌患者組織中MIF陽性率分別為70.97%(22/31)、69.70%(23/33)、69.70%(23/33)、53.33%(8/15)，均明顯低于臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小為>3 cm結(jié)直腸癌患者的95.24%(20/21)、100.00%(19/19)、100.00%(19/19)、91.89%(34/37)(均P<0.05)。見表3。

表3 結(jié)直腸癌組織中MIF表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系分析(例，%)

3 討論

結(jié)直腸癌是全球最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于食管癌與胃癌[8-10]。相關(guān)研究報(bào)道顯示[11,12]，隨著我國(guó)人們生活水平的不斷提高以及飲食習(xí)慣的逐漸改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率與病死率均呈逐年上升趨勢(shì)[13,14]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展是一種多基因、多步驟的復(fù)雜過程，因此深入研究結(jié)直腸癌的具體發(fā)病機(jī)制，對(duì)臨床結(jié)直腸癌的早期診斷、指導(dǎo)治療以及預(yù)后評(píng)估均有極其重要的意義。

本文結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌組織中Lgr5和MIF表達(dá)陽性率均明顯高于癌旁組織。這與張書勤等人的研究報(bào)道相一致[15,16]，說明了Lgr5和MIF在結(jié)直腸癌組織中存在明顯高表達(dá)，提示了在結(jié)直腸癌組織的發(fā)生、發(fā)展過程中Lgr5和MIF可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其中Lgr5在胃腸道、乳腺、大腦等多組織中均有表達(dá)，屬于一種7次跨膜蛋白，其在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制可能與其屬于Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路復(fù)合體組成之一有關(guān)，可在膜水平上提高Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)效能。MIF廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，屬于炎癥介質(zhì)之一，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，且隨著近年來相關(guān)研究的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)。此外，臨床分期為Ⅰ-Ⅱ期、分化程度為中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小為≤3 cm結(jié)直腸癌患者組織中Lgr5陽性率，均明顯低于臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小為>3 cm結(jié)直腸癌患者。這表明了Lgr5與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移均存在密切相關(guān)，可作為臨床上判斷結(jié)直腸癌患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。且隨著Lgr5表達(dá)陽性率不斷升高，患者病情不斷加重，轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高[17,18]。分析原因，Lgr5可能是通過增強(qiáng)結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖以及未分化程度。因此，在臨床工作中我們通過對(duì)Lgr5表達(dá)進(jìn)行有效調(diào)控，可能達(dá)到治療結(jié)直腸癌的目的，這為今后的研究提供了方向。另外，臨床分期為Ⅰ-Ⅱ期、分化程度為中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小為≤3 cm結(jié)直腸癌患者組織中MIF陽性率均明顯低于臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小為>3 cm結(jié)直腸癌患者。這提示了MIF參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程，且在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可作為臨床上判斷結(jié)直腸癌患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。且隨著MIF表達(dá)陽性率不斷升高，患者病情不斷加重，轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高[19,20]。究其原因，認(rèn)為MIF可通過上調(diào)前列腺素2與環(huán)氧合酶2以及下調(diào)抑癌基因P53，從而促進(jìn)新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖以及侵襲；與此同時(shí)，MIF可能通過在Ras-Raf-MAPK-ERK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)一步參與到結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中Lgr5和MIF蛋白均呈明顯高表達(dá)，其可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移存在密切相關(guān)，通過對(duì)上述因子的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，可能是臨床上治療結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)，這為我們今后的研究提供了思路。